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【発明の名称】 八重咲き植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用
【発明者】 【氏名】高木 優

【氏名】平津 圭一郎

【氏名】光田 展隆
【要約】 【課題】八重咲き植物体の生産方法を提供する。

【解決手段】雌しべの形成に関与する転写因子をコードするポリヌクレオチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質が、上記転写因子が標的とする遺伝子の発現を抑制し、八重咲き植物体が生産される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌しべの形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、花の形態を八重咲きにすることを特徴とする八重咲き植物体の生産方法。
【請求項２】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項３】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項４】
上記転写因子が、以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）または（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、雌しべの形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項７】
上記機能性ペプチドが、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
（ｅ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｆ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、または４０に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、配列番号３６または３７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の八重咲き植物体の生産方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、八重咲き植物体。
【請求項１４】
上記八重咲き植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１３に記載の八重咲き植物体。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
上記転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする八重咲き植物体生産キット。
【請求項１６】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１５に記載の八重咲き植物体生産キット。
【請求項１７】
雄しべまたは雌しべの形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、植物体を不稔化することを特徴とする不稔性植物体の生産方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、八重咲き植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものであり、特に遺伝子の転写を抑制することによる八重咲き植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、花はがく、花弁、雄しべ、雌しべの４つの器官からなり、花芽分裂組織を４つの同心円状領域、つまり、外側からｗｈｏｒｌ１〜４に分けた場合、ｗｈｏｒｌ１には４つのがく、ｗｈｏｒｌ２には４つの花弁、ｗｈｏｒｌ３には６つの雄しべ、ｗｈｏｒｌ４には２つの心皮が融合した雌しべが作られる。これらの器官の形質は、花のホメオティック遺伝子によって決定されることが知られている（非特許文献１）。花のホメオティック遺伝子は、Ａ、Ｂ、Ｃの３クラスに分類され、転写因子をコードしている。そのため、これらの遺伝子群の組み合わせによって、花芽分裂組織に形成される花器官の種類が決定される。すなわち、クラスＡのみが働くとがくが、クラスＡとＢが協働すると花弁が、クラスＢとＣが協働すると雄しべが、クラスＣのみが働くと雌しべが形成される。したがって、ホメオティック遺伝子の機能が突然変異などで失われると、ある器官が他の器官の形質に転換する。このような変化はホメオティックな変換と呼ばれ、植物ではシロイヌナズナ等で花の器官形質決定に関与するホメオティック遺伝子が明らかになっている（非特許文献１）。
【０００３】
ａｇａｍｏｕｓ遺伝子（以下「ＡＧ遺伝子」と称する）は、上記のクラスＣ遺伝子であり、ＡＧ遺伝子の機能が失われたＡＧ変異体では、クラスＡの機能が花の全領域に及び、雄しべが花弁に変化し、野生型では雌しべとなる領域に新しい花が作られ、花の形態は八重咲きとなることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
これまで、八重咲き植物体の作製を目的として花の形態を変化させる場合は、その目的とする形質を有する植物の品種を掛け合わせる交配育種を行うのが一般的である。
【０００５】
また、近年、特定の遺伝子の働きを抑制する方法として、２本鎖ＲＮＡを細胞の中に入れ、その配列に相同な細胞のｍＲＮＡを分解するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法が広く用いられるようになってきている。
【０００６】
ところで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献２、３参照）。このペプチドは、Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＥＲＦ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【０００７】
さらに、本発明者は、種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することを試みている。そして、これにより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することに成功している。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】酒井一著、「植物の形を決める分子機構」、秀潤社、１５０−１５５頁
【非特許文献２】Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｓｈｉｎｓｈｉ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．１３，１９５９−１９６８，Ａｕｇｕｓｔ，２００１
【非特許文献３】Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５１４（２００２）３５１−３５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の交配育種による方法では、目的とする形質を有する植物を生産するためには、長い年月と、熟練者の経験が必要である。したがって、短期間で簡便、確実に八重咲き植物体を得ることは非常に困難である。
【０００９】
また、上記ＲＮＡｉ法によってＡＧ遺伝子の機能を抑制し、八重咲き植物体を得ることも考えられるが、ＲＮＡｉ法には、遺伝子の発現を抑制する場合にターゲットとする部位の決定が困難であり、試行錯誤が必要であること、コンストラクトの構築が難しいこと、細胞によってはトランスフェクションの効率が低く、ＲＮＡ干渉の効果が限定されること、等の種々の問題点がある。したがって、ＲＮＡｉ法によって八重咲き植物体を短期間で簡便、確実に得ることは非常に困難である。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、雌しべの形成に関与する転写因子を転写抑制因子に転換し、上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制することにより、短期間で簡便、確実に八重咲き植物体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、雌しべの形成に関与する転写因子を転写抑制因子に転換し、上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制することにより、八重咲き植物体を短期間で簡便、確実に生産することができることを初めて明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法は、雌しべの形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、花の形態を八重咲きにすることを特徴としている。
【００１３】
上記構成によれば、上記転写因子を転写抑制因子に転換することができ、植物体内では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。また、上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制するという形質は、ドミナントであるので、上記従来の技術で作製したＡＧ変異体のように、劣勢ホモ個体を単離する必要がない。したがって、短期間で、簡便、確実に八重咲き植物体を生産することができる。
【００１４】
また、上記構成によれば、得られる八重咲き植物体は、種子が形成されない不稔性植物体となる。したがって、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、目的の植物を非常に簡便に不稔性植物体とすることができる。
【００１５】
また、本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることが好ましい。
【００１６】
上記構成によれば、上記機能性ペプチドが付加されたカセットベクターに上記転写因子の遺伝子を組み込み、植物細胞に導入するだけで、上記キメラタンパク質を植物細胞内で発現させることができ、上記キメラタンパク質により転写因子の標的遺伝子の転写を容易に抑制することができる。したがって、短期間に、簡便、確実に八重咲き植物体を生産することができる。
【００１７】
また、本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含むことが好ましい。
【００１８】
また、上記転写因子は、以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１９】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）または（ｄ）記載の遺伝子を用いることが好ましい。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、雌しべの形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２０】
上記構成によれば、上記転写因子は上記機能性ペプチドにより転写抑制因子に転換され、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。したがって、短期間に、簡便、確実に八重咲き植物体を生産することができる。
【００２１】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００２２】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることが好ましい。
【００２３】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｅ）または（ｆ）記載のペプチドであってもよい。（ｅ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｆ）配列番号１８または１９に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【００２４】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２５】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２６】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、または４０に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００２７】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３６または３７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００２８】
上記機能性ペプチドは、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、上記転写因子の標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００２９】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産された八重咲き植物体であることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００３０】
また、本発明にかかる八重咲き植物体の生産キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記八重咲き植物体の生産キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【００３１】
また、本発明に係る不稔性植物体の生産方法は、不稔性植物体の形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、植物体を不稔化することを特徴としている。
【００３２】
上記構成によれば、得られる植物体は、種子が形成されない不稔性植物体となる。したがって、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、非常に簡便に目的の植物を不稔性植物体とすることができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る八重咲き植物体の生産方法は、以上のように、雌しべの形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制することにより、八重咲き植物体を生産するという構成を備えているので、短期間に、簡便、確実に八重咲き植物体を生産することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明に係る八重咲き植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用について詳述する。
（１）八重咲き植物体の生産方法
本発明は、八重咲き植物体を生産する技術であって、雌しべの形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させることにより、八重咲き植物体を生産するものである。
【００３５】
上記キメラタンパク質を生産させる方法では、上記転写因子は、上記機能性ペプチドにより転写抑制因子に転換される。そのため、上記キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、転写因子の標的遺伝子に結合すると、転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、雌しべの形成に関与する遺伝子の機能が失われ、上述したクラスＡの機能が花の全領域に及ぶため、雄しべが花弁に変化し、野生型では雌しべとなる領域に新しい花が作られ、八重咲き植物体が形成される。すなわち、図４（Ａ）に示すように、外側からがく、花弁、花弁の順で花が繰り返し形成される。
【００３６】
また、上記キメラタンパク質が上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制するという形質は、ドミナントである。すなわち、雌しべの形成に関与する正常な遺伝子が存在していても、転写因子の標的遺伝子の転写が抑制された変異型の遺伝子の方が優勢に発現する。そのため、例えば交配や、ＲＮＡｉ法のような従来技術で作製した変異体のように、劣勢ホモ個体を単離する必要がない。
【００３７】
したがって、短期間で、簡便、確実に、八重咲き植物体を生産することができる。
【００３８】
また、得られる八重咲き植物体は、種子が形成されない不稔性植物体となる。上記不稔性植物体には、雄しべも雌しべも全く形成されない完全不稔性植物体の他、不完全な雄しべ様器官および／または雌しべ様器官が形成されるものの、種子の形成が抑制される不稔性植物体も含まれる。
【００３９】
上記不稔性植物体では、種子が形成されない。また、上記完全不稔性植物体では、花粉の離散が生じない。したがって、遺伝子組み換え植物の環境への拡散を防止することができる。
【００４０】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、雌しべの形成に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。そこで、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００４１】
（Ｉ−１）転写因子
本発明で用いられる転写因子は、雌しべの形成に関与する転写因子であれば、特に限定されるものではない。一実施形態において、本発明で用いられる転写因子は、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体である。配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記ＡＧ遺伝子がコードする転写因子であり、雌しべの形成に関与する。
【００４２】
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、タンパク質における「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのタンパク質の活性にほとんど影響しない。
【００４３】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４４】
当業者は、周知技術を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００４５】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るタンパク質活性を変化させない。
【００４６】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４７】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００４８】
本実施形態に係る転写因子は、以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００４９】
なお、上記の「（ｉ）記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列」及び「配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。このような変異タンパク質は、上述したように、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００５０】
なお、本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合しているタンパク質であればよいが、これに限定されるものではなく、タンパク質以外の構造を含む複合タンパク質であってもよい。本明細書中で使用される場合、「タンパク質以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５１】
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なタンパク質を含むものであってもよい。付加的なタンパク質としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識タンパク質が挙げられる。
【００５２】
ところで、花のホメオティック遺伝子は、シロイヌナズナやキンギョソウなどから単離されており、双子葉植物のみならず単子葉植物でも同様に機能すると考えられている。そのため、ＡＧ遺伝子がコードする転写因子等の、雌しべの形成に関与する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。したがって、八重咲き植物体の形成を行う個々の植物体において、雌しべの形成に関与する転写因子やその遺伝子を必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナで構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において八重咲き植物体を生産することができる。
【００５３】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）も好適に用いることができる。
【００５４】
上記転写因子をコードする遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【００５５】
上記転写因子をコードする遺伝子はさらに、雌しべの形成に関与する転写因子をコードする遺伝子の変異体であってもよい。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００５６】
このような変異体としては、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００５７】
上記転写因子をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記転写因子をコードする遺伝子または当該遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００５８】
一実施形態において、上記転写因子をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）記載のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、雌しべの形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【００５９】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６０】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００６１】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、公知の技術により、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法を用いることができる。例えば、上記転写因子をコードする遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記転写因子をコードする遺伝子の塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００６２】
あるいは、上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６３】
（Ｉ−２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７、非特許文献２、３等参照）を挙げることができる。
【００６４】
本発明者は、Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献１〜４参照）。また、Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献６参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００６５】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００６６】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００６７】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６８】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６９】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７０】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１及びＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４１、４２に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列である。
【００７１】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７２】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００７３】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７４】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１及びＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４３、４４に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４４に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４５に示す。
【００７５】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００７６】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７７】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。
【００７８】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときに容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００７９】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４６〜５４に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４６、４７または４８に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４９、５０または５１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５２、５３または５４に示すアミノ酸配列である。
【００８０】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号５、１４、５５に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５５に示すアミノ酸配列である。
【００８１】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００８２】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００８３】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）または（ｆ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｅ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００８４】
上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００８５】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法またはＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−ＫやＭｕｔａｎｔ−Ｇ（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００８６】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００８７】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００８８】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。
【００８９】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）または（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。
【００９０】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、または４０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２７、２８、３０、３２、３８，３９、または４０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２０、２３、３３、３４または３５のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２４、２５、２６、２９、または３１のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２１または２２のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００９１】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３６または３７で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００９２】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００９３】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードするポリヌクレオチドとを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。
【００９４】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子をコードするポリヌクレオチドと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子をコードするポリヌクレオチドの読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００９５】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、または１３２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、または１３３に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９０、９１に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号１〜４０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００９６】
【表１】


【００９７】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質には、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００９８】
（ＩＩ）本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体に導入し、八重咲き植物体を生産する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００９９】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードするポリヌクレオチドと、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【０１００】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【０１０１】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【０１０２】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【０１０３】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【０１０４】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【０１０５】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【０１０６】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【０１０７】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【０１０８】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードするポリヌクレオチドと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１０９】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１１０】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１１１】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１１２】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙ ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ）を用いることができる。
【０１１３】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１１４】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１１５】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１１６】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１１７】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのものの花の形態から選抜してもよい。例えば、花の形態から選抜する例としては、形質転換体の花の形態を、形質転換していない植物体の花の形態と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。特に花の形態は、単に比較するだけでも選抜が可能になるとともに、八重咲き植物体の生産という本発明の効果そのものも確認することができる。
【０１１８】
本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により花の形態が八重咲きとなる子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１１９】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１２０】
（ＩＩＩ）本発明にかかる不稔性植物体の生産方法
本発明にかかる不稔性植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を発現する遺伝子を植物体に導入し、不稔性植物体を生産する過程を含んでいれば、特に限定されるものではない。
【０１２１】
本発明において「不稔性植物体」には、雄しべおよび雌しべが形成されない完全不稔植物体の他、不和合性を持つ植物体、すなわち、雄しべおよび雌しべが形成されているが種子を形成できない植物体も含まれる。また、不完全な雄しべ様器官および／または雌しべ様器官を持つが、種子を形成できない植物体も含まれる。さらに、例えば、雄しべの形成が阻害され、花粉が全く形成されない不稔性植物体、雄しべは形成されるが、葯が形成されないために花粉が形成されない不稔性植物体、雄しべも葯も形成されるが、形成される花粉の量が少なく、葯の開裂に至らない不稔性植物体、形成された花粉が肥大化して互いにくっついてしまい、全く飛散しない不稔性植物体などの、いわゆる雄性不稔植物体も含まれる。
【０１２２】
上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子で目的の植物を形質転換すれば、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、非常に簡便に不稔性植物体を得ることができる。
【０１２３】
上記不稔性植物体は種子を形成することができない。また、完全不稔性植物体、雄性不稔植物体では、花粉の離散が生じない。したがって、遺伝子組み換え植物の環境への拡散を防止することができる。
【０１２４】
また、上記雄性不稔植物体は、自家受粉することができないが、異なった品種間での交配は可能である。したがって、雑種強勢を利用した交配に好適に用いることができ、優れた形質を有する雑種第一代の育種を効率的に行うことができる。
【０１２５】
また、雄性不稔は、確実に交雑種となるので、交配のために雄しべを除く必要がなく、多大な労力が軽減される。したがって、交配実験の効率化に適している。
【０１２６】
（２）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる八重咲き植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、得られる植物体の葉の形状を改変することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１２７】
（２−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかる八重咲き植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、花の形態を八重咲きとすることによりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等を挙げることができる。
【０１２８】
（２−２）本発明の有用性
本発明によれば、八重咲き植物体を生産することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、八重咲き植物体の生産により効果がある分野であればよい。かかる分野としては、新規な園芸品種の創出への応用等を挙げることができる。
【０１２９】
まず、新規な園芸品種の創出への応用例について説明すると、本発明に係る植物体の生産方法を用いることにより、上記機能性ペプチドが付加されたカセットベクターに転写因子の遺伝子を組み込み、植物細胞に導入するだけで、上記キメラタンパク質を植物細胞内で発現させることができ、転写因子の標的遺伝子の転写を容易に抑制することができる。また、上記転写因子の標的遺伝子の転写を抑制するという形質は、ドミナントであるので、交配やＲＮＡｉ法等の従来技術で作製した変異体のように、劣勢ホモ個体を単離する必要がない。したがって、短期間に簡便、確実に八重咲き植物体を作出することができ、園芸上非常に有用である。
【０１３０】
また、本発明により生産された八重咲き植物体または不稔性植物体では、種子の形成が行われず、さらに、完全不稔性植物体、雄性不稔植物体では花粉の離散が起こらないので、遺伝子組み換え植物の環境への拡散を防ぐことができ、非常に安全である。
【０１３１】
さらに、本発明により生産された八重咲き植物体または不稔性植物体は、雑種強勢を利用した交配に好適に用いることができ、優れた形質を有する雑種第一代の育種を効率的に行うことができるため、農業上非常に有用である。
【０１３２】
（２−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち八重咲き植物体生産キットを挙げることができる。
【０１３３】
この八重咲き植物体生産キットの具体例としては、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドと上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１３４】
以下、実施例及び図１ないし図７に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３５】
〔実施例１〕
以下の実施例１においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチドをＡＧ遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１３６】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１３７】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１３６）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１３７）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１３８）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１３９）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１３８】
（２）クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１３９】
（３）以下の配列番号１４０、１４１の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４０、１４１の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
５'−ｃｔａｇａｇｇａｔｃｃａｃａａｔｔａｃｃａａｃａａｃａａｃａａａｃａａｃａａａｃａａｃａｔｔａｃａａｔｔａｃａｇａｔｃｃｃｇｇｇｇｇｔａｃｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃｔｃ−３'（配列番号１４０）
５'−ｃｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｔｃｔｇｔａａｔｔｇｔａａｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｇｔａａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔ−３'（配列番号１４１）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１４０】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１４１】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
５'−ｇｇｇｃｔｔｇａｔｃｔｇｇａｔｃｔａｇａａｃｔｃｃｇｔｔｔｇｇｇｔｔｔｃｇｃｔｔａａｇ−３'（配列番号１４２）
５'−ｔｃｇａｃｔｔａａｇｃｇａａａｃｃｃａａａｃｇｇａｇｔｔｃｔａｇａｔｃｃａｇａｔｃａａｇｃｃｃ−３'（配列番号１４３）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
【０１４２】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図３に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１４３】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２０３，１９９０)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１４４】
（２）インビトロジェン社から購入したＧａｔｅｗａｙ(登録商標)ベクターコンバージョンシステムのＦｒａｇｍｅｎｔＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサ
イトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を回収した。
【０１４５】
（３）回収したＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１４６】
＜構築用ベクターへのＡＧコード領域の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＡＧタンパク質をコードするＤＮＡ配列または遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１４７】
（１）シロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡ ｐｄａ０１６７３を鋳型として、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くＡＧポリヌクレオチド（Ａｔ４ｇ１８９６０）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１ ５'−ａｔｇａｃｃｇｃｇｔａｃｃａａｔｃｇｇａｇｃｔａｇｇａｇｇ−３'（配列番号１４４）
プライマー２ ５'− ｃａｃｔａａｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇｔｔｔｇｇｔｃｔｔｇｇｃｇ −３'（配列番号１４５）
ＡＧポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列およびＡＧポリヌクレオチドのｃＤＮＡをそれぞれ配列番号１３４および１３５に示す。
【０１４８】
（２）得られたＡＧコード領域のＤＮＡ断片を、図２に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１４９】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１５０】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１５１】
（１）まず、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５．５μＬを加えた。
【０１５２】
（２）この溶液にＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１５３】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１５４】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙ ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
【０１５５】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸを、土壌細菌（（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）(ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓａｈｅｌｌ １９８６)）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、下表２）に懸濁した。
【０１５６】
【表２】


【０１５７】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
【０１５８】
【表３】


【０１５９】
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＧＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１６０】
次に、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換した植物体について、図４から図７に基づいて説明する。図４（ａ）は、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換し、完全な八重咲きとなったシロイヌナズナの花を示し、図４（ｂ）は、花の形態が八重咲きとなったシロイヌナズナの全体を表す図である。ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナの花は、供試した２８個体のうち１６個体において、図４（ａ）に示すように、完全な八重咲き植物体が形成された。図５（ａ）は、野生型のシロイヌナズナの花を示し、図５（ｂ）は、ＡＧ変異体のシロイヌナズナの花を示す図である。野生型のシロイヌナズナが４つのがく、４つの花弁、６つの雄しべ、１つの雌しべを有するのに対し、本発明に係る方法で形質転換したシロイヌナズナは、雄しべが花弁に変化し、雌しべとなるｗｈｏｒｌ４に新たな花が形成された。ＡＧ変異体も同様の構成となるが、本発明に係る方法で形質転換したシロイヌナズナは、ＡＧ変異体と比較して、花弁同士の間隔が狭く、均整の取れた美しい八重咲き植物体を形成した。図６は、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換した２８個体中１０個体の、シロイヌナズナの花を示す。上記１０個体では、不完全ながら八重咲き植物体が形成された。図７は、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換した２８個体中２個体のシロイヌナズナの花を示す。上記２個体では、野生型に近い形態の花が形成された。
【０１６１】
また、上記１６個体は、雄しべも雌しべも形成されない完全不稔性植物体となった。上記１０個体では、不完全な雄しべ様、雌しべ様器官が形成されたものの、種子は形成されなかった。すなわち、不稔性植物体が形成された。また、上記２個体においては雄しべおよび雌しべが形成されたが、種子形成数はきわめて少なかった。このように、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換された植物体は、すべて不稔性植物体となった。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
このように、本発明では、ＡＧ転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制することによって八重咲き植物体または不稔性植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業、園芸業、造園業、アグリビジネス等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子とＡＧ遺伝子とを組み込む工程図である。
【図３】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図４】図４（ａ）は、ｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸで形質転換し、完全な八重咲きとなったシロイヌナズナの花を示し、図４（ｂ）は、花の形態が八重咲きとなったシロイヌナズナの全体を表す図である。
【図５】図５（ａ）は、野生型のシロイヌナズナの花を示し、図５（ｂ）はＡＧ変異体のシロイヌナズナの花を示す図である。
【図６】組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸにより形質転換され、不完全な八重咲きとなったシロイヌナズナ花を示す図である。
【図７】組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＡＧＳＲＤＸにより形質転換され、野生型に近い形態となったシロイヌナズナの花を示す図である。
【出願人】 【識別番号】５０３３６０１１５
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】３０１０２１５３３
【氏名又は名称】独立行政法人産業技術総合研究所
【出願日】 平成１６年８月６日（２００４．８．６）
【代理人】 【識別番号】１０００８００３４
【弁理士】
【氏名又は名称】原 謙三
【公開番号】 特開２００６−４２７２９（Ｐ２００６−４２７２９Ａ）
【公開日】 平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願番号】 特願２００４−２３１５４４（Ｐ２００４−２３１５４４）