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【発明の名称】 核酸の検出方法
【発明者】 【氏名】イェンス・ブルマイスター

【氏名】エトガル・ディーセル

【要約】 【課題】固相上の核酸を特異的に検出する様々な核酸の混合物から標的核酸を検出する方法の提供。

【解決手段】以下の工程を含む。A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、B)アナライト核酸の溶液から、検出すべき標的核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、C)分析混合物の核酸を標識化エレメントで標識化すること、D)場合により、表面を洗浄液で繰り返し処理して弱く結合した核酸を除去すること、及びE)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、ここで、工程B)及びC)は任意の順序で行うことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
様々な核酸の混合物から標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B)アナライト核酸の溶液から、検出すべき標的核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
C)分析混合物の核酸を標識化エレメントで標識化すること、
D)場合により、表面を洗浄液で繰り返し処理して弱く結合した核酸を除去すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
を含む方法。
【請求項2】
以下の工程:
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B)アナライト核酸の溶液から、検出すべき標的核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
C)分析混合物の核酸を標識化エレメントで標識化すること、
D)場合により、弱く結合した核酸を除去するために、表面を洗浄液で繰り返し処理すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
を含む請求項1記載の方法。
【請求項3】
以下の工程:
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B')分析混合物の核酸を標識化エレメントで標識化すること、
C')標識化核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
D)場合により、弱く結合した核酸を除去するために、表面を洗浄液で繰り返し処理すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
を含む請求項1記載の方法。
【請求項4】
洗浄工程がストリンジェントであり、熱的に調節した緩衝液であって、その温度がアナライト核酸の固定化核酸上へのハイブリダイゼーションにおいて選択される温度より高い温度である緩衝液を用いて行う、請求項1記載の方法。
【請求項5】
洗浄工程がストリンジェントであり、そのイオン強度がアナライト核酸の固定化核酸上へのハイブリダイゼーションにおいて選択されるアナライト溶液のイオン強度よりも低い緩衝液を用いて行う、請求項1記載の方法。
【請求項6】
ストリンジェントな洗浄工程を、少なくとも一つのナトリウム−塩素緩衝液であって、その緩衝液の濃度が、固定化核酸上へのハイブリダイゼーションのために選択されるナトリウム−塩素濃度より低い緩衝液を用いて行う。請求項5記載の方法。
【請求項7】
検出すべき核酸が、標識化ユニットが連結されているか、それで被覆されたリガンド結合受容体分子と結合するリガンドとカップリングしている、請求項1記載の方法。
【請求項8】
受容体がアビジン、ニュートラアビジン及びストレプトアビジンから選択され、リガンドがビオチンである、請求項7記載の方法。
【請求項9】
受容体が抗体であり、リガンドが抗原である、請求項7記載の方法。
【請求項10】
標的核酸とリガンドの連結が酵素的若しくは化学的な方法、あるいはインターカレーションにより行われる、請求項1記載の方法。
【請求項11】
標識化ユニットがナノ粒子、金属複合体及び/又はAu、Ag、Pt、Pd、及びCからなる群から選択される元素に基づくクラスターである、請求項1記載の方法。
【請求項12】
標識化ユニットの分子量が10,000g/molより大きいものである、請求項1記載の方法。
【請求項13】
標識化ユニットを検出工程E)より前に又はその間に増強する、請求項1記載の方法。
【請求項14】
表面が一組の異なる固定化された核酸又は核酸アナログを有する、請求項1記載の方法。
【請求項15】
検出すべき核酸がリガンドとしてのビオチンと連結されており、標識化が受容体としてのアビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンで被覆した金粒子を用いて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項16】
検出すべき核酸が抗原と連結されており、標識化が抗体で被覆した金粒子を用いて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項17】
金粒子がオートメタログラフィー反応により増強され、核酸の検出が光学的又は電気的に行われる、請求項15記載の方法。
【請求項18】
金粒子がオートメタログラフィー反応により増強され、核酸の検出が光学的又は電気的に行われる、請求項16記載の方法。
【請求項19】
標的核酸をリボ核酸の発現プロファイリングのために、一塩基多型(SNP)の分析のために、又は増幅した遺伝子の分析のために検出する、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、固相上で核酸を特異的に検出する方法に関する。本発明はさらに本明細書に記載のアッセイを実施するための試薬を含むキットに関する。デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)の検出は、例えばヒトや獣医学における診断、食品工業、環境分析、作物の保護、生化学又は薬理学研究、及び法医学など、広範な分野に応用できる。
【背景技術】
【0002】
多数の異なる配列の同時的な分析を可能にする、いわゆるDNAアレイが核酸検出の標準的手法として確立された。DNAアレイは、例えば、発現のプロファイリング、ハイブリダイゼーションによる配列決定、一塩基(遺伝子)多型(SNP)の分析等に使用される。DNAアレイの製造と使用例は文献に記載されている(例、DNA Microarrays、D. Bowtell及びJ. Sambrook (編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 2003)。
【0003】
DNAアレイ上の検出エレメントとして核酸又は核酸アナログを使用しうる。核酸アナログの例として、PNA(M. Egholmら, Nature 365, 566-568 (1993))、LNA(D. A. Braasch, D. R. Corey、Chem. Biol. 8, 1-7 (2001))又は糖鎖バックボーン上で修飾された核酸(M. Shimizuら、FEBS Letters 302, 155-158 (1992))がある。
【0004】
DNAアレイは、例えば光学的、電気的、機械的又は磁気的な方法で読み取ることができる。
【0005】
光学的な検出法は例えば、蛍光標識した生物分子の誘電体表面での検出に基づく。この場合、蛍光は、平面状の導光板(US-A-5,959,292参照)により、インターフェースでの全反射(DE 196 28 002 A2参照)により、又は光ファイバーの表面(US-A-4,447,546参照)で刺激することができる。
【0006】
電気的なバイオセンサーは、例えば、金属粒子(例えばナノ粒子)により標識された分析物(アナライト)の検出に基づく。検出のためには、これらの粒子が微少構造の電気回路短絡をショート(short circuit)するまでオートメタログラフィー沈着(autometallographic deposition)により大きくする。これは直線的な直流抵抗測定で証明された(US-A-4,794,089; US-A-5,137,827; US-A-5,284,748)。
【0007】
電界効果トランジスターを例えば酵素反応の電子変換器(トランスデュサー)として使用することができる(Zayatsら、Biosens. & Bioelectron、15、671(2000))。
【0008】
機械的な変換器としては、質量の適用により共鳴周波数が変化する水晶振動子の使用が記載されている(Steinemら、Biosens. & Bioelectronics 12、787 (1997))。他の機械的変換器として、標的吸着で修飾される表面波のインターデジタル構造による刺激について記載されている(Howeら、Biosens. & Bioelectron. 15、641 (2000))。
【0009】
標的分子を磁気ビーズで標識した場合、対応する抵抗器の巨大磁気抵抗(GMR)に対するビーズの磁気的効果に基づいて認識反応を検出することができる(Baseltら、Biosens. & Bioelectron. 13、731 (1998))。
【0010】
アレイにハイブリダイズした標的核酸の導電性粒子による標識化は、特に電気的な方法にとって有利である。WO 99/57550-A2には、板電極対間に固定化された核酸にハイブリダイズした核酸標的の標識化、例えば、金粒子による標識化が記載されている。例えば、還元剤の存在下、金属イオン溶液により、金粒子をオートメタログラフィーによって増強(enhancement)することにより、通常、互いに電導的に接続された粒子のネットワークからなる、導電性の金属フィルムを電極対の間に生成させることができる。標的の存在は、金属フィルムのコンダクタンスを調べることで検出できる。標的の標識化は固定化した検出エレメント(detector element)との相互作用の前、又は後に行い得ると記載されている(WO 99/57550-A2)。WO 00/25136-A2に記載の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドをcis-プラチナム-ビオチンで標識し、ついでビオチニル化標的をストレプトアビジン-金クラスターで標識する。電極対の間に固定化した核酸に金で標識した標的をハイブリダイズさせる。上記の銀フィルムと同様、導電性の金フィルムは、還元剤の存在下、金塩でオートメタログラフィー的に増強した後、形成される。ハイブリダイゼーション事象は電極対間の電気的な接触を測定することにより分かる。
【0011】
WO 00/25136-A2に記載の他の好ましい態様では、標的分子とビオチンとを反応させる。電極対の間に固定化した検出エレメントにビオチン標識化標的を結合させる。結合したビオチニル化標的を、次いで、アビジン又はストレプトアビジンに連結(リンク)したコロイド状金粒子で標識する。還元剤の存在下、金塩でオートメタログラフィーに増強すると、導電性金フィルムが形成される。結合事象は電極対間の電気接触を測定することで検出される。
【0012】
固定化検出エレメントにハイブリダイズした、そして金粒子で標識した核酸は、光学的な方法でも検出することができる。WO 02/02810-A2には、アレイエレメント上で沈殿を形成し、光学的又は電気的な方法により、シグナル強度の形で沈殿の時間プロファイルを決定することが記載されている。WO 02/02810-A2は、標的を固定化検出エレメントとの相互作用の前、間、又は後に、例えば、コロイド状金属粒子に連結することを特許請求している。
【0013】
現在、マイクロアレイ上で核酸を検出するためには、金粒子による標識化に基づく2つの異なる方法が商業上利用可能である。ArrayTube System (Clondiag Chip Technologies)は、例えば、ビオチニル化プライマーで増幅し、チップにハイブリダイズさせた標的のストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに基づいている。標的を、次いで、ストレプトアビジン−金(金コロイド、5 nm)で標識する。銀塩でオートメタログラフィーに増強した後、ハイブリダイゼーションを光学的に検出する。ArrayTubeの取扱指示書は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後でのみ金標識を実施することを、明確に勧めている。
【0014】
これも市販されているGenicon Sciencesの検出システムは、抗ビオチン抗体に連結した金粒子の光学的な検出に基づく。共鳴光散乱(RLS)技術の使用において、金粒子のオートメタログラフィーによる増強は不要である。Genicon Sciencesが記載しているRLS技術の核酸への全ての応用例で、ビオチニル化標的の標識化は、アレイへのストリンジェントなハイブリダイゼーションの後にのみ行われる。
【0015】
要約すると、最新技術によれば、DNAマイクロアレイ上の核酸を金粒子、例えば、ストレプトアビジン又は抗体に連結されている金粒子、で標識化することによる検出は、核酸をDNAアレイにハイブリダイズさせた後であり、かつ区別/識別(discrimination)を行った後にのみ、行うことが好ましい。
【0016】
別のDNAアレイ上の核酸の金粒子による標識化方法は、標識化単位としてDNA-被覆金粒子の使用に基づく。この方法では、検出すべきDNAを、固定化したデテクターDNA、標的及びDNA-被覆金粒子の間のサンドイッチハイブリダイゼーション法で検出する。この方法では、金と検出すべき核酸との直接の結合はない。その代わり、DNA−被覆金粒子の結合がさらなるハイブリダイゼーションでもたらされる。DNAマイクロアレイ上の核酸の光学的検出におけるDNA−被覆金粒子の使用は、例えば、Tatonらが記載している(Taton ら、Science 2000、289、1757)。同法はDNAマイクロアレイ上の核酸の電気的検出にも使用された。例えば、S.-J. Parkら、Science 2002、295、1503-1506参照。DNAマイクロアレイ上にハイブリダイズした核酸をDNA−被覆金粒子で標識化することに関する研究から、これらの粒子が、天然のDNAサンドイッチ複合体と比較して、DNAサンドイッチ複合体(コンプレックス)の融点を上昇させることにより、密接に関連したDNA配列の区別(識別)における特異性を増大することが分かった。これは、とりわけ一塩基多型(single nucleotide polymorphisms (SNPs))の区別を向上させる。DNA-被覆金粒子の使用には、製造が非常に複雑であることや、コンジュゲートが不安定であること(例えば、金粒子をチオール化オリゴヌクレオチドで被覆する場合、これらコンジュゲートは高濃度の塩溶液に対し、及び高温に対して不安定であり、凝集しやすい)、金粒子あたり大量のオリゴヌクレオチドを要するために、生産コストが高いこと、及び標識化が特異的なハイブリダイゼーションに依存していること、などの不利な点がある。
【0017】
DNAアレイの利点は特に大量の異なる配列を同時に分析することにあるので、後者は特に強調される点である。例えば、様々な配列を順次互いに分析する場合、サンドイッチアッセイに関しては、各遺伝子について配列特異的なデテクターが必要である。この必要性(outlay)はDNA−被覆金粒子で標識したDNAマイクロアレイの実行可能な多重可能性を著しく制限する。
【0018】
DNAマイクロアレイ上の核酸の検出に伴う根本的な問題は、いかにして、ハイブリダイゼーションの選択性と感受性を同時に保証するか、という点である。ハイブリダイゼーションの特別高い選択性は、一塩基多型(SNP)を、例えば、DNAアレイ上でのアレル−特異的ハイブリダイゼーションにより検出する際には、常に保証される必用がある。DNAアレイへのアレル特異的ハイブリダイゼーションによるSNP検出例がIwasakaらにより記載されている(Iwasakaら、DNA Research 2002、9、59-62)。アレル特異的ハイブリダイゼーションに関連する特別な問題は、どのようにして、標的と固定化試料間の塩基対形成(これらの熱力学的安定性の差はごく僅かである)を区別するか、という点にある。類似の熱力学的安定性を有する塩基対の例には、GCとGT又はGCとGGからなる塩基対がある。
【0019】
アレル−特異的ハイブリダイゼーションの選択性は最新技術に従い、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、あるいは、非−ストリンジェントなハイブリダイゼーション後のストリンジェントな洗浄工程により、達成できる。しかしながら、このようなストリンジェントなハイブリダイゼーションで達成できる選択性は、適合した(マッチング)(一般に、ワトソン−クリック)塩基対のためのハイブリダイゼーション反応における絶対的なシグナルを減少させる。
【0020】
金コロイド間に透過経路(percolation path)が形成される可能性はコロイドの面密度に依存することから、DNAアレイを金で標識した後、銀で増強し、電気的に読み取る意図がある場合は、常に、DNAアレイ上でのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に起因する絶対的なシグナルの減少は不利益である。特に、そのような測定法では臨界面密度を超える必要があり、それが電導性(率)の閾値を構成することになる(D. Stauffer, A. Aharony: Percolation Theory-An Introduction, VCH, Weinheim, 1995, pp. 95 5 ff.)。
【0021】
上記した、核酸をDNAマイクロアレイにハイブリダイズさせる方法及び金粒子で標識化する方法には、不利な点があり、とりわけ、その後に電気的な読取りを行う意図がある場合には常に不利益なことがある。上記の、ストレプトアビジンで被覆した、又は抗体で被覆した金粒子で標識化するための先行技術の方法では、特にストリンジェントなハイブリダイゼーション後の絶対シグナル低下の問題が、解決されない。DNAアレイの標識化にDNA−被覆金粒子を使用する方法は、密接に関連した核酸に対する、感受性と特異性を具備した検出を可能ならしめるが、それらの方法は依然としてサンドイッチ法に基づくアッセイに限定されている。
【0022】
本発明の目的は、DNAアレイの標識化ユニット(labeling units)による標識化を改良し、ハイブリダイゼーションの特異性は保持したまま、標識化ユニットの面密度を高めることにある。本発明は、特に、ハイブリダイゼーションの特異性は保持したまま、チップにハイブリダイズした状態の検出すべき核酸分子の量を有意に増大することを目的としている。
【0023】
この目的は本発明の、核酸標的をDNAアレイに固定化したデテクター核酸に非-ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる方法により達成された。この方法において、デテクター核酸にハイブリダイズした核酸標的の標識化ユニットによる標識化は、ハイブリダイゼーション工程の前又は後に行うことができ、その後、区別(識別)を行う。種々の標識化した配列の区別は、例えば、ストリンジェントな洗浄工程によって行う。驚いたことには、金標識化は、例えば、種々の核酸配列をストリンジェントな洗浄工程で区別するのに要する温度を有意に高めることが分かった。本発明の方法は、密接に関連した配列の区別を著しく改良する。
【0024】
本発明は様々な核酸の混合物から標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B)分析物(アナライト)核酸の溶液から、検出すべき標的核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
C)分析混合物の核酸を標識化ユニットで標識化すること、
D)場合により、弱く結合した核酸を除去するために表面を洗浄液で繰り返し処理すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
からなる方法に関する。
【0025】
別法として、工程BとCとを入れ換えても良い。
従って、本発明はまた様々な核酸の混合物から標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
A)標的核酸と非共有結合(塩基対)結合を形成するのに適した核酸又は核酸アナログが固定化された表面を得ること、
B')分析混合物の核酸を標識化ユニットで標識化すること、
C')標識化核酸の固定化核酸上への非−ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うこと、
D)場合により、弱く結合した核酸を除去するために表面を洗浄液で繰り返し処理すること、及び
E)表面に残っている核酸対を、それらに結合した標識化ユニットを利用し、光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な検出法で検出すること、
からなる方法に関する。
【0026】
ストリンジェントな洗浄工程は、アナライト核酸の固定化核酸上へのハイブリダイゼーションに選択される温度より、高い温度に、熱的に調節した緩衝液を用いてDNAアレイを洗浄することが好ましいだろう。
【0027】
当業者ならば、ストレプトアビジンの1/2が変性する温度が75℃であることを知っている。ストレプトアビジンの全結合ポケットがビオチンで飽和されると、熱的に誘導される変性に対して有意に安定化される(M. Gonzalezら、Biomol. Eng. 16、67-72(1999))。金粒子をストレプトアビジンで被覆した後、ビオチニル化標的と結合させると、通常、ストレプトアビジン分子のビオチンによる飽和は起こらない。従って、当業者はストレプトアビジン被覆金粒子は60-70℃以上の温度で不安定であり、それどころかタンパク質が変性して金粒子を凝集させると予想する可能性がある。従って、先行技術に従い、当業者は標識した核酸を、例えば、ストレプトアビジン被覆金粒子でアレイにハイブリダイズさせた後に60−70℃以上の温度で洗浄することを避けるだろう。
【0028】
本発明は、例えば、ストレプトアビジン−被覆金粒子が、ハイブリダイズした核酸を標識化した後アレイ上で行うストリンジェントな洗浄工程において十分な熱安定性を有するという観察に基づいている。
【0029】
ストリンジェントな洗浄工程は、DNAアレイを、イオン強度が固定化核酸へのハイブリダイゼーションに用いる緩衝液のイオン強度より低い緩衝液で洗浄することによっても好都合に実施しうる。本発明に従い、ストリンジェンシーを調節するために2つの方法を任意に組み合わせてもよい。
【0030】
本発明方法の好ましい代替法は、ストリンジェント洗浄工程をナトリウム−塩素緩衝液を用いて行うことを特徴とする。緩衝液の濃度は、固定化核酸上へのハイブリダイゼーションのために選択されるナトリウム−塩素濃度より低い。
【0031】
本発明に従えば、標的核酸を標識化ユニットで標識する。核酸と標識化ユニットとの結合は、共有結合、配位結合、又は非共有結合であってよい。標識化ユニットを結合するためには、標的核酸をリガンド分子で機能性にしておく必要がある。このリガンド分子は次いで標識化ユニットの表面を被覆しているリガンド結合受容体分子と結合する。適当な受容体−リガンド対は当技術分野の当業者に既知である。受容体−リガンド対の例には、ビオチン−ストレプトアビジン又は抗体−抗原が含まれる。
【0032】
受容体−リガンド相互作用としては、受容体にアビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジン、リガンドにビオチンを選択することが好ましい。
【0033】
あるいは、受容体−リガンド相互作用は、抗体とその抗原(リガンドとして)の相互作用であってもよい。
【0034】
標的核酸のリガンドとの連結は、酵素的若しくは化学的な方法、あるいはインターカレーション(挿入)により行うことが好ましい。
【0035】
核酸のリガンドによる機能性化は当業者に既知の方法で行う。適当な機能性化の例として、例えば、PCR、プライマー伸長、転写反応等の酵素反応での改変ヌクレオチドの使用、あるいはPCR、プライマー伸長反応等の酵素反応でのリガンドリガンドと結合したプライマーの使用が挙げられる。リガンドの核酸への結合も、例えば、分子のインターカーレーション、及び核酸と適当なリガンドの(光)化学反応で行うことができる。
【0036】
標識化単位は、検出すべき核酸が結合しているリガンドとの結合が可能なよう、受容体分子に結合(共役、カップリング)させて修飾する。そのようなカップリングの例は、コロイド状の金粒子のストレプトアビジン又は抗体による被覆である。
【0037】
標識化ユニットは、それらが光学的、分光光学的、電気的、機械的又は磁気的な方法で読み取ることができるものから選択することが好ましい。そのうえ、標識化ユニットは標識化標的核酸の放出に必要なストリンジェンシー(例えば、温度、イオン強度等について)が非標識化標的核酸の放出に必要なストリンジェンシーより大きくなるように、DNAアレイにハイブリダイズした標的核酸の放出を修飾しうる性質をも有する。
【0038】
ナノ粒子、金属複合体及び/又はAu、Ag、Pt、Pd、Cu、C等の様な物質の集団(クラスター)を標識化ユニットとして好適に使用することができる。さらに好ましい標識化ユニットの例として、ビーズ、金属被覆ビーズ、カーボンナノチューブ、タンパク又は他の分子(好ましくは、分子量:>10,000g/mol、好ましくは、粒子サイズ:1 nm〜約10μm)である。
【0039】
表面に一組の異なる核酸又は核酸アナログが固定化されていることを特徴とする方法も好ましい。
【0040】
標識化ユニットで標識されたDNAアレイは光学的、電気的、機械的又は磁気的な方法で読み取ることができる。
【0041】
検出すべき核酸がリガンドとしてのビオチンに結合しており、標識化を受容体としてのアビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンで被覆した金粒子を用いて行う方法が、特に好ましい。
【0042】
検出すべき核酸が抗原に結合しており、標識化を抗体で被覆した金粒子で行う変法も、特に好ましい。
【0043】
標識化ユニットを読み取り(工程E)の前又は間に増強させる。適当な増強反応は、例えば、金属コロイドを例えばAu−ベース又はAg−ベースの増強溶液を用いるオートメタログラフィー的な増強である。
【0044】
本発明はさらに、本発明方法をリボ核酸の発現プロファイリングのため、一塩基多型(single point mutations、SNP)の分析のため、及び増幅遺伝子の分析のために使用することに関する。
−発現プロファイリング:RNAアナライト混合物、又はRNAアナライト混合物を用いる酵素反応後に得られる対応DNA混合物(例、cNDA)、の非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。次いで、RNA混合物又はDNA混合物を標識体(labeling entity)とカップリングさせた後、ストリンジェントな洗浄工程を適用する。
−SNP(一塩基多型):SNPを含有するDNA混合物又酵素反応後に得られる対応DNA混合物とDNA混合物との非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。次いで、DNA混合物と標識体(labeling entity)とのカップリング後、ストリンジェントな洗浄工程を適用する。
−増幅遺伝子の検出:増幅及び/又は非増幅遺伝子を含有するDNA混合物のハイブリダイゼーション、又は酵素反応で得られた対応するDNA混合物のDNA混合物との非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション。次いで、DNA混合物と標識体(labeling entity)とのカップリング、次いでストリンジェントな洗浄工程の適用。
【0045】
本発明の方法は、先行技術で知られている標識化エレメントを用いてDNAアレイ上の核酸を検出する方法に比較して、以下の有利な点を有する。
非ストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいて達成されるシグナル強度が選択すべきハイブリダイゼーション反応においても保持されるので、密接に関連した核酸のハイブリダイゼーションによる区別が向上している。
・標的核酸の連結を、非ストリンジェントなハイブリダイゼーションの前又は後に行うことができる。
・ハイブリダイゼーション以外の方法で標識化ユニットを標的核酸に結合(カップリング)させるので、標的の配列に無関係である。
・標識化に使用できる様々な標識化ユニットの選択肢が当技術分野の当業者には既知である。そのため、種々の方法でDNAアレイを読み取ることが可能である。
【0046】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
実施例
実施例1 標識化の前及び後における区別の比較
5'-アミノを修飾した、アレル特異的なオリゴヌクレオチドを、あらかじめアミン基を有するポリマーで被覆しておいた酸化シリコンチップ上に共有結合的に固定化して2つのDNAチップを調製した。共有結合による固定化はホモ二官能性架橋試薬(交差リンカー)(homobifunctional cross-linker)BS3 (ビス-スルホ-スクシンイミジル スベラート、Pierce)を用いて行った。アレル−特異的オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
5'-amino-ttt ttt ttt cct aac tcg aac cc (配列番号:1)(試料C)
5'-amino-ttt ttt ttt cct aac ttg aac cc (配列番号:2)(試料T)
チップのサイズは1cm2であった。アレル特異的オリゴヌクレオチドをチップの表面に5μlづつ、2連で固定化し、チップあたり4スポットとなるようにした。
【0047】
CETP(コレステリルエステルトランスフェラーゼタンパク遺伝子)-TagIB遺伝子型AAを有する患者由来のDNAをビオチニル化プライマーと非ビオチニル化プライマーを用い、標準的な方法によりPCRで増幅した。ビオチンプライマーの配列は以下の通りである。
5'-ビオチン-ttg tgt ttg tct gcg acc (配列番号:3)
また、非ビオチニル化プライマーの配列は以下の通りである。
5'-ccc aac acc aaa tat aca cca (配列番号:4)
【0048】
PCR生成物のビオチニル化鎖は次の配列を有していた。
5'-ビオチン-tt gtgtttgtct gcgacccaga atcactgggg ttcAagttag ggttcagatc tgagccaggt tagggggtta atgtcagggg gtaaagatta ggaggttggt gtatatttgg tgttggg (配列番号:5)
(式中、AはSNP部位を表す。)
PCR生成物2×50μlをMicrocon-3カラム(Millipore供給、MWCO=3,000)で遠心分離して脱塩した。脱塩したPCR生成物を0.11N NaOH、0.9M NaCl、0.005%SDSの混合物45μlに溶解した。アルカリ性の標的溶液を同等に調製した2つのDNAチップに適用し、25℃で10分間インキュベートした。
【0049】
アルカリ性のハイブリダイゼーション溶液に1M NaH2PO4、1M NaCl、0.005%SDSの混合物5μlを加えて中和した。チップをハイブリダイゼーション溶液と一緒に25℃で15時間、加湿チャンバー内でインキュベートした(=非ストリンジェントなハイブリダイゼーション)。
【0050】
ストレプトアビジン−金(10 nm, Sigma)溶液100μlを30分間遠心(21,000 g)した。上清を除去し残渣を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8.2)、1M NaCl、0.005%SDS(緩衝液A)に取った。
【0051】
非ストリンジェントなハイブリダイゼーションが終了した後、チップを緩衝液Aで洗浄し、25℃で乾燥した。
【0052】
チップ1:チップ1はストレプトアビジン−金溶液50μlと一緒に25℃で2時間インキュベーションした。この操作の後、ストリンジェントな条件下でアレルを区別(discrimination)した。区別は、チップをあらかじめ75℃に加熱しておいた緩衝液Aで洗浄することにより行った。緩衝液を除去し、0.1Mリン酸緩衝液(pH 8.2)、1M NaN03、0.005%SDSで洗浄して、銀による増強の前に干渉性の塩素イオンを除去した。
【0053】
チップ2:チップ2は、あらかじめ55℃に加熱しておいた緩衝液Aで5分間洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−金溶液(50μl)と、25℃で2時間インキュベートした。銀による増強の前に、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8.2)、1M NaN03, 0.005%SDSと一緒に25℃で洗浄した。
【0054】
これら両チップの銀による増強のために、0.012 M AgN03水溶液一部と、0.05Mヒドロキノン及び0.3Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 3.8)の水溶液四部の混合溶液を調製した。この溶液にチップを30分間浸した。チップを洗浄して銀増強を終了した。
【0055】
銀で増強したチップ表面の直流(DC)抵抗の測定は、外部から適用した電極間で行った。試料上での不均質性を補償するためにDNAスポット毎の測定を自動測定装置を用いて、該スポットの様々な点で行った。装置の必須部位は試料台と2つの金属製測定チップである。試料台と測定チップの両方をコンピューター制御下で移動させる。電気的な特性化のために、台を方形格子内で順次移動させる。各格子点で、2つの測定チップを低下させて試料と電気的に接触させる。DC抵抗測定は、入力に2つの測定チップを連結したマルチメーター(Multimeter 2000, Keithley Instruments)を用い、二点配置で行う。各測定結果につき、1Mohm(メガオーム)以下であればコンダクタンス(伝導性)に関して陽性と分類し、1Mohm以上であれば陰性と評価する。陽性測定値の数と全測定数の比が、考慮すべき測定量としての正規化(標準化)したコンダクタンスを規定する。
【0056】
DC抵抗測定の結果を下記の表1にまとめて示す。
【表1】


【0057】
上記の結果は、核酸を区別の前に標識することによりアレル間の非常に優れた区別が行われることを示している(チップ1)。マッチ(適合)させたスポットでは絶対的なシグナルがより一層強くなる;すなわち選択した条件下では核酸ハイブリダイゼーションの電気的な検出はこれによってのみ可能である。従って、チップ2では、1つのアレル又は他のアレルのいずれについてもシグナルが検出できない。
【0058】
実施例2 患者由来の試料のPCT産物の分析
19名の様々な患者由来のDNAを、そのCETP-Tagl遺伝子型に関し、先行技術に対応する遺伝子型解析法(例えば、Pyrosequencing)で検討した。次いで、19名の異なる患者のDNAを標準的な方法により、ビオチニル化プライマーと非ビオチニル化プライマーを用いてPCRで増幅した。ビオチンプライマーの配列は以下の通りである。
5'-ビオチン-ttg tgt ttg tct gcg acc (配列番号:3)
また、非ビオチニル化プライマーの配列は以下の通りである。
5'-ccc aac acc aaa tat aca cca (配列番号:4)
【0059】
PCR産物のビオチニル化鎖の配列は以下の通りであった。
5'-ビオチン-tt gtgtttgtct gcgacccaga atcactgggg ttcRagttag ggttcagatc tgagccaggt tagggggtta atgtcagggg gtaaagatta ggaggttggt gtatatttgg tgttggg (配列番号:6)
(R=A又はG)
5'-アミノが修飾された、アレル−特異的なオリゴヌクレオチドを、アミン基を含有するポリマーで被覆した酸化シリコンチップ上に固定化し、19個のDNAチップを調製した。共有結合的な固定化はホモ二官能性架橋試薬(交差リンカー)BS3 (ビス-スルホ-スクシンイミジル スベラート、Pierce)を用いて行った。アレル−特異的オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
5'-アミノ-ttt ttt ttt cct aac tcg aac cc (配列番号:1)(Gアレル特異的)及び
5'-アミノ- ttt ttt ttt cct aac ttg aac cc (配列番号:2) (Aアレル特異的)
チップの大きさは1cmであった。アレル特異的オリゴヌクレオチドをチップの表面に2連で固定化しチップあたり4スポットとなるようにした。
【0060】
各場合につき、PCR生成物50μlをMicrocon-3カラム(Millipore、MWCO = 3,000)で遠心分離して脱塩した。脱塩したPCR生成物を0.11N NaOH、0.9M NaCl、0.005% SDSの混合物45μlに溶解した。アルカリ性の標的溶液を19個のDNAチップに適用し、25℃で10分間インキュベートした。
【0061】
アルカリ性のハイブリダイゼーション溶液に1M NaH2PO4、1 M NaCl、0.005%SDSの混合物5μlを加えて中和した。チップをハイブリダイゼーション溶液と一緒に25℃で15時間、加湿チャンバー内でインキュベートした(=非ストリンジェントなハイブリダイゼーション)。
【0062】
ストレプトアビジン−金(10 nm, Sigma)溶液、19×50μlを30分間遠心(21,000 g)した。上清を除去し残渣を0.1Mリン酸緩衝液(pH 8.2)、1M NaCl、0.005%SDS(緩衝液A)に取った。
【0063】
非ストリンジェントなハイブリダイゼーションが終了した後、チップを緩衝液Aで洗浄し、25℃で乾燥した。各場合について、チップをストレプトアビジン−金溶液50μlと一緒に25℃で2時間インキュベートした。この操作の後、ストリンジェントな条件下でアレルを区別(discrimination)した。区別は、あらかじめ75℃に加熱しておいた緩衝液Aでチップを洗浄することにより行った。緩衝液を除去し、0.1Mリン酸緩衝液(pH 8.2)、1M NaN03、0.005%SDSで洗浄して、銀による増強の前に干渉性の塩素イオンを除去した。
【0064】
銀による増強のために、0.012M AgN03水溶液一部と、0.05Mヒドロキノン及び0.3Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 3.8)の水溶液四部の混合溶液を調製した。この溶液にチップを9分間浸した。チップを洗浄して銀増強を終了した。
【0065】
銀で増強したチップ表面の直流(DC)抵抗の測定は、外部から適用した電極間で行った。実施例1と同様に、DNAスポット上の異なる部位で、スポットあたり25の測定を行った。
【0066】
9分間銀増強を行ったチップのDC抵抗測定の結果結果を表2に示す。9分間の銀増強の後にもシグナルを示さないチップをさらに4分間調製したばかりの硝酸銀/ヒドロキノン溶液で処理した。水洗して増強反応を終了させた後、上記の方法によりDC抵抗を測定した。
結果を表2に示す。19の遺伝型のうち、18の遺伝型が正確に決定された。一例(患者13)の場合、ホモ接合性のG−アレルを担っている患者をヘテロ接合性の患者と決定した。
【0067】
表2:患者のPCT産物の分析結果
【表2】


【0068】
上記の記載は単に本発明の幾つかの実施態様の詳細な説明にすぎず、本明細書の開示に従って、本発明の思想又は範囲を逸脱することなく、開示された態様を様々に変更しうることは、理解されるであろう。従って、上記の記載は本発明の範囲を制限するものではない。むしろ、本発明の範囲は添付の請求の範囲及びその均等物によってのみ決定されるべきである。
【出願人】 【識別番号】504109610
【氏名又は名称】バイエル・テクノロジー・サービシーズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Bayer Technology Services GmbH
【出願日】 平成16年5月21日(2004.5.21)
【代理人】 【識別番号】100068526
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 恭生

【識別番号】100103230
【弁理士】
【氏名又は名称】高山 裕貢

【識別番号】100087114
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 みの里

【公開番号】 特開2005−168(P2005−168A)
【公開日】 平成17年1月6日(2005.1.6)
【出願番号】 特願2004−151490(P2004−151490)