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【発明の名称】 リガンド−レセプター相互作用検出方法
【発明者】 【氏名】野島 高彦

【氏名】大塚 圭一

【氏名】竹中 繁織

【要約】 【課題】生体分子アレイの調製における煩雑さを軽減し、更にマスキングを行わずに測定を行うことが可能な、リガンド-レセプター相互作用検出方法を提供すること。

【解決手段】リガンド候補分子のそれぞれを、二本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたものの集合体を担体に固相化し、レセプター-リガンドの相互作用を生じさせた後、二本鎖オリゴヌクレオチドを配列特有的に反応系より取り出し、これをレセプターに関しての検出にかける。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数種類の二本鎖ヌクレオチド群中の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、互いにクロスハイブリダイゼーションを起こさない配列を有するそれぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の末端に、特定のレセプターに対する複数種類のリガンド候補分子のそれぞれを共有結合させたコンジュゲートの集合体を含むコンジュゲート溶液を担体に接触し、コンジュゲートを担体に固相化する工程(A);
前記工程(A)後に、前記レセプターが含まれる溶液を、前記コンジュゲートが固相化された担体に対して接触し、一定時間保持する工程(B);
前記工程(B)後に、前記担体のコンジュゲート固相化面を、リガンド候補分子とレセプターとの間に形成される可能性のある複合体が解離しない条件下で洗浄する工程(C);
前記工程(C)後に、前記のそれぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドにおいてリガンド候補分子が結合していない鎖と同一の配列を含む、少なくとも1種類の一本鎖オリゴヌクレオチドが含まれる溶液を、前記担体のコンジュゲート固相化面に接触し、当該リガンド候補分子が結合している鎖と、当該一本鎖オリゴヌクレオチドとの間において特異的なハイブリダイゼーションを行わせる工程(D);
前項工程(D)後に、前記担体のコンジュゲート固相化面に存在する溶液を当該担体から回収する工程(E);及び
前記工程(E)で回収された溶液を、前記レセプターに関しての検出にかける工程(F);
を含む、特定レセプターに対するリガンド候補分子のスクリーニング方法。
【請求項2】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれが、10乃至15merの範囲の長さを有し、それぞれのTm値が、20℃乃至60℃の範囲内で互いに+/-10℃にある、請求項1に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
前記工程(F)が、質量分析、電気泳動、クロマトグラフィー、又は蛍光標識若しくは同位体標識検出の何れかである、請求項1に記載のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、リガンド-レセプター相互作用検出方法に関するものであり、より具体的には、レセプターとして機能する蛋白質等に対するリガンド候補低分子をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞内情報伝達に関わる蛋白質や、レセプターとしての機能が知られている蛋白質に対して、特異的に結合する低分子化合物の開発は、創薬の観点から非常に重要な課題である。実際に多くの製薬企業においては、レセプターの詳細構造を基に低分子の設計を行い、それらの設計された低分子がレセプターに特異的に結合するかどうかを逐一確認するスクリーニング試験が行われている。
【0003】
一方、既に調製されている低分子化合物群に対して特異的に結合しうる蛋白質を生体中から見つけ出すことも、創薬及び生命現象解明のために必要な作業である。このような目的のために、近年開発が試みられている手法の一つが生体分子チップである。
【非特許文献1】マクベスら(MacBeath, G. et al.)、“Printing Proteins as Macroarrays for High-Throughput Function Determination”、サイエンス(Science)、(米国)、2000年、第289巻、p.1760-1763
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
生体分子チップを用いて低分子と蛋白質との相互作用の有無を検出する代表的な方法としては、以下の3つの工程:
(1)低分子を担体上に固相化することにより低分子アレイを調製する;
(2)当該アレイ上における低分子と蛋白質との相互作用を生じさせる;
(3)相互作用によりアレイ上に捕獲された蛋白質を検出する;
を含むものを挙げることができる。
【0005】
上記(1)の工程においては、それぞれの低分子を、アレイ上の微小領域(スポット;直径が数十μm程度の領域)に種類ごとに個別に固相化する作業が行われるが、この作業には、スポッターとか、アレイヤーと呼ばれる装置が使用されている。
【0006】
低分子を担体上に固相化する方法としては、物理的吸着が最も簡便な方法であるが、担体上に固相化される低分子の量を制御すること、及び担体上での低分子の配向性を制御することが困難又は不可能であるという問題が存在する。
【0007】
一方、低分子を化学的に担体へ結合させる方法としては、リンカーと呼ばれる低分子を、固相化用低分子の一方の末端に結合しておき、リンカーと担体上に存在する基との間に化学的結合を生じさせる方法もある。
【0008】
上記(2)の工程においては、低分子と蛋白質との間の特異的な相互作用(結合)を生じさせることを目的としているが、蛋白質が担体表面に非特異的に吸着すると、後の工程(3)において当該蛋白質が検出されることとなり、擬陽性の問題を生じてしまう。そのため、マスキングと呼ばれる技術により、担体には上記のような非特異的吸着を防止する処理が施される。しかしその場合であっても、相互作用を検出する蛋白質との間で相互作用しないマスキング剤を選定することや、またマスキング操作自体が、測定を煩雑化しているという問題が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、斯かる問題に鑑みてなされたものであり、下記の構成をとることを特徴としている。
即ち本発明の特定レセプターに対するリガンド候補分子のスクリーニング方法は、
複数種類の二本鎖ヌクレオチド群中の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、互いにクロスハイブリダイゼーションを起こさない配列を有するそれぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の末端に、特定のレセプターに対する複数種類のリガンド候補分子のそれぞれを共有結合させたコンジュゲートの集合体を含むコンジュゲート溶液を担体に接触し、コンジュゲートを担体に固相化する工程(A);
前記工程(A)後に、前記レセプターが含まれる溶液を、前記コンジュゲートが固相化された担体に対して接触し、一定時間保持する工程(B);
前記工程(B)後に、前記担体のコンジュゲート固相化面を、リガンド候補分子とレセプターとの間に形成される可能性のある複合体が解離しない条件下で洗浄する工程(C);
前記工程(C)後に、前記のそれぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドにおいてリガンド候補分子が結合していない鎖と同一の配列を含む、少なくとも1種類の一本鎖オリゴヌクレオチドが含まれる溶液を、前記担体のコンジュゲート固相化面に接触し、当該リガンド候補分子が結合している鎖と、当該一本鎖オリゴヌクレオチドとの間において特異的なハイブリダイゼーションを行わせる工程(D);
前項工程(D)後に、前記担体のコンジュゲート固相化面に存在する溶液を当該担体から回収する工程(E);及び
前記工程(E)で回収された溶液を、前記レセプターに関しての検出にかける工程(F);
を含むことを特徴としている。
【0010】
本発明のスクリーニング方法においては、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれが、10乃至15merの範囲の長さを有し、それぞれのTm値が、20℃乃至60℃℃の範囲内で互いに+/-10℃にあることが望ましい。
また、本発明のスクリーニング方法においては、前記工程(F)が、質量分析、電気泳動、クロマトグラフィー、又は蛍光標識若しくは同位体標識検出の何れかとすることが可能である。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、固相化する低分子の種類ごとに、担体上の微小領域に個別に当該低分子をスポットする作業が不必要になり、低分子の混合物からなる溶液を担体に一度に適用するだけよい。そのため、アレイの調製にかかる手間を大幅に削減することが可能になる。
更に本発明によれば、従来法における担体上の各スポット毎の固相化効率を考慮する必要がなくなる。
【0012】
また本発明によれば、低分子(リガンド)と蛋白質(レセプター)との相互作用前に、担体をマスキングする必要がなくなり、アレイの調製時間を更に短縮することが可能になる。
本発明によればまた、実験目的に応じて、種々の検出系の中より最適の検出方法を選択することができ、いずれの場合にも、従来の可視化アレイの手動解析を行う必要がなくなる。
【0013】
更に本発明によれば、従来の微小領域に各低分子をスポットしていた場合と比較して、固相化領域が顕著に増大しているため、単位面積あたりの低分子固相化量の増大を引き起こし、結果として検出感度の上昇を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
本発明の、特定レセプターに対するリガンド候補分子のスクリーニング方法においては、まず、以下の工程(A):
複数種類の二本鎖ヌクレオチド群中の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、互いにクロスハイブリダイゼーションを起こさない配列を有するそれぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の末端に、特定のレセプターに対する複数種類のリガンド候補分子のそれぞれを共有結合させたコンジュゲートの集合体を含むコンジュゲート溶液を担体に接触し、コンジュゲートを担体に固相化する工程;
を行う。
【0015】
工程(A)においては、複数のリガンド候補分子のそれぞれを、互いにクロスハイブリダイゼーションを起こさない配列を有する二本鎖ヌクレオチドと共有結合させたものをまず調製しておく。ここで各リガンド候補分子は、当該二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の末端に共有結合されてコンジュゲートを形成する。二本鎖オリゴヌクレオチドのうち、リガンド候補分子と結合しないもう一方の5’末端には、チオール基等の反応基、又はビオチン-ストレプトアビジン等の生物学的に特異的な結合を生じる結合対の一方の物質を予め導入しておく。そしてこれと、担体の固相化面に存在しているか、又は予め導入された基若しくはビオチン-ストレプトアビジンなどの生物学的に特異的な結合を生じる結合対の一方の物質であって、上記二本鎖ヌクレオチドには導入されなかった方との間に結合を生じさせることにより、担体上にコンジュゲートを固相化する。
【0016】
本願発明において使用する二本鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれは、10乃至15merの範囲の長さを有し、それぞれのTm値が、20℃乃至60℃の範囲内で互いに+/-10℃にあることが望ましい。この範囲にあることにより、後の工程で一本鎖オリゴヌクレオチドとの間にハイブリダイゼーション(鎖交換反応)を起こさせる時に、リガンド-レセプター複合体を解離させる可能性が低いと考えられ、レセプターに対する結合力の弱いリガンドのスクリーニングが可能になると考えられるためである。
【0017】
次に、以下の工程(B):
前記工程(A)後に、前記レセプターが含まれる溶液を、前記コンジュゲートが固相化された担体に対して接触し、一定時間保持する工程;
を行う。
【0018】
工程(B)においては、特定レセプターを含む溶液を、工程(A)でコンジュゲートが固相化された担体上に接触し、コンジュゲート混合物中の各コンジュゲートに結合したそれぞれのリガンド候補分子と、特定レセプターとの間での接触を可能にする。ここでリガンド候補分子が真に当該レセプターに対するリガンドである場合には、そのリガンドはレセプターへ配位する。従って、工程(B)においては、特定レセプターを含む溶液の組成は、リガンド-レセプター複合体が効率よく形成され、尚且つ一旦形成された複合体が解離しないと考えられるものとし、複合体形成反応が十分に進むと考えられる条件におくことが必要である。このような組成、及び条件は、特定レセプターの性質等を、当業者らが考慮することにより決定することができるものである。
【0019】
次に、以下の工程(C):
前記担体のコンジュゲート固相化面を、リガンド候補分子とレセプターとの間に形成される可能性のある複合体が解離しない条件下で洗浄する工程;
を行う。
【0020】
工程(C)においては固相化面の洗浄を行っているが、洗浄溶液の組成としては、上記特定レセプター溶液から当該特定レセプターを除外する以外は当該レセプター溶液と同じ組成のもののほか、形成された複合体が解離しないと考えられる組成、形成された複合体を安定化させる組成とすることもできる。洗浄に使用する溶液の量、時間に関しては、形成すると推定される複合体の性質に鑑みて、当業者らが決定することができるが、一般には、コンジュゲート混合液の数倍程度の積算溶液量で、数十秒乃至数分間洗浄する。
【0021】
次に、以下の工程(D):
前記工程(C)後に、前記のそれぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドにおいてリガンド候補分子が結合していない鎖と同一の配列を含む、少なくとも1種類の一本鎖オリゴヌクレオチドが含まれる溶液を、前記担体のコンジュゲート固相化面に接触し、当該リガンド候補分子が結合している鎖と、当該一本鎖オリゴヌクレオチドとの間において特異的なハイブリダイゼーションを行わせる工程;
を行う。
【0022】
この工程においては、固相化された二本鎖オリゴヌクレオチドと、その当該二本鎖オリゴヌクレオチド中でリガンド候補分子が結合していない鎖と同一の配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドとの間で、鎖交換反応を起こさせる。この鎖交換反応は、上記工程(C)の洗浄工程と同様にして、形成されている可能性のあるリガンド-レセプター複合体が解離しないと考えられる条件下で行う。より具体的には、二本鎖オリゴヌクレオチドのTm値を考慮して、二本鎖が解離するが、当該複合体が解離しないと考えられる温度にまで上昇させ、その後、当該一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下で、特異的ハイブリダイゼーションが形成される温度にまで下降し、そこで一定時間温度を保持することにより行われる。
【0023】
鎖交換反応を起こさせる二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1種類である。一度に鎖交換反応を起こさせる二本鎖オリゴヌクレオチドが1種類のみの場合とは、工程(D)において導入する一本鎖オリゴヌクレオチドが1種類の場合であり、リガンド候補分子を一つずつ絞り込む方法である。この場合、後のレセプター検出工程(F)において陽性であった場合には、当該一種類のオリゴヌクレオチドが鎖交換反応を起こした二本鎖オリゴヌクレオチドに結合していたリガンド候補分子が、真のリガンドであることが判明する。
【0024】
一方、鎖交換反応を起こさせる二本鎖オリゴヌクレオチドが2種類以上である場合とは、徐々にリガンド候補分子の絞込みを行う方法である。この方法においては、例えば1000種類のリガンド候補分子が担体に固相化されている場合、最初に500種類の一本鎖オリゴヌクレオチドとの鎖交換反応を起こさせ、レセプター検出において陽性であった場合には、その500種類の一本鎖オリゴヌクレオチドと鎖交換反応を起こした二本鎖オリゴヌクレオチドに、真のリガンドが結合していると判断する。一方、上記500種類の一本鎖オリゴヌクレオチドとの鎖交換反応後のレセプター検出反応において陰性であった場合には、もう一方の500種類の方にリガンド分子が含まれると判断する。そして、更に絞込みを行うために、真のリガンド分子がコンジュゲートした二本鎖オリゴヌクレオチドと鎖交換を生じる、当該500種類の一本鎖オリゴヌクレオチドから、250種類のオリゴヌクレオチドを選択し、レセプター検出が陽性であるか、陰性であるかを見極め、最終的に1種類の一本鎖オリゴヌクレオチドにまで絞込みを行う。
【0025】
一本鎖オリゴヌクレオチドを一種類ずつ鎖反応にかける場合には、1000種類のリガンド候補分子中に、一種類の真のリガンド分子がある場合には、最大で1000回の測定を行う必要があるが、上記のように、一度に複数種類の一本鎖オリゴヌクレオチドを鎖交換反応にかける場合には、レセプター検出反応の数を大幅に削減することが可能である。例えば500、250、125、・・・のように、鎖反応にかける一本鎖オリゴヌクレオチドの数を半減させつつ、陽性・陰性を判定する場合、最短で10回の測定で特定の一種類のリガンド分子を特定することが可能になる。
【0026】
この工程(D)において導入する一本鎖オリゴヌクレオチドは、鎖交換反応が効果的に行われ、更に一旦解離した二本鎖が同一の相補鎖と再び結合する確率が十分に低くなるように、二本鎖オリゴヌクレオチドに対して少なくとも数倍、好ましくは10倍乃至1000倍の範囲のモル比とすることが望ましい。
【0027】
次に、以下の工程(E):
前記担体のコンジュゲート固相化面に存在する溶液を当該担体から回収する工程;
を行う。
【0028】
ここでは、上記工程(D)において、鎖交換反応により担体から遊離した一本鎖オリゴヌクレオチド及び、鎖交換反応により担体上の二本鎖オリゴヌクレオチドとして取り込まれなかった未反応一本鎖オリゴヌクレオチドからなる混合物が回収される。
【0029】
次に、以下の工程(F):
前記工程(E)で回収された溶液を、前記レセプターに関しての検出にかける工程;
を行う。
【0030】
ここでは、上記工程(D)で導入した一本鎖オリゴヌクレオチドと鎖交換を起こした二本鎖オリゴヌクレオチドに、リガンド-レセプター複合体が形成されている場合には、当該レセプター、又はリガンド-レセプター複合体に固有の性質に基づき、これを検出することが可能である。検出対象物が蛋白性のレセプターであれば、固有の分光学的スペクトルを有すると考えられ、また、複合体の場合には、質量、ゲル内での泳動度や、カラム内での移動速度に特徴的な性質が帯びるので、これを検出することにより、リガンド候補分子が真のリガンド分子であるか否かを判定することが可能になる。また、予め導入しておいた標識(蛍光標識や同位体標識)を検出することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【0031】
本発明は、創薬における、特定レセプターへのリガンド分子のスクリーニングに適用することが可能であるのみならず、生細胞に対する糖鎖やペプチドの結合の解析、更に医用高分子材料に対するペプチド等の結合の解析等へも適用することが可能である。

【出願人】 【識別番号】596057011
【氏名又は名称】竹中 繁織
【識別番号】504196414
【氏名又は名称】野島 高彦
【出願日】 平成16年5月20日(2004.5.20)
【代理人】 【識別番号】100064908
【弁理士】
【氏名又は名称】志賀 正武

【識別番号】100108578
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 詔男

【識別番号】100089037
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 隆

【識別番号】100101465
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 正和

【識別番号】100094400
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 三義

【識別番号】100107836
【弁理士】
【氏名又は名称】西 和哉

【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦

【公開番号】 特開2005−331387(P2005−331387A)
【公開日】 平成17年12月2日(2005.12.2)
【出願番号】 特願2004−150357(P2004−150357)