トップ :: A 生活必需品 :: A01 農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業




【発明の名称】 葉の形態形成が制御された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用
【発明者】 【氏名】高木 優

【氏名】小山 知嗣
【要約】 【課題】葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体の生産方法を提供する。

【解決手段】葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させることにより葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体を生産する。上記転写因子をコードする遺伝子を植物体で過剰発現させることにより葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体を生産する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、該転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制させ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変することを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項２】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の植物体の生産方法。
【請求項３】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の植物体の生産方法。
【請求項４】
上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体の生産方法、
（ａ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質。
【請求項５】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項２又は３に記載の植物体の生産方法、
（ｃ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｄ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項７】
上記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法、
（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９、又は６０に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１３】
葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子を植物体で過剰に生産させることにより、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変することを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項１４】
上記転写因子をコードする遺伝子を発現するように、上記転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１３に記載の植物体の生産方法。
【請求項１５】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項１４に記載の植物体の生産方法。
【請求項１６】
上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ａ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質。
【請求項１７】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の植物体の生産方法、
（ｃ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｄ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体。
【請求項１９】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体。
【請求項２０】
植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の植物体。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
上記転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の葉の形態改変キット。
【請求項２２】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
上記転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の葉の形態改変キット。
【請求項２３】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の植物体の葉の形態改変キット。
【請求項２４】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質をコードする遺伝子、
（ａ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質、
或いは、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子、
（ｃ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｄ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体の生産方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉の形態形成が制御された植物体の生産方法及びこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものであり、特に葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体の生産方法及びこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、トウモロコシのＴＥＯＳＩＮＴＥ ＢＲＡＮＣＨＥＤ１（ＴＢ１）遺伝子や、キンギョソウのＣＩＮＣＩＮＮＡＴＡ（ＣＩＮ）遺伝子を欠損する突然変異体は、枝分かれや葉の形状に異常を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照。）。すなわち、ＴＢ１遺伝子を欠損するトウモロコシの突然変異体は、野生型にみられる頂芽優性がみられず、側芽が抑制されることなく成長する。また、ＣＩＮ遺伝子を欠損するキンギョソウの突然変異体は、葉の縁部分における成長が過剰となり、葉が波状となる。
【０００３】
上記非特許文献１、２では、トランスポゾンタギングを用いた解析により、ＴＢ１遺伝子及びＣＩＮ遺伝子は、共に、ＴＣＰファミリータンパク質が共通して有する相同なドメインをコードする塩基配列を有していることが報告されている。このＴＣＰファミリータンパク質が共通して有するドメインであるＴＣＰドメインは、トウモロコシのＴＢ１遺伝子、キンギョソウのＣＹＣＬＯＩＤＥＡ（ＣＹＣ）遺伝子、イネのＰＣＦ１、ＰＣＦ２遺伝子が共通してコードする領域として同定されている。また、このＴＣＰファミリータンパク質は、ＰＣＦ１、ＰＣＦ２タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質として機能していることから、転写因子ファミリーであることが示唆されている。
【０００４】
さらに、ＴＢ１遺伝子及びＣＹＣ遺伝子はそれぞれ腋芽及び花芽の分裂組織の成長制御に関与し、ＣＩＮ遺伝子は葉における部位特異的な細胞分裂の制御に関与すると推定され、ＰＣＦ１、ＰＣＦ２遺伝子は細胞分裂に必要な遺伝子のプロモーター領域に結合し、その転写を制御する転写因子であることから、ＴＣＰファミリータンパク質のうち、これらは細胞分裂制御に関与していると推定されている。しかし、ＴＣＰファミリーに属するほとんどの転写因子の機能については未だ知られていない。
【０００５】
ところで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献３、４参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【０００６】
さらに、本発明者は、種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することを試みている。そして、これにより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することに成功している。
【０００７】
なお、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物は、園芸上の価値が高いという利点をはじめ、植物栽培の省スペース化等の利点を有する。これまで植物の葉の形態にかかる形質を改変するためには、その目的とする形質を有する植物の品種を掛け合わせる交配育種が一般的である。しかし、従来の交配育種では、目的とする形質を有する植物を生産するためには、長い年月と、熟練者の経験が必要である。また、近年、遺伝子組換え技術を用いて植物の葉の形態にかかる形質を改変する試みが行われてきている。このような試みとしては、例えばＫＮＯＸ転写因子ファミリーに属するシロイヌナズナのＫＮＡＴ１、ＫＮＡＴ２遺伝子を過剰発現させることにより、分裂した葉や異所性を有する托葉等様々な発現型が見られることが報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】Doebley,J., Stec,A., Hubbard,L., Nature,386,485-488(1997)
【非特許文献２】Nath,U., Crauford,B.C.W., Carpenter,R., Coen,C., Science,299,1404-1407(2003)
【非特許文献３】Ohta,M.,Matsui,K.,Hiratsu,K.,Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M.,The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001
【非特許文献４】Hiratsu,K.,Ohta,M.,Matsui,K.,Ohme-Takagi,M.,FEBS Letters 514(2002)351-354
【非特許文献５】Lincoln,C., Long,J., Yamaguchi,J., Serikawa,K., Hake,S., The Plant Cell, Vol.6,1859-1876,December,1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来、転写因子をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的手法により葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比を改変する技術は知られていなかった。
【０００９】
本発明の目的は、転写因子をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的手法を用いて、短期間で簡便に、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＴＣＰドメインを有するＴＣＰファミリータンパク質であってその機能が明らかにされていない転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体内で生産させることにより、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体が得られることを初めて見出した。また、同じ転写因子を植物体内で過剰に生産させたところ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体が得られることも見出した。また、これらの知見から、このようなＴＣＰ転写因子は葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子であることを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法は、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、該転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制させ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変することを特徴としている。
【００１２】
これにより、上記キメラタンパク質は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を効果的に抑制することができる。それゆえ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されるという効果を奏する。
【００１３】
上記植物体の生産方法は、転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることが好ましい。また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００１４】
これにより、上記キメラタンパク質を形質転換された上記植物細胞内で発現させることができる。それゆえ、該キメラタンパク質が標的遺伝子の転写を抑制し、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されるという効果を奏する。
【００１５】
上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質。
【００１６】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｄ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比に関する葉の形態形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１７】
上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００１８】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることが好ましい。
【００１９】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであってもよい。（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、任意の転写因子を転写抑制因子に転換スル機能を有するペプチド。
【００２０】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２１】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２２】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９、又は６０に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００２３】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００２４】
上記機能性ペプチドが、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド又は上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の転写（発現）を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００２５】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子を植物体で過剰に生産させることにより、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変するものであってもよい。
【００２６】
これにより、過剰に生産された上記転写因子は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を促進することができる。それゆえ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変されるという効果を奏する。
【００２７】
上記植物体の生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子を発現するように、上記転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることが好ましい。また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００２８】
これにより、上記転写因子を形質転換された上記植物細胞内で過剰に発現させることができる。それゆえ、転写因子が標的とする遺伝子の転写が促進され、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変されるという効果を奏する。
【００２９】
上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質。
【００３０】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｄ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比に関する葉の形態形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【００３１】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変されていることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００３２】
また、本発明にかかる植物体の葉の形態改変キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。
【００３３】
また、本発明にかかる植物体の葉の形態改変キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むものであってもよい。
【００３４】
また、上記植物体の葉の形態改変キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【００３５】
また、本発明にかかる葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体の生産方法は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質をコードする遺伝子、
（ａ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質、
或いは、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子、
（ｃ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｄ）配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴としている。
【発明の効果】
【００３６】
すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法は、以上のように、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、該転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制させ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変することを特徴としている。
【００３７】
これにより、上記キメラタンパク質は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を効果的に抑制することができる。それゆえ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されるという効果を奏する。
【００３８】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、以上のように、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子を植物体で過剰に生産させることにより、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変することを特徴としている。
【００３９】
これにより、過剰に生産された上記転写因子は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を促進することができる。それゆえ、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変されるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
本発明は葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体を生産する技術であって、その１つは葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させるものである。また、その１つは上記転写因子を植物体で過剰に生産させるものである。
【００４２】
上記キメラタンパク質を植物体で生産させることによって得られる植物体では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制されるため、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体を生産することができる。
【００４３】
上記キメラタンパク質を生産させる方法では、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されることは次のようにして起こる。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、得られる植物体の葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変させることができる。
【００４４】
また、上記転写因子を植物体で過剰に生産させることによって得られる植物体では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が促進されるため、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体を生産することができる。
【００４５】
本発明の生産方法で生産される葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体とは、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体と葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体とを含む概念である。葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体とは、少なくとも、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きく又は小さくなるように改変された植物体であればよい。したがって、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体は、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変されたのみで他の葉の形態は改変されていない植物体であってもよいし、又は、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変されると同時に他の葉の形態も改変された植物体であってもよい。これらのうちでも、葉の形態が改変された植物体は、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変されたのみで他の葉の形態は改変されていない植物体であることがより好ましい。また、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変されると同時に他の葉の形態がわずかに改変されていてもよい。かかる植物体としては、例えば、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変されると同時に、葉身の周辺部表面が湾曲した植物体を挙げることができる。また、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されることにより、葉身は例えば、楕円形から円形に近い形に変化する。同様に、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変されることにより、葉身は例えば、楕円形からより縦長の楕円形に変化する。したがって、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体は、葉身の形状が変化した植物体と見ることもできる。葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されるとは、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が、改変前と比較して増加していれば特に限定されるものではない。また、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変されるとは、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が、改変前と比較して減少していれば特に限定されるものではない。なお、葉身の基部先端部軸方向とは、葉身の基部と先端部とを結ぶ軸に沿った方向をいい、側方軸方向とは、葉身の面上において上記基部先端部軸方向と垂直な方向をいう。
【００４６】
以降の説明では、本発明にかかる葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体の生産方法、本発明にかかる葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体の生産方法、これらの生産方法により得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。
【００４７】
（Ｉ）葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体の生産方法
（Ｉ−１）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。
【００４８】
また、本発明で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して優性に作用するものである。すなわち、本発明にかかるキメラタンパク質は植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する遺伝子の発現を一様に抑制できる。それゆえ、上記キメラタンパク質が導入された植物体を、効果的に、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体に形質転換することができる。
【００４９】
以下に、上記転写因子及び機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００５０】
（Ｉ−１−１）葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子であれば特に限定されるものではない。かかる転写因子は、植物界で広く保存されている。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有する転写因子が含まれる。
【００５１】
このような転写因子としては、ＴＣＰドメインを含んだ転写因子であるＴＣＰ５、ＴＣＰ１３、ＴＣＰ１７等を挙げることができるが、上記転写因子はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、シロイヌナズナのＴＣＰ５タンパク質、ＴＣＰ１３タンパク質、ＴＣＰ１７タンパク質を挙げることができる。
【００５３】
ＴＣＰ５タンパク質は、配列番号１３７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、ＴＣＰ１３タンパク質は、配列番号１３９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、ＴＣＰ１７タンパク質は、配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明では、例えば、このＴＣＰ５タンパク質、ＴＣＰ１３タンパク質又はＴＣＰ１７タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＴＣＰ５タンパク質、ＴＣＰ１３タンパク質又はＴＣＰ１７タンパク質を転写抑制因子に転換させる。
【００５４】
また、本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１３７、１３９又は１４１にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＴＣＰ５タンパク質、ＴＣＰ１３タンパク質、又はＴＣＰ１７タンパク質に限定されるものではなく、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子であればよい。具体的には、配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「配列番号１３７、１３９又は１４１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５５】
また、本発明で用いられる、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。そのため、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比を改変させたい個々の植物体において、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子やその遺伝子を必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナで構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体を生産できる。
【００５６】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００５７】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＴＣＰ５タンパク質を用いる場合には、このＴＣＰ５タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＴＣＰ５遺伝子と称する）を挙げることができる。ＴＣＰ５遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号１３８に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５８】
また、例えば、転写因子としてＴＣＰ１３タンパク質を用いる場合には、このＴＣＰ１３タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＴＣＰ１３遺伝子と称する）を挙げることができる。ＴＣＰ１３遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号１４０に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５９】
また、例えば、転写因子としてＴＣＰ１７タンパク質を用いる場合には、このＴＣＰ１７タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＴＣＰ１７遺伝子と称する）を挙げることができる。ＴＣＰ１７遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号１４２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００６０】
もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号１３８、１４０又は１４２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００６１】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００６２】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子をコードする遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００６３】
（Ｉ−１−２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７、非特許文献１・２等参照）を挙げることができる。
【００６４】
本発明者は、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献１〜４参照）。また、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献６参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００６５】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００６６】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００６７】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
（Ｉ−１−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸又は２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６８】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６９】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７０】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１及びＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４０、４１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列である。
【００７１】
（Ｉ−１−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸又は２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７２】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００７３】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７４】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１及びＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４２、４３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４４に示す。
【００７５】
（Ｉ−１−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００７６】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸又は２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７７】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。
【００７８】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときに容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００７９】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４５〜５３に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４５、４６又は４７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４８、４９又は５０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５１、５２又は５３に示すアミノ酸配列である。
【００８０】
（Ｉ−１−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５４に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５４に示すアミノ酸配列である。
【００８１】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００８２】
（Ｉ−１−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００８３】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）又は（ｆ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【００８４】
上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００８５】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法又はGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００８６】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００８７】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００８８】
（Ｉ−１−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００８９】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００９０】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９、又は６０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２９、３０、３２、３４、１３３、５９、又は６０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６又は３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１、又は３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３又は２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００９１】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３８又は３９で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００９２】
（Ｉ−１−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−１−２）及び（Ｉ−１−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００９３】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（Ｉ−２）の項で詳細に説明する。
【００９４】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００９５】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１、５５、又は５７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、２、５６、又は５８に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜３９、１３３、５９、６０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００９６】
【表１】


【００９７】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００９８】
（Ｉ−２）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ−１）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子が標的とする遺伝子の転写（発現）を抑制する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００９９】
（Ｉ−２−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−１−２）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【０１００】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【０１０１】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【０１０２】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【０１０３】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーター及び上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【０１０４】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【０１０５】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【０１０６】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【０１０７】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【０１０８】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、及び転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１０９】
キメラ遺伝子の構築及び発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１１０】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１１１】
（Ｉ−２−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（Ｉ−２−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ−１）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１１２】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。
【０１１３】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１１４】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１１５】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−２−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１１６】
（Ｉ−２−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１１７】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのものの葉の形態から選抜してもよい。例えば、葉の形態から選抜する例としては、形質転換体の葉の形態を、形質転換していない植物体の葉の形態と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。特に葉の形態は、単に比較するだけでも選抜が可能になるとともに、葉の形態の改変という本発明の効果そのものも確認することができる。
【０１１８】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖又は無性生殖により単に葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１１９】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１２０】
（ＩＩ）葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された植物体の生産方法
（ＩＩ−１）本発明で用いられる転写因子
本発明で用いられる上記転写因子及び上記転写因子をコードする遺伝子については、上記（Ｉ−１−１）で説明したのでここでは、説明を省略する。
【０１２１】
本発明では、上記転写因子をコードする遺伝子を用いれば、上記転写因子を植物体で過剰に生産することができる。具体的には、上記転写因子をコードする遺伝子を、当該遺伝子が発現するように植物体に導入する。これにより、上記転写因子を過剰に生産することができる。
【０１２２】
（ＩＩ−２）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ−１−１）で説明した転写因子を植物体で過剰に生産させ、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子が標的とする遺伝子の転写（発現）を促進する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【０１２３】
（ＩＩ−２−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【０１２４】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【０１２５】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーター及び上記遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。
【０１２６】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、及び転写因子をコードする遺伝子並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１２７】
発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記転写因子をコードする遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１２８】
なお、上記組換え発現ベクターの母体となるベクター、上記プロモーター、上記他のＤＮＡセグメント、ターミネーター、選別マーカー、翻訳効率を高めるための塩基配列、及び組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）については、上記（Ｉ−２−１）と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【０１２９】
（ＩＩ−２−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−２−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記転写因子を生産させるようになっていればよい。
【０１３０】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（ＩＩ−２−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１３１】
なお、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）及び上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞については、上記（Ｉ−２−２）と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【０１３２】
（ＩＩ−２−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１３３】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記転写因子をコードする遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖又は無性生殖により単に葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように改変された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１３４】
なお、選抜の方法及び本発明における植物体については、上記（Ｉ−２−３）と同様であるので、ここでは説明を省略する。
【０１３５】
（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質を植物体で生産させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、得られる植物体の葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように葉の形態を改変することができる。また、本発明にかかる植物体の他の生産方法は、上記転写因子を植物体で過剰に生産させることによる。これにより、当該転写因子が標的とする標的遺伝の転写が促進される。その結果、得られる植物体の葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなるように葉の形態を改変することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１３６】
（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかる葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、かかる葉の形態の改変によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等を挙げることができる。
【０１３７】
（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明では、植物体の葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比を改変することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、そのような改変により効果がある分野であればよい。かかる分野としては、例えば、新規な園芸品種の創出への応用、植物栽培の省スペース化等への応用等を挙げることができる。
【０１３８】
まず、新規な園芸品種の創出への応用例について説明すると、例えば、本発明に係る植物体の生産方法を用いることにより、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比に大きな変化をもつ新規な観葉植物や花卉植物を作出することができる。
【０１３９】
また、植物栽培の省スペース化について説明すると、例えば、葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変された植物体は、少ない空間により多くの植物を栽培することが可能となる。それゆえ植物栽培の省スペース化に寄与することが期待される。
【０１４０】
（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち葉の形態改変キットを挙げることができる。
【０１４１】
この葉の形態改変キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいるものを挙げることができる。また、上記葉の改変キットは、上記転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいるものであってもよい。また、本発明にかかる葉の形態改変キットは、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１４２】
以下、実施例及び図１ないし図８に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１４３】
〔実施例１〕
以下の実施例１においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドをＴＣＰ５遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１４４】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１４５】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１４３）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１４４）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１４５）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１４６）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１４６】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１４７】
（３）以下の配列番号１４７、１４８の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４７、１４８の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号１４７）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号１４８）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１４８】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１４９】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5'-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3'（配列番号１４９）
5'-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3'（配列番号１５０）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
【０１５０】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図３に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１５１】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１５２】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収した。
【０１５３】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１５４】
＜構築用ベクターへのＴＣＰ５遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＴＣＰ５タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１５５】
（１）シロイヌナズナ葉から調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＴＣＰ５遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＴＣＰ５−Ｆ）5'-ATGAGATCAGGAGAATGTGATG-3'（配列番号１５１）
プライマー２（ＴＣＰ５−Ｒ stopless）5'-AGAATCTGATTCATTATCGCTAC-3'（配列番号１５２）
ＴＣＰ５遺伝子のｃＤＮＡ及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３８及び１３７に示す。
【０１５６】
（２）得られたＴＣＰ５コード領域のＤＮＡ断片を、図２に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１５７】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１５８】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１５９】
（１）まず、ＴＣＰ５コード領域のＤＮＡ断片が順方向に挿入されたｐ３５ＳＴＣＰ５ＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）５．５μＬを加えた。
【０１６０】
（２）この溶液にＬＲ clonase４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１６１】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１６２】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
【０１６３】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell １９８６))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、下表２）に懸濁した。
【０１６４】
【表２】


【０１６５】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Triton Ｘ-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
【０１６６】
【表３】


【０１６７】
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＣＰ５ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１６８】
ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体及び野生型の植物体を図４に示す。図４中、左端（図中ＷＴと表示）は野生型の植物体、中央（図中＃１と表示）及び右端（図中＃２と表示）はｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体を示す。図４に示すように、シロイヌナズナの野生型の葉身は楕円形であるのに対して、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナの葉身は、基部先端部軸方向の長さに対して、側方軸方向の長さが長く、円形に近い形状を示し、さらに強い表現型を示す形質転換植物体の葉では、葉身の周辺部表面が湾曲、すなわち葉身の周辺部表面が捲れる形状を示した。このように、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナの葉身は、基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されていた。
【０１６９】
〔実施例２〕
転写因子をコードする遺伝子として、シロイヌナズナ由来のＴＣＰ１３遺伝子を用いた以外は〔実施例１〕と同様にして、組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ１３ＳＲＤＸを構築し、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１７０】
ＴＣＰ１３遺伝子は、シロイヌナズナ葉から調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＴＣＰ１３遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅することにより得た。
プライマー１（ＴＣＰ１３−Ｆ）5'-ATGAATATCGTCTCTTGGAAAGATG-3'（配列番号１５３）
プライマー２（ＴＣＰ１３−Ｒ stopless）5'-CATTTGCCTCGGATCTAATGTG-3'（配列番号１３４）
ＴＣＰ１３遺伝子のｃＤＮＡ及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４０及び１３９に示す。
【０１７１】
蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＣＰ１３ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１７２】
ｐＢＩＧ−ＴＣＰ１３ＳＲＤＸで形質転換された植物体を図５に示す。図５に示されるように、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ１３ＳＲＤＸで形質転換された植物体も、基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されていた。
【０１７３】
〔実施例３〕
転写因子をコードする遺伝子として、シロイヌナズナ由来のＴＣＰ１７遺伝子を用いた以外は〔実施例１〕と同様にして、組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ１７ＳＲＤＸを構築し、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１７４】
ＴＣＰ１７遺伝子は、シロイヌナズナ葉から調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＴＣＰ１７遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅することにより得た。
プライマー１（ＴＣＰ１７−Ｆ）5'-ATGGGAATAAAAAAAGAAGATCAG-3'（配列番号１３５）
プライマー２（ＴＣＰ１７−Ｒ stopless）5'-CTCGATATGGTCTGGTTGTGAG-3'（配列番号１３６）
ＴＣＰ１７遺伝子のｃＤＮＡ及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４２及び１４１に示す。
【０１７５】
蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＣＰ１７ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１７６】
ｐＢＩＧ−ＴＣＰ１７ＳＲＤＸで形質転換された植物体を図６に示す。図６に示されるように、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ１７ＳＲＤＸで形質転換された植物体も、基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が大きくなるように改変されていた。
【０１７７】
〔実施例４〕
以下の実施例４においては、シロイヌナズナ由来のＴＣＰ５遺伝子をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流につないで組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換し、ＴＣＰ５を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
【０１７８】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
実施例１と同様にして、図１に示すように、形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを構築した。
【０１７９】
＜形質転換用ベクターの構築＞
実施例１と同様にして、図３に示すように、形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを構築した。
【０１８０】
＜構築用ベクターへのＴＣＰ５遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＴＣＰ５タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１８１】
（１）シロイヌナズナ葉から調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、シロイヌナズナＴＣＰ５遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＴＣＰ５−Ｆ）5'-ATGAGATCAGGAGAATGTGATG-3'（配列番号１５４）
プライマー２（ＴＣＰ５−Ｒ）5'-TCAAGAATCTGATTCATTATCGCTAC-3'（配列番号１５５）
ＴＣＰ５遺伝子のｃＤＮＡ及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３８及び１３７に示す。
【０１８２】
（２）得られたＴＣＰ５コード領域のＤＮＡ断片を、図７に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１８３】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離した。
【０１８４】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＴＣＰ５遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を用いた以外は、〔実施例１〕と同様に、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。
【０１８５】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、上記ＴＣＰ５遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＴＣＰ５を用いた以外は、〔実施例１〕と同様にしてシロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。
【０１８６】
蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＣＰ５の遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１８７】
３５Ｓ−ＴＣＰ５を用いてＴＣＰ５を過剰発現させた形質転換植物体及び野生型の植物体を図８に示す。図８中、左端（図中ＷＴと表示）は野生型の植物体、中央（図中＃１と表示）及び右端（図中＃２と表示）は３５Ｓ−ＴＣＰ５で形質転換された植物体を示す。図８に示すように、シロイヌナズナの野生型の葉身は楕円形であるのに対して、３５Ｓ−ＴＣＰ５で形質転換されたシロイヌナズナの葉身は、基部先端部軸方向の長さに対して、側方軸方向の長さが極端に短くなった。このように、３５Ｓ−ＴＣＰ５でＴＣＰ５を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換体の葉身は、基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が小さくなっていた。このように、本実施例と〔実施例１〕とでは、形質転換された植物体は相反する表現型を示すことがわかった。このことから、ＴＣＰ５転写因子は、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
このように、本発明では、葉身の基部先端部軸方向の伸長生長の制御に関与する転写因子が標的とする遺伝子の転写を抑制又は促進することによって葉身の基部先端部軸方向の長さに対する側方軸方向の長さの比が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や林業、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例１において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子とＴＣＰ５遺伝子とを組み込む工程図である。
【図３】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図４】野生型のシロイヌナズナの葉及び組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの葉を示す図である。
【図５】組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ１３ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの葉を示す図である。
【図６】組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ１７ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの葉を示す図である。
【図７】実施例４において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、ＴＣＰ５遺伝子を組み込む工程図である。
【図８】野生型のシロイヌナズナの葉及びカリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターでＴＣＰ５遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体の葉を示す図である。
【出願人】 【識別番号】５０３３６０１１５
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】３０１０２１５３３
【氏名又は名称】独立行政法人産業技術総合研究所
【出願日】 平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【代理人】 【識別番号】１０００８００３４
【弁理士】
【氏名又は名称】原 謙三
【公開番号】 特開２００６−６２４８（Ｐ２００６−６２４８Ａ）
【公開日】 平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願番号】 特願２００４−１９０２５８（Ｐ２００４−１９０２５８）