| 【発明の名称】 |
植物による二酸化窒素代謝の促進方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】高橋 美佐
【氏名】森川 弘道
【氏名】坂本 敦
【氏名】橋本 愛美
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| 【要約】 |
【課題】植物の二酸化窒素代謝を促進させる手段を提供すること
【解決手段】Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させる、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法；該促進された二酸化窒素取込み能を有するトランスジェニック植物；Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させる、植物における、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法；植物内におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を増強させる、植物による二酸化窒素代謝の促進方法；該トランスジェニック植物を用いて、大気環境中におけるＮＯXを低減させる、環境浄化方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させることを特徴とする、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法。
【請求項２】
Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性が、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性である、請求項１記載の作成方法。
【請求項３】
該核酸が、下記（Ａ）〜（Ｅ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズしうる核酸であり、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである核酸の塩基配列、
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、８５％以上であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）配列番号：１に示される塩基配列と核酸多型により異なり、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸である、請求項１又は２記載の作製方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の作製方法により作製されたものであり、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸が導入されてなる、促進された二酸化窒素取込み能を有するトランスジェニック植物。
【請求項５】
Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させることを特徴とする、植物における、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法。
【請求項６】
（ｉ）Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入すること、及び／又は
（ｉｉ）植物体に内在するＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドに対する活性誘導剤を該植物体に供給すること
により、植物内におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を増強させることを特徴とする、植物による二酸化窒素代謝の促進方法。
【請求項７】
請求項４記載のトランスジェニック植物を用いて、大気環境中におけるＮＯXを低減させることを特徴とする、環境浄化方法。
【請求項８】
該トランスジェニック植物が、バラ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ヤナギ科植物、モクレン科植物、イチジク科植物及びアブラナ科植物からなる群より選ばれた植物に由来するものである、請求項７記載の環境浄化方法。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の二酸化窒素代謝を促進させる手段に関する。さらに詳しくは、本発明は、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法；促進された二酸化窒素取込み能を有するトランスジェニック植物；植物における、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法；及び植物による二酸化窒素代謝の促進方法及び環境浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自動車の排気ガス等に含まれる一酸化窒素、二酸化窒素等の窒素酸化物（ＮＯX）は、反応性が高く、大気汚染の原因の１つとなっている。
【０００３】
現在、自動車等から排出されるＮＯXの量を減らす種々の試みがなされている。大気環境中におけるＮＯXの量を除去する試みとしては、例えば、二酸化チタンを光触媒として用いる方法（例えば、特許文献１、２）、密閉型駐車場やトンネル内の換気ガスの浄化のために、炭素質吸着剤充填層に通して加熱し、窒素酸化物還元剤により、窒素酸化物を還元する方法（特許文献３）、窒素酸化物吸収材を用いる方法（特許文献４）。しかしながら、大気環境等におけるＮＯX量は、近年横ばい傾向にあり、実際には、ＮＯXの除去までは至っていないのが現状である。
【特許文献１】特開平６−３１５６１４号公報
【特許文献２】特開平８−１９６９０２号公報
【特許文献３】特開平７−２７５６５６号公報
【特許文献４】特開２０００−２３０４１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の１つの側面は、植物において、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物を低減させること、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物を減少させる手段を提供すること、収量を増加させること等の少なくとも１つを可能にする、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法を提供することにある。本発明の他の側面は、高い二酸化窒素取込み能を有すること、野生型植物よりも還元態窒素化合物の含有量が高いこと等の少なくとも１つの性質を有する、トランスジェニック植物を提供することにある。本発明の別の側面は、植物において、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物を低減させること等の少なくとも１つを可能にする、植物におけるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法を提供することにある。本発明のさらに別の側面は、二酸化窒素取込みを促進させること、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物を減少させること等の少なくとも１つを可能にする、植物による二酸化窒素代謝の促進方法を提供することにある。本発明の別の側面は、大気環境等におけるＮＯXを低減させること等の少なくとも１つを可能にする、環境浄化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨は、
〔１〕 Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させることを特徴とする、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法、
〔２〕 Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性が、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性である、前記〔１〕記載の作成方法、
〔３〕 該核酸が、下記（Ａ）〜（Ｅ）：
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズしうる核酸であり、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである核酸の塩基配列、
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、８５％以上であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）配列番号：１に示される塩基配列と核酸多型により異なり、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸である、前記〔１〕又は〔２〕記載の作製方法、
〔４〕 前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の作製方法により作製されたものであり、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸が導入されてなる、促進された二酸化窒素取込み能を有するトランスジェニック植物、
〔５〕 Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させることを特徴とする、植物における、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法、
〔６〕 （ｉ）Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入すること、及び／又は
（ｉｉ）植物体に内在するＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドに対する活性誘導剤を該植物体に供給すること
により、植物内におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を増強させることを特徴とする、植物による二酸化窒素代謝の促進方法、
〔７〕 前記〔４〕記載のトランスジェニック植物を用いて、大気環境中におけるＮＯXを低減させることを特徴とする、環境浄化方法、並びに
〔８〕 該トランスジェニック植物が、バラ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ヤナギ科植物、モクレン科植物、イチジク科植物及びアブラナ科植物からなる群より選ばれた植物に由来するものである、前記〔７〕記載の環境浄化方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法によれば、植物におけるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物の減少を可能にする手段を提供することができ、収量の増加が可能な植物を供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のトランスジェニック植物によれば、高い二酸化窒素取込み能を有し、野生型植物よりも還元態窒素化合物の含有量が高いという優れた性質を有し、収量の増加、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物の減少等が可能になるという優れた効果を奏する。本発明の植物におけるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法によれば、植物における該窒素化合物を低減させることができ、収量の増加、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物の減少等が可能になるという優れた効果を奏する。本発明の植物による二酸化窒素代謝の促進方法によれば、植物による二酸化窒素取込みを促進させることができ、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物を減少させることができるという優れた効果を奏する。本発明の環境浄化方法によれば、大気環境等におけるＮＯXを低減させることができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、植物、例えば、シロイヌナズナにおいて、ＮＯ2曝露によりＳ−ニトロソ化合物、例えば、Ｓ−ニトロソグルタチオンの生成が誘導され、植物体内でＳ−ニトロソチオール還元酵素、例えば、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素を過剰発現させた場合、植物体内における前記Ｓ−ニトロソ化合物の量が減少し、ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の量も減少するとともに、植物による二酸化窒素取込みを増強することができるという本発明者らの知見に基づく。
【０００８】
本発明は、１つの側面では、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させることを特徴とする、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物の作製方法に関する。
【０００９】
本発明に用いられるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドは、Ｓ−ニトロチオール還元酵素活性を示すものであれば、いわゆる二機能酵素等であってもよい。前記「Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチド」としては、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。また、前記「Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチド」の供給源となる個体の種類は、特に限定されることがなく、例えば、植物、動物、微生物等が挙げられる。
【００１０】
また、前記「Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性」としては、例えば、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性等が挙げられる。
【００１１】
前記「Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸」は、植物又は動物由来の核酸である場合、発現効率、遺伝子導入効率等の観点から、好ましくは、ｃＤＮＡであることが望ましい。また、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドを効率よく発現させ、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を十分に発揮させる観点から、導入対象となる植物におけるコドン使用頻度に応じ、前記「Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸」におけるコドンを適宜改変してもよい。
【００１２】
前記「Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸」としては、より具体的には、（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００１３】
なお、本発明においては、コードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものであれば、当該核酸のバリアントであってもよい。
【００１４】
前記バリアントの塩基配列としては、例えば、
１つの側面では、
（Ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列、
他の側面では、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズしうる核酸であり、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである核酸の塩基配列、
別の側面では、
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した配列同一性が、８５％以上であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列、さらに別の側面では、（Ｅ）配列番号：１に示される塩基配列と核酸多型により異なり、かつコードされるポリペプチドがＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すものである塩基配列等が挙げられる。
【００１５】
前記バリアントは、自然発生のバリアント又は人為的に創出されたバリアントのいずれであってもよい。
【００１６】
なお、本明細書において、「少なくとも１個」の文言は、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性の発現が可能な範囲であればよいことを意図するものであり、好ましくは、１個若しくは数個であればよい。
【００１７】
また、本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、中ストリンジェント、好ましくは、高ストリンジェントな条件をいう。
【００１８】
より具体的には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、前記配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖と、評価対象の核酸とを５５℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、特に、バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる条件をいう。
【００１９】
前記バリアントは、例えば、
１） 慣用の部位特異的変異導入法等により、所望の位置に変異を導入した核酸を作製する工程、
２） 前記１）で得られた核酸を適切なベクターに組込む工程、
３） 適切な宿主（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等）を、前記２）で得られた発現ベクター（宿主に応じた慣用のベクター）を用いて、形質転換して、形質転換体を得る工程、及び
４） 前記３）で得られた形質転換体について、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示す有無を調べて、活性を示すものを選抜する工程
を行なうことにより得ることができる。
【００２０】
Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性は、評価対象のポリペプチドについて、ＮＡＤＨと、Ｓ−ニトロソチオールとの存在下に反応を行ない、３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光係数：６２２０Ｍ-1ｃｍ-1としてＮＡＤＨの減少を測定することにより評価される。具体的には、例えば、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素の場合、評価対象のポリペプチドを、反応液〔組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ〕に添加して、２５℃でインキュベーションし、ついで、得られた混合物に、Ｓ−ニトロソグルタチオンを、終濃度４００μＭとなるように、該混合物に添加することにより反応を開始させ、３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光係数：６２２０Ｍ-1ｃｍ-1としてＮＡＤＨの減少を測定することにより評価されうる。
【００２１】
本発明に用いられる植物としては、特に限定されるものではなく、例えば、街路樹として用いられている低木、高木樹、落葉樹、常緑樹、農作物、葉菜類、根菜類、牧草等が挙げられる。具体的には、本発明に用いられる植物としては、特に限定されないが、例えば、バラ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ヤナギ科植物、モクレン科植物、イチジク科植物、アブラナ科植物等が挙げられる。より具体的には、シャリンバイ、ユーカリプタス、ポプラ、ユリノキ、ゴムノキ、ヤマナラシ、シロイヌナズナ等が挙げられる。本発明の作製方法により得られた植物により、環境浄化を行なう場合、栽培効率、浄化効率等の観点から、好ましくは、街路樹として用いられる植物等が望ましい。
【００２２】
Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入するための方法は、用いられる植物に応じて適宜選択されうるが、パーティクルガン等の直接導入法、減圧浸潤法、アグロバクテリウム法等が挙げられる。
【００２３】
具体的には、例えば、減圧浸潤法の場合、
− 慣用のベクターに、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を連結して導入用ベクターを作製、
− 得られた導入用ベクターを用いて、アグロバクテリウムを形質転換し、
− 形質転換されたアグロバクテリウムと、逆さに静置された植物とを接触させて、減圧環境下に、該アグロバクテリウムを感染させる
ことにより、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入することができる。
【００２４】
植物体に核酸を導入するためのベクターとしては、特に限定されないが、例えば、慣用のｐＢＩ系ベクター、ｐＵＣ系ベクター等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明の作製方法には、プロトプラスト又はカルスに、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法、マイクロキャピラリーを用いたマイクロインジェクション法等で導入し、葉、根等に再分化させ、植物体を再生する態様も含まれる。なお、葉への再分化は、例えば、プロトプラストの場合、該プロトプラストを固体栄養培地で培養して、細胞壁を合成させ、ついで、液体培地中で、激しく攪拌させながら、培養し、カルスを得、得られたカルスをオーキシンおよびサイトカイニンの存在下に培養することにより行なわれうる。なお、カルスから葉への再分化は、例えば、低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行われうる。リーフディスクから葉の再分化は、例えば、リーフディスクを低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行われうる。前記葉への再分化の際に用いられる培地としては、例えば、カルス誘導培地（１ｍｇ／ｌ インドール酢酸と１ｍｇ／ｌ ベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）、シュート誘導培地（０．１ｍｇ／ｌ インドール酢酸と１ｍｇ／ｌ ベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）等が挙げられる。
【００２６】
本発明の作製方法により得られたトランスジェニック植物、すなわち、促進された二酸化窒素取込み能を有する植物による二酸化窒素取込み能は、例えば、
１．植物に適した条件（例えば、アブラナ科植物、特に、シロイヌナズナの場合、２２℃、湿度７０％、照度７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1、連続光、３６０〜４００ｐｐｍ Ｃ０2の条件で４時間）下、該植物を、過剰量（例えば、４ｐｐｍ）の15ＮＯ2に曝露し、
２．曝露後の植物について、凍結乾燥し、粉末状にして、試料を得、
３．得られた試料中に含まれる15ＮＯ2由来の全窒素量を、元素分析／質量分析により分析することにより、二酸化窒素取込み量を測定し、トランスジェニック植物の二酸化窒素取込み量と対照として野生型植物における二酸化窒素取込み量とを比較することにより評価されうる。ここで、トランスジェニック植物の二酸化窒素取込み量が、対照として野生型植物における二酸化窒素取込み量に比べ、増加していた場合、トランスジェニック植物による二酸化窒素取込み能が、促進されていることの指標となる。
【００２７】
本発明の作製方法においては、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を、植物体に導入し、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させているため、植物におけるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物が低減し、二酸化窒素取込み能が促進された植物体を創出することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の作製方法によれば、植物におけるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物が低減し、二酸化窒素取込み能が促進された植物体を得ることができるため、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物の減少を可能にする手段を提供することができる。さらに、本発明の作製方法によれば、収量の増加が可能な植物を供給することができる。
【００２８】
本発明は、他の側面では、作製方法により作製されたものであり、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸が導入されてなる、促進された二酸化窒素取込み能を有するトランスジェニック植物に関する。
【００２９】
本発明のトランスジェニック植物は、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸が導入されているため、高い二酸化窒素取込み能を有するという優れた性質を発現する。また、本発明のトランスジェニック植物は、野生型植物よりも還元態窒素化合物の含有量が高いという優れた性質を有する、したがって、本発明のトランスジェニック植物は、高い収量で得られうる。
【００３０】
また、本発明は、別の側面では、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させることを特徴とする、植物におけるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の低減方法に関する。
【００３１】
なお、本明細書において、「ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物」とは、ケルダール法で検出することができる還元態窒素ではなく、かつ無機窒素でもない窒素化合物を意味する。かかる「ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物」は、植物中の全窒素量から、ケルダール法で検出することができる還元態窒素量と、無機窒素量とを差し引いた量の窒素として検出されうる。
【００３２】
植物における全窒素量は、例えば、
１．植物に適した条件（例えば、アブラナ科植物、特に、シロイヌナズナの場合、２２℃、湿度７０％、照度７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1、連続光、３６０〜４００ｐｐｍ Ｃ０2の条件で４時間）下、該植物を、過剰量（例えば、４ｐｐｍ）の15ＮＯ2に曝露し、
２．曝露後の植物について、凍結乾燥し、粉末状にして、試料を得、
３．得られた試料中に含まれる15ＮＯ2由来の全窒素量を、元素分析／質量分析により分析することにより測定されうる。
【００３３】
還元態窒素の量は、上記凍結乾燥し、粉末状にした試料について、ケルダール法〔モリカワ（Ｈ．Ｍｏｒｉｋａｗａ）ら、Ｐｌａｎｔａ、２１９：１４−２２（２００４）〕に従い測定されうる。
【００３４】
無機窒素の量は、キャピラリー電気泳動により、カワムラ（Ｙ．Ｋａｗａｍｕｒａ）ら、Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、３７:８７８−８８０（１９９６）及びモリカワ（Ｈ．Ｍｏｒｉｋａｗａ）ら、Ｐｌａｎｔａ、２１９：１４−２２（２００４）の測定条件で測定されうる。
本明細書において、前記「ケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物」は、具体的には、全窒素量、還元態窒素の量及び無機窒素の量を、以下のような手法により測定して検出されるものとして定義されうる。
【００３５】
調製した各試料中に含まれる15ＮＯ2由来の全窒素量は、元素分析計（ＦＩＳＯＮＳ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、商品名：Ｍｏｄｅｌ ＥＡ／ＮＡ）直結型同位体質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｍａｔ， Ｄｅｌｔａ ｐｌｕｓ−Ｈ）を用いて分析されうる。なお、アセトアニリド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社製）を標準物質として作成した検量線に基づき、植物試料中の窒素含有量を算出する。また、質量分析計から得られたδ２９／２８から窒素中に含まれる15Ｎ原子％を算出し、得られた値と、元素分析計から求めた窒素量とから、15Ｎ量を算出する。また、還元態窒素の量（ケルダール窒素量）は、
− 植物試料〔約２０〜３０ｍｇ（０．５〜１ｍｇ Ｎ相当量）を、薬包紙で包み試料を得、薬包紙のみを対照試料を得、
− 得られた試料を、ケルダール分解管に入れ、ケルダール窒素迅速分解装置（三田村理研工業）にセットし、１５ｍｌの３６Ｎ 濃硫酸（シグマ社製）を該試料に添加し、
− 前記試料に、５ｍｌの過酸化水素 （３０−３５．５体積％、関東化学社製）を添加し、４０℃で１時間インキュベーションし、
− 得られた試料を、よく冷却し、冷却後の試料に、３０ｍｌの精製純水を添加し、
− 前記試料を、三角フラスコに入れ、該三角フラスコに２０ｍｌの３重量％ ホウ酸を入れ、該三角フラスコ中の試料を、ケルダール法窒素／タンパク質自動蒸留装置（なかやま理化製作所製）にセットし、
− 得られた混合物に、約８０ｍｌの３０重量％ ＮａＯＨを添加し、蒸留し、ケルダール蒸留液を得（ここで、０．０１Ｎ 硫酸は、０．０２Ｎ 容量分析用ＮａＯＨを用い、正確な濃度が定量されたものである）、
− ケルダール蒸留液の一部 約２５ｍｌを、前記０．０１Ｎ 硫酸で滴定し、アンモニア量を求める
ことにより測定されうる（ケルダール分解法）。なお、ケルダール蒸留液の残りを用いて、以下のように、さらに15Ｎの分析を行なう。コンウェイ微量拡散法の容器の中央に５０μｌの０．５体積％ 硫酸を置く。また、外液として、１０ｍｌの蒸留液と１０ｍｌの５重量％ ホウ酸（ｐＨ１０．０）との混合物を用いる。前記容器を、２５℃で２４時間以上放置する。前記硫酸を回収し、２０〜５０μｌを液体用錫製コンテナに入れ、ＥＡ−ＭＳ分析を行ない、15Ｎ原子％を算出し、得られた値と前記ケルダール窒素量とから15Ｎ由来ケルダール窒素量が求められうる。無機窒素（ＮＯ3-／ＮＯ2-）の量は、キャピラリー電気泳動により、以下のように測定されうる。植物凍結乾燥試料（約２０〜３０ｍｇ相当量）を、テフロン（登録商標）製乳鉢に移し、該試料の１４倍量の０．１重量％ ＳＤＳ溶液を添加し、その後、テフロン（登録商標）製乳棒ですりつぶす。得られた試料に、クロロホルムを添加し、混合する。その後、テフロン（登録商標）乳鉢から植物抽出液を回収する。回収した植物抽出液を、１３０００×ｇで１０分間、遠心分離して、上清を回収し、さらに、該上清を、１３０００×ｇで１０分間、遠心分離する。得られた試料について、キャピラリーイオン分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、下記分析条件：
溶媒：０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣＩＡ−ＰａｋTM ＯＦＭ Ａｎｉｏｎ−ＢＴ（商品名、Ｗａｔｅｒｓ社製）、
測定波長：２１４ｎｍ、
分析時間：１０分、
キャピラリー：７５μｍ×６０ｃｍ、
電圧：２０ｋＶ、
で、植物試料中のＮＯ3-／ＮＯ2-量を分析する。なお、１０００ｍｇ／ｌのＮＯ3-／ＮＯ2-標準液（和光純薬工業株式会社製）の希釈物を標準物質として作成された検量線に基づき、ＮＯ3-／ＮＯ2-量を算出する。また、前記ＮＯ3-／ＮＯ2-中の15Ｎの分析は、
− １ｍｌの商品名：Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｈ ｆｏｒｍを充填したカラムに、前記キャピラリー電気泳動で残った試料を負荷し、１０ｍｌの精製純水により非カチオン性化合物を溶出し、
− 溶出した試料を、ケルダール分解管に移し、１０ｍｌの精製純水で希釈し、
− 得られた試料に、０．８ｇ デバルダ合金と、１ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨとを添加し、２４時間以上放置し、以下、前記と同様に、前記ＮＯ3-／ＮＯ2-中の15Ｎの分析を行なう。
【００３６】
本発明の低減方法によれば、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入し、該ポリペプチドのＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を発現させているため、植物中に含まれるケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物を低減させることができ、植物における窒素の同化をより促進することができ、窒素又は窒素酸化物の取りこみ自体を、より促進することができるという優れた効果を発揮する。
【００３７】
本発明の低減方法における操作は、本発明のトランスジェニック植物の作製方法と同様である。
【００３８】
なお、本発明の低減方法においては、用いられるトランスジェニック植物中におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性は、通常の生育条件下における野生型植物中の内在性Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性と比べ、過剰に発現していることが好ましい。例えば、用いられるトランスジェニック植物中におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性は通常の生育条件下における野生型植物中の内在性Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性と比べ、８倍以上発現していることが望ましい。
【００３９】
本発明は、さらに別の側面では、（ｉ）Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする核酸を植物体に導入すること、及び／又は
（ｉｉ）植物体に内在するＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を示すポリペプチドに対する活性誘導剤を該植物体に供給すること
により、植物内におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性を増強させることを特徴とする、植物による二酸化窒素代謝の促進方法に関する。
【００４０】
前記（ｉ）は、本発明のトランスジェニック植物の作製方法と同様である。
【００４１】
前記（ｉｉ）において、植物体への活性誘導剤の供給は、例えば、水、肥料等と混合して、供給することにより行なわれうる。
前記活性誘導剤としては、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性の発現を促進するものであれば、特に限定されるものではない。
【００４２】
本発明の二酸化窒素代謝の促進方法においては、用いられるトランスジェニック植物中におけるＳ−ニトロソチオール還元酵素活性は、通常の生育条件下における野生型植物中の内在性Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性と比べ、過剰に発現していることが好ましい。
【００４３】
本発明の二酸化窒素代謝の促進方法によれば、Ｓ−ニトロソチオール還元酵素活性が発現、好ましくは、過剰発現されているため、植物による二酸化窒素取込みを促進させることができ、大気環境及び／又は土壌環境中における窒素酸化物を減少させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の二酸化窒素代謝の促進方法によれば、植物による二酸化窒素代謝が促進されているため、ＮＯX量が多い環境下でも効率よく生育でき、収量を増加させることが可能である。
【００４４】
本発明は、別の側面では、本発明のトランスジェニック植物を用いて、大気環境中におけるＮＯXを低減させることを特徴とする、環境浄化方法に関する。
【００４５】
本発明の環境浄化方法によれば、高い二酸化窒素取込み能を有する本発明のトランスジェニック植物が用いられているため、大気環境等におけるＮＯXを効率よく低減させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４６】
本発明の環境浄化方法においては、浄化の対象となる環境での生育に適した植物に由来するトランスジェニック植物を用いることにより、より効率のよい環境浄化が期待できる。
【００４７】
具体的には、例えば、道路等、市街地等における大気環境の浄化に用いる場合、気候、日照時間等に応じて、植物を選択することができる。
【００４８】
本発明の環境浄化方法に用いられるトランスジェニック植物としては、街路樹として用いられている低木、高木樹、落葉樹、常緑樹、農作物、葉菜類、根菜類、牧草等に由来する植物が挙げられ、具体的には、特に限定されないが、例えば、バラ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ヤナギ科植物、モクレン科植物、イチジク科植物、アブラナ科植物等に由来する植物が挙げられる。より具体的には、シャリンバイ、ユーカリプタス、ポプラ、ユリノキ、ゴムノキ、ヤマナラシ、シロイヌナズナ等に由来する植物が挙げられる。ＮＯXの効率よい低減、生育環境への適応性の観点から、好ましくは、街路樹として用いられる植物に由来するもの等が望ましい。
【００４９】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
（１）ベクターの作製
シロイヌナズナ〔Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃ２４〕の全ＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μｌ） １０μｌを、６５℃で１０分間処理し、氷上で冷却した。その後、前記全ＲＮＡ溶液に、ＧＳＦＤＨ ｒ１プライマー ２．５μｌ（５ｐｍｏｌ相当量）、５×バッファー（商品名：ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅに添付の緩衝液、東洋紡株式会社製） ４μｌ、ｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭ） ２μｌ、逆転写酵素（商品名：ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ、東洋紡株式会社製；１０Ｕ／μｌ） １μｌを添加した。得られた混合物を、４２℃で６０分間反応させ、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子を保持するｃＤＮＡを得た。
【００５１】
得られたｃＤＮＡ（１μｌ）を鋳型として用い、反応溶液〔組成：１０×ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液） ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ ｍＭ） ６．２５μｌ、ＧＳ−ＦＤＨ ｆ１プライマー ２．５μｌ（５ｐｍｏｌ相当量）、ＧＳ−ＦＤＨ ｒ１プライマー ２．５μｌ（５ｐｍｏｌ相当量）、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製；５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ、残部水〕 ５０μｌ中、ＰＣＲにより、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマーとして、フォワードプライマー（ＧＳ−ＦＤＨ ｆ１プライマー）：
5'-TTTTCTAGAAATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATCAC-3'（配列番号：３）、及び
リバースプライマー（ＧＳＦＤＨ ｒ１プライマー）：
5'-AAAGAGCTCTCATTTGCTGGTATCGAGGACACAAC-3'（配列番号：４）
を用いた。また、ＰＣＲの条件は、９４℃で５分のインキュベーション後、変性：９４℃で３０秒と、アニーリング：５８℃で３０秒と、伸長：７２℃で９０秒とを１サイクルとする反応サイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分のインキュベーションを行なう条件である。
【００５２】
得られたＰＣＲ産物を、商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ〔プロメガ社製〕に連結した。その後、得られた産物を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ついで、菌体を４０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有したＬＢ寒天培地〔組成：０．０１重量％ トリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）、０．００５重量％ 酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）、０．００５重量％ ＮａＣｌ、１．５重量％ 寒天（和光純薬工業株式会社製）、ｐＨ７．０〕上、３７℃で培養することにより、形質転換体を選抜した。得られた各コロニーよりプラスミドを回収し、該プラスミド中に含まれるＰＣＲ産物塩基配列を確認し、正しい塩基配列を保持しているものを選別した。
【００５３】
得られたプラスミドを、ＸｂａＩとＳａｃＩとにより切断して、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素のコード領域を含む断片を得た。また、発現ベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍ由来のプラスミドであるｐＣｈ１ＣＯＤ（広島大学 坂本敦先生より提供）を、ＸｂａＩとＳａｃＩとにより切断して、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとを含有するベクター由来断片を得た。その後、前記Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素のコード領域を含む断片とベクター由来断片とを連結した。
【００５４】
得られた産物を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ついで、菌体を、ハイグロマイシン（１５μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含有したＬＢ寒天培地上、３７℃で培養することにより、形質転換体を選抜した。得られた各コロニーからプラスミドを回収した。得られたプラスミドを、ＸｂａＩとＳａｃＩとで処理して、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子の存在を確認した。得られたプラスミドｐＩＧ−ＧＳＮＯＲを図１に示す。図１中、「ＧＳＮＯＲ」は、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子、「Ｐ−３５Ｓ」は、カリフラワーモザイクウイルス３５ｓプロモーター、「Ｔ−ｎｏｓ」は、ターミネーター、「ｎｐｔＩＩ」は、カナマイシン耐性遺伝子、「ｈｐｈ」は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。
【００５５】
（２）アグロバクテリウムの形質転換
アグロバクテリウムＣ５８Ｃｌ ｒｉｆr（ｐＭ９０）を、リファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）とゲンタマイシン（２５ｍｇ／ｌ）とを含有したＬＢ寒天培地上で２８℃で一晩培養した。その後、得られたアグロバクテリウムを、リファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）とゲンタマイシン（２５ｍｇ／ｌ）とを含有したＬＢ液体培地〔組成：０．０１重量％ トリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）、０．００５重量％ 酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）、０．００５重量％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〕 ２ｍｌ中、２８℃で一晩培養し、さらに、ＬＢ液体培地 ５０ｍｌ中、２８℃でＯＤ600＝０．５〜１．０になるまで振盪培養した。
【００５６】
得られた培養物を、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して、沈殿物を得た。得られた沈殿物を２０ｍＭ 氷冷ＣａＣｌ2液 １ｍｌに懸濁し、アグロバクテリウムのコンピテントセル懸濁物を得た。
【００５７】
前記（１）で得られたｐＩＧ−ＧＳＮＯＲ 約１μｇ相当量と、前記コンピテントセル懸濁物 １ｍｌとを混合し、得られた混合物を液体窒素で凍結した。その後、前記混合物を、３７℃の恒温槽で５分間インキュベーションした。前記混合物に、ＬＢ液体培地 １ｍｌを添加し、２８℃で２〜４時間、穏やかに振盪培養した。その後、培養物を、３０秒間遠心して、沈殿物を回収し、得られた沈殿物を、ＬＢ液体培地 ０．１ｍｌに再懸濁した。
【００５８】
得られた菌体を、リファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）とゲンタマイシン（２５ｍｇ／ｌ）とを含有したＬＢ寒天培地上、２８℃で培養して、形質転換体を選抜した。
【００５９】
（３）植物体の調製
バーミキュライト：パーライト＝１：１の混合土 ５０ｇをポットにいれ、さらに、該混合土に、１０００倍希釈したハイポネックス〔(株)ハイポネックスジャパン社製〕 ５０ｍｌを添加した。シロイヌナズナ〔Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃ２４の種子を、４℃で一晩吸水させたものを、１ポットあたり５〜６粒ずつ蒔いた。その後、１ポットずつラップで覆い、２２℃、光条件：１６時間明期、８時間暗期のインキュベーターで維持し、発芽させた。徐々にラップをはずしていき、１０日日までに完全にはずした。また、週に２度、１０００倍希釈したハイポネックス ５０ｍｌを供給した。
【００６０】
小さい個体を間引き、１ポットあたり３個体にした。花茎が伸びてきたら、花茎の付け根から数えて１枚目の葉を残し、花茎を切り取り、脇芽を誘導させた。蕾がつき始めた個体を、アグロバクテリウムの感染に用いた。
【００６１】
（４）減圧浸潤法によるシロイヌナズナへの感染
リファンピシン （１００μｇ／ｍｌ）とゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含有したＬＢ液体培地 ３ｍｌにアグロバクテリウムを播種し、３０℃で１〜２日間培養した。得られた培養物を、リファンピシン （１００μｇ／ｍｌ）とゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含有したＬＢ液体培地 ２５０ｍｌに移し、ＯＤ600＝１．２〜１．６になるまで培養した。得られた培養物を、遠心管〔アシスト社製〕に移し、該遠心管を、４℃、５０００ｒｐｍで１５分の遠心分離に供し、菌体を回収した。
【００６２】
得られた菌体を、Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ[組成：１／２希釈 ＭＳ ｓａｌｔｓ〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３，（１９６２）〕、ｐＨ５．６、和光純薬工業株式会社製、商品名：ムラシゲ・スクーブ培地用混合塩類]、５０μｇ／ｍｌ ミオイノシトール、５μｇ／ｍｌ チアミン−ＨＣｌ、０．５μｇ／ｍｌ ニコチン酸、０．５μｇ／ｍｌ ピリドキシン−ＨＣｌ、５重量％ シュークロース、１０ｎｇ／ｍｌ ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．００００４重量％ 商品名：Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７（日本ユニカー株式会社製）、０．０５重量％ ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ ５．７）〕に、ＯＤ600＝０．６となるように懸濁し、得られた懸濁物を５００ｍｌ容ビーカーに移した。
【００６３】
シロイヌナズナのポットを逆さまにして、前記ビーカー中のアグロバクテリウムと接触させ、減圧装置中で、５０．６６２５Ｐａに減圧し、１０分間維持して、シロイヌナズナに、アグロバクテリウムを感染させた。なお、減圧装置は、シバタ株式会社製のデシケーターに中村理化工業株式会社製の真空ポンプを連結させたものである。
【００６４】
感染させたシロイヌナズナのポットを、商品名：キムタオルを敷いたバット上に横向けに静置させ、ラップで覆い、インキュベーターに移した。その後、ラップをはずしてポットを起こし、２２℃、光条件：１６時間明期、８時間暗期で生育させた。なお、感染後、１週間は水を供給せず、根が腐らないようにした。その後、１週間に２度、１０００倍希釈したハイポネックス ５０ｍｌを供給した。
【００６５】
（５）形質転換体の選抜
種子を採取し、２週間以上乾燥させた。得られた種子 約５００粒ずつを、１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ（商品名、グライナー社製）に入れ、該種子を、２．５体積％ 次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した。
【００６６】
クリーンベンチ内で、０．２重量％ 滅菌済液状ＬＯ３〔タカラバイオ社製〕 １ｍｌとり、試験管に移し、前記種子を滅菌水 １ｍｌと共に該試験管に入れ、よく混合した。
【００６７】
ついで、上記種子を、９ｃｍディッシュ中、ハイグロマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含む選抜培地[組成：ビタミン類を含有しないＭＳ基本培地〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３，（１９６２）〕、ｐＨ５．６、０．６重量％ ジェランガム｝上に播種した。前記選抜培地の表面が乾燥した後、前記ディッシュを、パラフィルムで覆い、２２℃、光条件：１６時間明期、８時間暗期で目的の植物体を選抜した。
【００６８】
３〜４週間後、上記選抜により、生存していた植物体を、アグリポットに入れたＭＳ培地〔組成：ＭＳ基本培地、ｐＨ５．６、１重量％ シュークロース、０．６重量％ ジェランガム〕に移し、生育させた。なお、得られた植物体をＴ0世代とする。
【００６９】
（６）ＰＣＲによる形質転換植物の解析
クリーンベンチ内で、前記（５）で得られた植物体のロゼット葉から、３ｍｍ×３ｍｍ程度の大きさの切片を切り出し、１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れた。前記切片を、ペッスルでよく破砕した後、得られた試料に、抽出用緩衝液〔組成：２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５又はｐＨ８．０）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５重量％ ドデシル硫酸ナトリウム〕 ４００μｌ添加した。その後、得られた試料を、さらに破砕し、ついで、５秒間攪拌した。その後、得られた試料を、１３０００ｒｐｍ（１５０００×ｇ）で１分間遠心分離し、上清を３００μｌとり、新しいエッペンドルフチューブに移した。前記上清と等量の２−イソプロパノールを加え、室温で２分間放置した。得られた試料を、１３，０００（１５０００×ｇ）で５分間遠心分離し、上清を捨てた。
【００７０】
得られたペレットを乾燥させ、１００μ１ ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ）又は滅菌水に溶解させた。得られたＤＮＡ溶液を５〜１０倍に希釈し、ＴａＫａＲａ ＬＡTM−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）と反応液（組成：鋳型ＤＮＡ １ｎｇ相当量、１０×緩衝液（タカラバイオ社製、ＴａＫａＲａ ＬＡTM−Ｔａｑ付属緩衝液） ２μｌ、１０×ＭｇＣｌ2（タカラバイオ社製、ＴａＫａＲａ ＬＡTM−Ｔａｑ付属溶液） ２μｌ、ｄＮＴＰ溶液（各２．５ｍＭ ｄＮＴＰ） １．６μｌ、プライマー（各４０ｐｍｏｌ相当量） 各１μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡTM−Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） ０．２μｌ、残部水 計２０μｌ）とを用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲには、
フォワードプライマーｆ３：
5'-TTTGAGCTCAATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATCAC-3'（配列番号：５）、及び
リバースプライマーｒ３：
5'-AAATCTAGATCATTTGCTGGTATCGAGGACACAAAC-3'（配列番号：６）
を用いた。また、ＰＣＲ条件は、９４℃１分のインキュベーション後、９８℃２０秒と６６℃３分とを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、７２℃１０分インキュベーションする条件である。
【００７１】
その結果、図２に示されるように、Ｔ0植物では、ゲノムＤＮＡに含まれるＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子に対応する増幅断片（約２．１ｋｂ）に加え、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子に対応するｃＤＮＡに対応する増幅断片（約１．１ｋｂ）が検出されたことから、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子が外的に導入されたＴ0植物が得られたことが確認された。
【００７２】
（７）Ｔ0植物におけるＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性
前記Ｔ0植物の個体（約６０〜８０ｍｇ）あたり、氷冷した抽出用緩衝液〔組成：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０１体積％ グリセロール〕 ８０μｌを添加し、ペッスルで破砕した。得られた産物を、１４０００ｒｐｍ（１５０００×ｇ）で１０分間遠心分離し、上清を回収し、タンパク質粗抽出液を得た。
【００７３】
また、前記Ｔ0植物の場合と同様に、対照として、野生型シロイヌナズナについて、タンパク質粗抽出液を得た。
【００７４】
得られたタンパク質粗抽出液（２０〜３０μｇタンパク質相当量）を、反応液〔組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ〕と混合し、得られた混合物を、２５℃でインキュベーションし、Ｓ−ニトロソグルタチオンを、終濃度４００μＭとなるように、該混合物に添加することにより反応を開始した。
【００７５】
Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性は、３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光係数：６２２０Ｍ-1ｃｍ-1としてＮＡＤＨの減少により算出した。なお、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性は、１分間に１ｎｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる量として定義した。
【００７６】
その結果、図３に示されるように、野生型シロイヌナズナに比べ、Ｔ0植物においてＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性が約８００倍増強されたことがわかる。
【００７７】
そこで、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子が外的に導入されたＴ0植物について、順化及び自殖により種子を採取し、前記と同様に植物体の選抜を繰り返し、トランスジェニックシロイヌナズナ（ホモ接合体）を得た。
【実施例２】
【００７８】
縦２０ｃｍ×横２５ｃｍのバットに、オートクレーブした混合土（パーライト：バーミキュライト＝１：１）を広げ、ついで、該混合土の上に、粉末状のバーミキュライト（オートクレーブしたもの）を重層した。さらに、前記バットに、オートクレーブした精製純水を１バットあたり８００ｍｌ吸水させた。なお、上記精製純水は、ミリポア社製の純水製造装置で作製したものである。
【００７９】
前日から４℃で吸水処理を行った種子を、１．５ｃｍ間隔で、１バットあたり１８０−２００粒蒔いた。全体をラップで覆い、２２℃、湿度７０％、照度７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1、連続光の条件で生育させた。発芽後、ラップを３〜５日かけて徐々にはずした。ラップをはずしてからは、４日おきに、１バットあたり、オートクレーブした１／２ ＭＳ培地〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３，（１９６２）〕 ３００ｍｌを供給し、６週間目以降、前記１／２ ＭＳ培地の代わりに精製純水を供給し、サンプリングの２日前（６週と５日）に、精製純水の供給を止めた。
【００８０】
７週間目の植物のシュート部分のみをサンプリングし、精製純水ですすいだ。得られた試料を、凍結乾燥し、粉末状にし、ＮＯ2非曝露時の試料を得た。一方、残りの７週間目の植物を、２２℃、湿度７０％、照度７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1、連続光、３６０〜４００ｐｐｍ Ｃ０2の条件で４時間、４ｐｐｍ 15Ｎ０2に曝露させた。
【００８１】
曝露後の植物について、シュート部分を直ちにサンプリングし、精製純水ですすいだ。得られた試料を、凍結乾燥し、粉末状にし、曝露時の試料を得た。
【００８２】
秤量した試料を、氷上に置いたテフロン（登録商標）乳鉢に入れ、該テフロン（登録商標）乳鉢に試料１ｍｇあたり、精製純水 ６０μｌ添加した。得られた試料を、エッペンドルフチューブに移し、４℃、１２０００ｒｐｍ（１３０００×ｇ）で１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を精製純水で３５倍又は５０倍に希釈した。
【００８３】
上清希釈物 １００μｌに対して１００μｌの精製純水を添加し、ついで、１００μＭ ＮＨ4−ｓｕｌｆａｍａｔｅ水溶液 １００μｌを添加し、ＮＯ2-をトラップした。得られた混合物を、室温で１０分間インキュベーションし、該混合物に、２，３−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）反応混合液（精製純水に溶解させた１１．１１ ｍＭ ＨｇＣ１2 １体積部、１５８μＭ ＤＡＮの０．６２Ｎ ＨＣｌ溶液 ４体積部） １００μｌを添加した。
【００８４】
遮光して、前記混合物を、室温で１０分間インキュベーションした。その後、前記混合物に、１Ｎ ＮａＯＨ ６０μｌを添加し、ｐＨ１１．５〜１２．０に調整した。
【００８５】
得られた試料について、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍで蛍光を測定した。なお、標準試料として、０．０５〜１μＭ Ｓ−ニトロソグルタチオンについて、検量線を作成した。
【００８６】
その結果、図４に示されるように、ＮＯ2曝露により、野生型シロイヌナズナにおけるＳ−ニトロソグルタチオン量が、ＮＯ2非曝露の場合の約５倍の量に増加した。したがって、植物において、Ｓ−ニトロソチオール（Ｓ−ニトロソグルタチオン）の代謝経路が存在することがわかる。野生型シロイヌナズナに比べ、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素を過剰発現させたトランスジェニックシロイヌナズナにおいては、驚くべくＳ−ニトロソチオール（Ｓ−ニトロソグルタチオン）の量が減少していることがわかる。
【実施例３】
【００８７】
植物には、ケルダール法で検出することができる還元態窒素でも無機窒素でもない窒素化合物（以下、ＵＮ化合物ともいう）が存在している。そこで、前記実施例１で得られたトランスジェニックシロイヌナズナにおけるＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素の過剰発現によるＵＮ化合物量への影響を調べた。
【００８８】
前記実施例２と同様に、野生型シロイヌナズナ及びトランスジェニックシロイヌナズナのそれぞれを、４ｐｐｍ 15ＮＯ2曝露し、試料を調製した。
【００８９】
調製した各試料中に含まれる15ＮＯ2由来の全窒素量を、元素分析計（ＦＩＳＯＮＳ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、商品名：Ｍｏｄｅｌ ＥＡ／ＮＡ）直結型同位体質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｍａｔ， Ｄｅｌｔａ ｐｌｕｓ−Ｈ）を用いて分析した。なお、アセトアニリド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社製）を標準物質として作成した検量線に基づき、植物試料中の窒素含有量を算出した。また、質量分析計から得られたδ２９／２８から窒素中に含まれる15Ｎ原子％を算出し、得られた値と、元素分析計から求めた窒素量とから、15Ｎ量を算出した。
【００９０】
また、還元態窒素の量は、ケルダール法（ケルダール分解法）〔モリカワ（Ｈ．Ｍｏｒｉｋａｗａ）ら、Ｐｌａｎｔａ、２１９：１４−２２（２００４）〕に従い、以下のように、測定した。植物試料〔約２０〜３０ｍｇ（０．５〜１ｍｇ Ｎ相当量）を、薬包紙で包んだ。なお、薬包紙のみを対照試料として、以下、同様に行なった。
【００９１】
得られた試料を、ケルダール分解管に入れ、ケルダール窒素迅速分解装置（三田村理研工業）にセットし、１５ｍｌの３６Ｎ 濃硫酸（シグマ社製）を該試料に添加した。さらに、前記試料に、５ｍｌの過酸化水素 （３０−３５．５体積％、関東化学社製）を添加し、４０℃で１時間インキュベーションした。その後、得られた試料を、よく冷却し、冷却後の試料に、３０ｍｌの精製純水を添加した。
【００９２】
三角フラスコに２０ｍｌの３重量％ ホウ酸を入れ、該三角フラスコ中の試料を、ケルダール法窒素／タンパク質自動蒸留装置（なかやま理化製作所製）にセットした。得られた混合物に、約８０ｍｌの３０重量％ ＮａＯＨを添加した。得られた混合物を、蒸留し、ケルダール蒸留液を得た。
【００９３】
一方、０．０２Ｎ 容量分析用ＮａＯＨ（和光純薬工業株式会社製）を用い、０．０１Ｎ 硫酸の正確な濃度を求めた。
【００９４】
ケルダール蒸留液の一部 約２５ｍｌを、前記０．０１Ｎ 硫酸で滴定し、アンモニア量を求め、ケルダール窒素量を算出した。
【００９５】
なお、ケルダール蒸留液の残りは、以下のように、15Ｎの分析に用いた
【００９６】
コンウェイ微量拡散法の容器の中央に５０μｌの０．５体積％ 硫酸を置いた。また、外液として、１０ｍｌの蒸留液と１０ｍｌの５重量％ ホウ酸（ｐＨ１０．０）との混合物を用いた。前記容器を、２５℃で２４時間以上放置した。
【００９７】
前記硫酸を回収し、２０〜５０μｌを液体用錫製コンテナに入れ、ＥＡ−ＭＳ分析を行ない、15Ｎ原子％を算出し、得られた値と前記ケルダール窒素量とから15Ｎ由来ケルダール窒素量を求めた。
【００９８】
無機窒素（ＮＯ3-／ＮＯ2-）の量は、キャピラリー電気泳動により、以下のように測定した。植物凍結乾燥試料（約２０〜３０ｍｇ相当量）を、テフロン（登録商標）製乳鉢に移し、該試料の１４倍量の０．１重量％ ＳＤＳ溶液を添加し、その後、テフロン（登録商標）製乳棒ですりつぶした。得られた試料に、クロロホルムを添加し、混合した。その後、テフロン（登録商標）乳鉢から植物抽出液を回収した。回収した植物抽出液を、１３０００×ｇで１０分間、遠心分離して、上清を回収し、さらに、該上清を、１３０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００９９】
得られた試料について、キャピラリーイオン分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、下記分析条件：
溶媒：０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣＩＡ−ＰａｋTM ＯＦＭ Ａｎｉｏｎ−ＢＴ（商品名、Ｗａｔｅｒｓ社製）、
測定波長：２１４ｎｍ、
分析時間：１０分、
キャピラリー：７５μｍ×６０ｃｍ、
電圧：２０ｋＶ、
で、植物試料中のＮＯ3-／ＮＯ2-量を分析した。
【０１００】
なお、１０００ｍｇ／ｌのＮＯ3-／ＮＯ2-標準液（和光純薬工業株式会社製）の希釈物を標準物質として作成された検量線に基づき、ＮＯ3-／ＮＯ2-量を算出した。
【０１０１】
また、前記ＮＯ3-／ＮＯ2-中の15Ｎの分析は、以下のように行なった。１ｍｌの商品名：Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｈ ｆｏｒｍを充填したカラムに、前記キャピラリー電気泳動で残った試料を負荷し、１０ｍｌの精製純水により非カチオン性化合物を溶出した。ついで、溶出した試料を、ケルダール分解管に移し、１０ｍｌの精製純水で希釈した。さらに、得られた試料に、０．８ｇ デバルダ合金と、１ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨとを添加し、２４時間以上放置し、以下、前記と同様に、前記ＮＯ3-／ＮＯ2-中の15Ｎの分析を行なった。
【０１０２】
ＵＮ化合物の量は、全窒素量−（還元態窒素量＋無機窒素量）として算出した。結果を表１に示す。なお、表中、データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）であり、＊は、Ｐ＜０．０１である。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
その結果、表１に示されるように、野生型シロイヌナズナに比べ、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素を過剰発現させたトランスジェニックシロイヌナズナにおけるＵＮ化合物量が減少していることがわかる。
【実施例４】
【０１０５】
４０ｐｐｂの15ＮＯ2に、野生型シロイヌナズナ及び前記実施例１で得られたトランスジェニックシロイヌナズナそれぞれを曝露した。
【０１０６】
その後、各植物個体に吸収された15ＮＯ2の量を、前記実施例３と同様に、定量した。
【０１０７】
その結果、野生型シロイヌナズナにおいては、６７ｎｇ／植物個体の15ＮＯ2を吸収したのに対し、トランスジェニックシロイヌナズナでは、６７ｎｇ／植物個体の15ＮＯ2を吸収したことがわかった。したがって、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素を過剰発現させたトランスジェニックシロイヌナズナにより、大気中のＮＯXを減少させることができる可能性が示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明により、植物中のケルダール分解法で回収できない還元態窒素でありかつ非無機窒素である窒素化合物の量を減少させ、還元窒素態化合物を増加させることができ、植物へのＮＯ2の取込み及び同化能を高めることができる。また、本発明により、大気環境、土壌環境等におけるＮＯXを低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、プラスミドｐＩＧ−ＧＳＮＯＲの概略図を示す。図１中、「ＧＳＮＯＲ」は、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子、「Ｐ−３５Ｓ」は、カリフラワーモザイクウイルス３５ｓプロモーター、「Ｔ−ｎｏｓ」は、ターミネーター、「ｎｐｔＩＩ」は、カナマイシン耐性遺伝子、「ｈｐｈ」は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。
【０１１０】
【図２】図２は、全ＤＮＡ中におけるＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子に対応するＤＮＡ断片を検出した結果を示す。図中、Ｈ2Ｏは、陰性対照、ＷＴは、野生型シロイヌナズナ、ＴＲ１−３−１、ＴＲ３−５−２、ＴＲ４−３−２及びＴＲ６−４−２のそれぞれは、トランスジェニックシロイヌナズナを示す。また、Ｇｅｎｏｍｉｃは、ゲノムＤＮＡに含まれるＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子に対応する増幅断片（約２．１ｋｂ）、ｃＤＮＡは、Ｓ−ニトロソグルタチオン還元酵素遺伝子に対応するｃＤＮＡに対応する増幅断片（約１．１ｋｂ）の位置を示す。
【図３】図３は、野生型シロイヌナズナ（ＷＴ）及びトランスジェニックシロイヌナズナ（ＴＲ４−３−２）それぞれにおけるＳ−ニトロソグルタチオン還元酵素活性を調べた結果を示す。
【図４】図４は、野生型シロイヌナズナ（ＷＴ）及びトランスジェニックシロイヌナズナ（ＴＲ４−３−２）それぞれにおけるＳ−ニトロソグルタチオンの量を調べた結果を示す。
【配列表フリ−テキスト】
【０１１１】
配列番号：３は、フォワードプライマーＧＳ−ＦＤＨ ｆ１の配列である。
【０１１２】
配列番号：４は、リバースプライマーＧＳＦＤＨ ｒ１の配列である。
【０１１３】
配列番号：５は、フォワードプライマーｆ３の配列である。
【０１１４】
配列番号：６は、リバースプライマーr３の配列である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５０３３６０１１５
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
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| 【出願日】 |
平成１６年８月６日（２００４．８．６） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００９５８３２
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳徳
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| 【公開番号】 |
特開２００６−４２７２３（Ｐ２００６−４２７２３Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１８年２月１６日（２００６．２．１６） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−２３１３３２（Ｐ２００４−２３１３３２） |
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