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【発明の名称】 ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法
【発明者】 【氏名】池袋 一典

【要約】 【課題】PCR産物を二本鎖のまま特異的に検出しうる測定系を開発し、標的核酸を特異的に検出する方法を提供すること。

【解決手段】検体中の標的核酸を検出する方法であって、
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体中の標的核酸を検出する方法であって、
(a)プライマー対を用いて検体中の核酸をPCR反応により増幅させ、ここで、前記プライマー対は、前記標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がPCR反応により増幅されるよう設計されており、そして
(b)ジンクフィンガー蛋白質を用いて工程(a)で得られたPCR増幅産物を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項2】
ジンクフィンガー蛋白質が検出可能な標識により標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項3】
ジンクフィンガー蛋白質が担体上に固定化されている、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
ジンクフィンガー蛋白質がファージ上に提示される、請求項1記載の方法。
【請求項5】
ジンクフィンガー蛋白質がZif268であり、ジンクフィンガー蛋白質認識配列が5’−GCGTGGGCG−3’である、請求項1−4のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記標的核酸がSalmonella typhimuriumのgyrB遺伝子である、請求項1−5のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
検体中の標的核酸を検出するためのキットであって、前記標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がPCR反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含むキット。
【請求項8】
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をさらに含む、請求項7記載のキット。
【請求項9】
ジンクフィンガー蛋白質がファージ上に提示された形で提供される、請求項8に記載のキット。
【請求項10】
ジンクフィンガー蛋白質が担体上に固定化されている、請求項8記載のキット。
【請求項11】
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項7記載のキット。
【請求項12】
ジンクフィンガー蛋白質がZif268であり、ジンクフィンガー蛋白質認識配列が5’−GCGTGGGCG−3’である、請求項7−11のいずれかに記載のキット。
【請求項13】
前記標的核酸がSalmonella typhimuriumのgyrB遺伝子である、請求項7−11のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
標的とする遺伝子またはその中の特定の領域を検出するためには、PCR法によりこの遺伝子または領域を増幅させた後に、ハイブリダイゼーションによりPCR増幅産物を検出する方法が一般に用いられている。ハイブリダイゼーションにより検出するためには、二本鎖であるPCR増幅産物を変性させて一本鎖とした後に、プローブDNAとハイブリダイズさせる必要がある。しかし、PCR増幅産物どうしが互いに相補鎖と塩基対を形成する確率が高いため、プローブDNAのハイブリダイゼーション効率が低いこと、および、一旦解離した一本鎖が再び元の二本鎖に戻ってしまうためにハイブリダイゼーション効率が悪いという問題点があった。したがって、PCR増幅産物を二本鎖のまま検出する方法が求められている。
【0003】
二本鎖DNAを変性させずに分析する方法としては、支持体上に固定された二本鎖DNA認識物質を用いて、検体中の二本鎖DNAを分析する方法が開示されている(特開2002−125700)。この方法は、二本鎖DNA認識物質と検体中の二本鎖DNAとを結合させ、結合した二本鎖をインターカレーター、抗DNA抗体、DNA転写因子等を用いて検出することを特徴とする。しかし、この方法によっては、存在する二本鎖DNAの量を測定することは可能であっても、標的とする核酸を特異的に検出することは困難である。すなわち、インターカレーターまたは抗DNA抗体を用いて検出する場合には塩基配列の選択性がほとんど得られず、DNA転写因子を用いて検出する場合には、認識配列の長さが短いため特異性の高い検出を行うことができない。
【特許文献1】特開2002−125700
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、PCR産物を二本鎖のまま特異的に検出しうる測定系を開発し、標的核酸を特異的に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、検体中の標的核酸を検出する方法を提供する。該方法は、
(a)プライマー対を用いて検体中の核酸をPCR反応により増幅させ、ここで、該プライマー対は、該標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がPCR反応により増幅されるよう設計されており、そして、
(b)ジンクフィンガー蛋白質を用いて工程(a)で得られたPCR増幅産物を検出する、
の各工程を含むことを特徴とする。
【0006】
好ましくは、ジンクフィンガー蛋白質はZif268であり、ジンクフィンガー蛋白質認識配列が5’−GCGTGGGCG−3’である。また好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は検出可能な標識により標識されている。別の好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質はファージ上に提示される。また別の好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は担体上に固定化されている。
【0007】
別の観点においては、本発明は、検体中の標的核酸を検出するためのキットを提供する。該キットは、該標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がPCR反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含むことを特徴とする。好ましくは、該キットは、ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質、あるいはジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む。
【0008】
本発明にしたがえば、ジンクフィンガー蛋白質は二本鎖に結合するため、PCR増幅産物を変性させて一本鎖に解離させる必要がないため、より迅速な測定法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
ジンクフィンガー蛋白質とは、DNA配列に特異的に結合しうるジンクフィンガーモチーフを有する蛋白質であり、これまでに数百種類以上のジンクフィンガー蛋白質が同定されている。ジンクフィンガーモチーフは、典型的には2個のシステイン残基と2個のヒスチジン残基を含む長さ約30アミノ酸のモチーフであり、逆平衡二本鎖β構造とαヘリックスから構成され、これらの4個の残基が亜鉛イオンに配位している立体構造を有している。ジンクフィンガーモチーフは特定の配列を有する二本鎖DNAと特異的に結合することができる。例えば、マウス由来のジンクフィンガー蛋白質であるZif268は、3連のジンクフィンガーモチーフを有し、5’−GCGTGGGCG−3’の9個の連続するDNA配列を認識してこれに特異的に結合することができる。結合に際しては標的とする二本鎖DNAの主溝にαヘリックス部位を挿入するため、ジンクフィンガー蛋白質が認識するDNAの配列は、ジンクフィンガー蛋白質のαヘリックスのアミノ酸配列により決定される。これまでに、それぞれ独特のDNA配列を認識する数千種類のジンクフィンガーモチーフが同定されている。αヘリックスのアミノ酸配列と認識されるDNA配列との関係をより詳細に解明することにより、目的とする特定のDNA配列を認識するジンクフィンガー配列を設計することも可能となると考えられる。また、ファージディスプレイにより作製したジンクフィンガーペプチドのライブラリを用いて、目的とする特定のDNA配列を認識しうるジンクフィンガー配列を選択する方法が知られている。
【0010】
本発明は、このようなジンクフィンガー蛋白質を用いて、標的とする二本鎖DNAを特異性をもって検出することを特徴とする。
【0011】
本発明の方法においては、標的核酸中のジンクフィンガー蛋白質により認識される配列を増幅しうるよう設計されたプライマー対を用いてPCR増幅を行い、ジンクフィンガー蛋白質を用いてPCR増幅産物中のジンクフィンガー蛋白質認識配列を検出する。ジンクフィンガー蛋白質により認識される配列は、その長さが比較的短いため配列の出現頻度が高く、目的とする標的核酸配列中のみならず、検体中に存在しうる他の核酸中にも多数見いだされることが予測される。例えば、Zif268により認識される配列は9個の連続するヌクレオチドからなり、このような配列は約26万塩基に1個の確率で存在する。したがって、検出の特異性を高めるためには、ジンクフィンガー蛋白質認識配列の周囲の配列についての広範囲な検索を行って、適切なPCRプライマーを設計する必要がある。
【0012】
PCRプライマーは、ジンクフィンガー蛋白質により認識される配列を含む配列領域が特異的に増幅されるように設計する。このためには、まず検出すべき生物(例えば、微生物、細菌、ウイルスなど)のゲノム配列中のジンクフィンガー認識配列を検索する。例えば、ジンクフィンガー蛋白質としてZif268を用いる場合には、その認識配列であるGCGTGGGCGを含む遺伝子を同定する。次に、この認識配列の5’側および3’側の配列に基づいて、認識配列を増幅しうるプライマー対を選択する。プライマーの長さは、好ましくは12−30ヌクレオチド、より好ましくは15−25ヌクレオチドである。さらに、プライマーの選択においては、各プライマーが、分子内に二次構造を形成せず、融解温度がPCR反応に適した温度(例えば約58−63℃の範囲内)である等の、当該技術分野において知られるプライマー選定の基準も考慮すべきである。各プライマーとジンクフィンガー認識配列の間の距離は任意に選択することができ、ジンクフィンガー認識配列の5’側と3’側とでプライマーとの距離が同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、プライマーとジンクフィンガー認識配列との距離は0から500bpであり、より好ましくは0から300bpである。距離が0であるとは、後述の実施例において例示されるように、ジンクフィンガー認識配列に隣接してプライマーが配置されることを意味する。この距離が長いほど検出の特異性は高くなるが、検体中の核酸が分解・切断されていると検出されないため、糞便や生検組織切片を検体として用いる場合には、150bpより短いことが好ましい。次に、PCRにより増幅される配列、すなわち、両方のプライマーとジンクフィンガー認識配列とを含む配列について、検体中に存在する可能性のある他の核酸中にこれと相同な配列が存在しないことを確認する。このことにより、標的核酸のみが特異的に検出されるようにすることができる。
【0013】
このようにして設計されたプライマー対の各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のDNA合成装置(例えば、Applied Biosystems社製 Model 394)を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
【0014】
本発明の方法の1つの好ましい用途は、特定の細菌を近縁の細菌と区別して検出することである。例えば、Salmonella typhimuriumは、食中毒の原因菌として問題となるサルモネラの一種であり、食中毒の診断および予防のために、この細菌を他の細菌と区別して検出する必要がある。これまで、検出方法としては、制限培地による培養とその形態学的観察、血清学的検査、特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション、およびPCR増幅とハイブリダイゼーションとの組み合わせが用いられてきた。後述の実施例に詳細に説明されるように、本発明にしたがえば、Salmonella typhimuriumを他の細菌と区別して特異的に検出することができる。Salmonella typhimuriumを特異的に検出するためのPCR増幅の標的配列として好ましいものの1例は、gyrB遺伝子中のジンクフィンガー認識配列である。gyrBはDNAジャイレース(II型トポイソメラーゼ)のβサブユニットをコードする遺伝子である。この遺伝子は様々な微生物に普遍的に存在し、かつほとんどの微生物についてその配列が明らかにされている。さらに、進化速度が早く各微生物で配列が異なり、トランスポゾンのように水平伝搬するものではないため種特異的である、という特徴を有するため、微生物の同定の指標として使用されている。したがって、このgyrBは、本発明においてジンクフィンガー蛋白質による検出の標的として用いるのに好適である。
【0015】
本発明において用いられるジンクフィンガー蛋白質としては、認識部位が明らかにされている既知のいずれのジンクフィンガー蛋白質を用いてもよく、あるいは所望の認識部位を有するよう遺伝子工学的に改変されているジンクフィンガー蛋白質を用いてもよい。当該技術分野においては、ジンクフィンガー蛋白質の認識配列を変更する種々の方法が試みられている。ジンクフィンガー蛋白質は、適当な宿主中で組換え蛋白質として発現させてもよい。あるいは、ジンクフィンガー蛋白質は、組換えファージ中で発現させてファージ上に提示させることができる。このことにより、組換えジンクフィンガー蛋白質を精製することなく利用することができ、ファージに対する抗体を用いてジンクフィンガー蛋白質を容易に検出することができる。このようなファージディスプレイの手法は当該技術分野においてよく知られており、また、本明細書の実施例においても詳細に記載されている。
【0016】
好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は検出可能な標識により標識されていてもよい。このことにより、PCR増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質を容易に検出することができる。このような標識としては、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、酵素標識等が挙げられる。ジンクフィンガー蛋白質は、検出可能な標識ポリペプチドとの融合蛋白質として製造してもよい。
【0017】
また別の好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は適当な担体上に固定化して用いられる。固定化ジンクフィンガー蛋白質に上述のPCR増幅産物を結合させ、結合した二本鎖DNAの量を測定することにより、標識核酸を検出することができる。このような態様においては、PCR増幅産物が検出可能なように標識されていることが好ましい。
【0018】
本発明の方法においては、まず試験すべきサンプルからDNAを調製する。サンプルとしては、菌体の培養物、検査すべき農産物および食品、ならびに検査すべき動物およびヒトからの組織、体液、血液、糞便などを用いることができる。このようなサンプルからDNAを調製する手法は当該技術分野においてよく知られている。あるいは、試験すべきサンプルからRNAを調製し、定法によりcDNAを合成してもよい。次に、得られたDNAをテンプレートとして、上述のプライマー対および耐熱性DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅を行う。PCR増幅の条件および方法は当該技術分野においてよく知られている。
【0019】
次の工程においては、このようにして得られたPCR増幅産物とジンクフィンガー蛋白質とを接触させ、ジンクフィンガー蛋白質が結合するか否かを検出する。ファージ上に提示されたジンクフィンガー蛋白質を用いる場合には、このファージに特異的な抗体を用いるELISAを用いて検出することができる。すなわち、適切に標識された抗ファージ抗体を結合させ、未結合抗体を洗浄除去した後に、酵素反応、蛍光反応などにより標識の量を測定することにより、PCR増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。あるいは、ファージを利用しない系を用いる場合には、共有結合または融合蛋白質等の手法により適切に標識したジンクフィンガー蛋白質を用いて、この標識の量を測定することにより、PCR増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。あるいはPCR増幅産物を標識し、これとジンクフィンガー蛋白質との結合を検出することも可能である。このような標識は、PCR反応に用いるプライマー対をあらかじめ標識しておくか、またはPCR増幅反応中に標識ヌクレオチドを取り込ませることにより行うことができる。標識の方法は当該技術分野においてよく知られており、標識としては、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識等を用いることができる。あるいは、インターカレーター法や蛍光偏光法を用いてジンクフィンガー蛋白質に結合した二本鎖DNAを検出してもよい。
【0020】
本発明の方法にしたがえば、PCR増幅産物の二本鎖の変性工程を必要としないため、標的核酸を高い感度および高い特異性で簡便に検出することができる。
【0021】
以下に、Salmonella typhimuriumの検出を例として、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例1】
【0022】
ジンクフィンガー提示M13ファージ溶液の調製
ジンクフィンガー蛋白質としてはZif268の変異体であるZifMを用いた。ZifMは、Zif268にSphI、BsiWI部位を導入したものであり、アミノ酸配列および標的認識配列はZif268と同じである。
【0023】
ヘルパーファージM13KO7溶液は、以下のようにして調製した。大腸菌TG1を6mlのLB培地で37℃でOD=0.5まで培養した。その後、37℃で30分間ゆっくり振盪しながら培養し、少量のヘルパーファージM13KO7を加え、37℃で4−6時間培養した。これを1mlずつに分け、室温で12000rpmで5分間遠心分離して上清を採種した。これをヘルパーファージM13KO7溶液とした。
【0024】
ZifM遺伝子をコードするプラスミドpCANTAB−ZifM(pCANTABにコードされるgIIIタンパク質のN末端に存在する制限酵素サイトSphI、BsiWIの間にZifMをコードする遺伝子を挿入することにより作製した)で大腸菌TG1を形質転換し、10mlの2YT培地×4でOD=0.5となるまで37℃で振盪培養した。これに上述のヘルパーファージM13KO7溶液を200μlずつ加え、37℃で1時間振盪培養し、1000g、4℃で10分間遠心分離し、ペレットを得た。これを30mlの2YT培地(終濃度90μMZnSO4、5mMDTT、Amp50μg/ml)に懸濁し、30℃で18時間以上振盪培養した。これを2500g、4℃で10分間遠心分離して上清を得て、さらに3500g、4℃で10分間遠心分離した。上清に1/4量の50%PEG8000を添加し、泡立てないように十分に撹拌し、2−3時間氷中で静置した。その後、16500g、4℃で30分間遠心分離した。ペレットを1mlのPBSバッファー(90μMZnSO4、5mMDTTを含む)に懸濁した。以上のようにしてZifM提示M13ファージ溶液を得た。
【実施例2】
【0025】
ジンクフィンガーの標的2本鎖DNAへの結合能の確認
標的および対照の二本鎖DNAの配列は以下のものを用いた(Bio=ビオチン、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列)。
標的二本鎖DNA
268-bio 5'-Bio-GATCCTGACTGT GCG TGG GCG GAGTGA-3'
268-C 3'-TGACA CGC ACC CGC CTCACTAG-5'
1塩基変異二本鎖DNA
mut-bio 5'-Bio-GATCCTGACTGA GCG TTG GCG CAGTGA-3'
mut-c 3'-TGACT CGC AAC CGC GTCACTAG-5'
ランダム変異二本鎖DNA
ran-bio 5'-Bio-GATCCTGACTGT ACT GAG CCT CAGTGA-3'
ran-c 3'-TGACA TGA CTC GGA GTCACTAG-5'
【0026】
5’末端をビオチンラベルした一本鎖DNA(終濃度4pmol/μl)、その相補鎖DNA(終濃度6pmol/μl)、およびNaCl(終濃度50mM)を滅菌水に溶解した。プログラムテンプコントロールシステムを用いて95℃から25℃まで除冷し、二本鎖DNAを調製した。
【0027】
ELISAを用いて、調製したZifM提示M13ファージ溶液がこの二本鎖DNAに結合するか否かを調べた。150μMのビオチン標識二本鎖DNA溶液と450μlの洗浄バッファー2(0.05% Tween20を含むPBSバッファー(137mM NaCl,26.8mM KCl,8.1mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4,pH7.4)を混合し、これを100μlずつストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートのウエルに添加し、室温で2時間インキュベートして、二本鎖DNAを固定化した。200μlのZifM提示M13ファージ溶液と、200μlの洗浄バッファー2を混合したものを、100μl/ウエルで添加し、室温で2時間インキュベートした。200μl/ウエルの洗浄バッファー1(90μM ZnSO4,0.05% Tween20を含むPBSバッファー(pH7.4))で4回、200μl/ウエルの洗浄バッファー2で2回洗浄し、4μlの抗M13抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(抗M13HRP)を3.2mlのブロッキングバッファー(90μM ZnSO4,0.05% Tween20,2%スキムミルクを含むPBSバッファー(pH7.4))に加え、200μl/ウエルでプレートに添加し、室温で2時間インキュベートした。次に200μl/ウエルの洗浄バッファー1で4回、200μl/ウエルの洗浄バッファー2で2回洗浄し、100mlのABTS溶液と200μlの過酸化水素水を混合したものを200μl/ウエルで添加し、20分後にマイクロプレートリーダーmodel550(BioRad)を用いて、各ウエルの405nmの吸光度を測定した。
【0028】
標的二本鎖DNAを用いた場合、1塩基変異またはランダム変異二本鎖DNAと比較して有意に吸光度が高かった。このことは、M13ファージにZifMが提示されていること、およびZifM提示M13ファージが標的DNAに結合する能力を有することを示す。
【実施例3】
【0029】
Salmonella typhimuriumゲノム中のZif268結合標的部位の選択
まず、BLASTにより、S.typhimuriumのゲノム中からZif268結合部位であるgcgtgggcgの9塩基の配列を検索した。S.typhimuriumのゲノム配列は先の報告にしたがった(GenBank受託番号:AE008878,AE006468;McClelland et al., Nature 413(6858), 852-856 (2001))。次に、この9塩基配列の5’側および3’側のそれぞれ20塩基をプライマー領域として含む連続する49塩基配列についてBLASTで検索し、他の細菌が類似した配列を有するか否かを調べた。さらに、その遺伝子の比較対照となる他の遺伝子配列の多さ、進化速度、水平移動能の有無、などを基準として、標的とすべき遺伝子を選択した。
【0030】
このようにしてSalmonella typhimuriumのgyrBを標的遺伝子として選択した。gyrBはDNAジャイレース(II型トポイソメラーゼ)のβサブユニットをコードする遺伝子である。ほとんどの細菌がこの遺伝子を有しており、そのヌクレオチド配列は種特異的である。その配列は現在、16S rRNAと同じく種の同定に用いられている。Zif268の標的配列はgyrB遺伝子のN末端に存在する。図1は、種々のSalmonella 属の細菌のgyrB配列のN末端70kbの領域のアライメントの結果を示す。gyrB配列が非常によく保存された配列であることがわかる。Salmonella typhi以外ではZif268の結合領域に変異はなく、プライマー領域も良く保存されていることから、この領域の配列を標的とすることによってほとんどのSalmonella 属の細菌を検出することができると考えられる。
【0031】
この配列を、食中毒原因菌として検出される代表的な細菌のgyrBと比較した(図2)。Salmonella以外のgyrBにはZif268標的配列中に多くの変異が存在するため、Zif268はほとんど結合しないと予測される。また、プライマー領域にも多くの変異が存在し、PCRにより増幅されにくい。これらのことから、S.typhimurium gyrBを標的とすることにより、他の食中毒菌群の中からSalmonella 属の細菌のみを特異的に検出することが可能であると考えられる。
【0032】
図3は、Salmonella typhimuriumのgyrBとCitrobacter属のgyrBとのアライメントを示す。Citrobacter属の細菌は、生化学的方法や免疫学的方法によるSalmonella検出の際に擬陽性を示すことで知られる。Citrobacter属の配列においては、プライマー領域、zif268結合領域ともに変異が見られるため、Citrobacter属とSalmonella属とを区別して検出することが可能であることが確認された。
【実施例4】
【0033】
Zif268−M13ファージによるSalmonella PCR増幅産物の検出
Zif268が結合する連続する9塩基対の両端20bpの配列をプライマー結合部位としてプライマーを設計した。
フォワードプライマー:5'-AGTCTCCGGCGGTCTGCACG-3'
リバースプライマー:5'-CAGAGCGTTGACTACCGAGA-3'
【0034】
Salmonella typhimuriumをLB培地(10g Bactoトリプトン,5g NaCl,10g 酵母エキス/1L)中で37℃で一晩振とう培養を行い、GenomicPrep Cell and Tissue DNA isolation kit(Amersham Bioscience社製)を用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAをテンプレートとして、ビオチン修飾プライマーを用いてPCR増幅を行った。PCR増幅の条件は以下のとおりであった:95℃60秒間,52℃60秒間,72℃60秒間を30サイクル。ゲル電気泳動により、目的とするビオチン標識49bpのPCR増幅産物が得られたことを確認した。対照としてSalmonella enteritidisおよびE.coli DH5αのゲノムDNAをテンプレートとして同様にPCR増幅を行った場合には、49bpのPCR増幅産物は得られなかった。
【0035】
次に、このようにして得られたビオチン修飾PCR増幅産物、ならびに対照としてその一塩基変異である1塩基変異二本鎖DNAおよび標的配列を有しないランダム二本鎖DNAを、それぞれストレプトアビジンコーティングプレート上に固定化した(図4)。これらの二本鎖DNAとZif268−M13との結合を、実施例2に記載される方法にしたがって、ファージELISAにより調べた。陽性対照としてはZif268により認識される9塩基の合成二本鎖DNAを用いた。
【0036】
図5に結果を示す。グラフから、gyrB PCR 産物は1塩基変異二本鎖、ランダム二本鎖と比べて高い吸光度を示し、Zif268−M13が標的配列に特異的に結合することがわかる。すなわち、Zif268−M13を用いてgyrB PCR 産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図1は、Salmonella typhimuriumのgyrB PCR 標的配列のヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図2】図2は、Salmonella typhimuriumのgyrBと、食中毒原因菌として検出される代表的な細菌のgyrBとのヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図3】図3は、Salmonella typhimuriumのgyrBと、Citrobacter属のgyrBとのヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図4】図4は、ファージELISAに用いた二本鎖DNAの塩基配列を示す。
【図5】図5は、ファージELISAによるgyrB遺伝子の検出を示す。
【出願人】 【識別番号】801000072
【氏名又は名称】農工大ティー・エル・オー株式会社
【出願日】 平成15年8月4日(2003.8.4)
【代理人】 【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二

【識別番号】100106840
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 耕司

【識別番号】100105991
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 玲子

【公開番号】 特開2005−52061(P2005−52061A)
【公開日】 平成17年3月3日(2005.3.3)
【出願番号】 特願2003−285706(P2003−285706)