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【発明の名称】 冬虫夏草菌糸体抽出物の分画物、および経口摂取用組成物
【発明者】 【氏名】山口 能宏
【住所又は居所】大阪府茨木市豊川一丁目３０番３号 小林製薬株式会社中央研究所内

【氏名】国友 栄治
【住所又は居所】大阪府茨木市豊川一丁目３０番３号 小林製薬株式会社中央研究所内

【氏名】内田 健志
【住所又は居所】大阪府茨木市豊川一丁目３０番３号 小林製薬株式会社中央研究所内
【要約】 【課題】本発明の目的は、冬虫夏草に含まれる有効成分を含む分画物を提供することである。また、免疫賦活のための有効な手段、および癌に対する有効な予防手段または治療手段を提供し、また健康食品の製造において有用な組成物を提供することである。

【解決手段】本願発明は、冬虫夏草菌糸体を熱水抽出して得られる抽出液に、エタノールを加えることにより得られる沈殿画分を提供する。さらに当該沈殿画分を含む経口摂取用組成物を提供する。また、本発明により、抗癌作用、癌予防作用または免疫賦活作用を有することを特徴とする当該経口摂取用組成物を含む、飲食物、免疫賦活剤、抗癌剤などが提供される。さらに本願発明により、前記経口摂取用組成物の有効な製造方法もまた提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルジセプス シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｙ）Ｓａｃｃａｒｄｏ）の菌糸体を熱水抽出して得られる抽出液に、抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを加えることにより得られる沈殿画分。
【請求項２】
請求項１に記載の沈殿画分であって、前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを当該抽出液に加え生じる沈殿画分を取り除いた上澄み液として得られる抽出液に、当該抽出液が容積比で７０％〜９０％の量のエタノールを含むこととなる量のエタノールをさらに加えることより得られる前記沈殿画分。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の沈殿画分であって、前記抽出液が、エタノールを加える前に、濃縮することにより得られるものである請求項１に記載の沈殿画分。
【請求項４】
前記菌糸体が、前処理としてエタノールによる加熱抽出を行った後の残査である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の沈殿画分。
【請求項５】
１０万以上の分子量を有する多糖類を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の沈殿画分。
【請求項６】
哺乳類における、インターフェロン−γまたは腫瘍壊死因子−αの産生亢進活性を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の沈殿画分。
【請求項７】
請求項１に記載の沈殿画分をさらに透析により分子量分画することにより得られる分子量１０万以上の画分。
【請求項８】
糖含量がＤ−グルコース換算で６０〜８０重量％であることを特徴とする請求項７に記載の画分。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の画分を含む、経口摂取用組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の経口摂取用組成物を含む、飲食物。
【請求項１１】
抗癌作用、癌予防作用または免疫賦活作用を有することを特徴とする、請求項１０に記載の飲食物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の経口摂取用組成物を含む、免疫賦活剤。
【請求項１３】
請求項１１に記載の経口摂取用組成物を含む、抗癌剤。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の画分の製造方法であって、
ａ）冬虫夏草菌糸体を８５〜１００℃で水による加熱抽出を行い抽出液を得る工程；および
ｂ）前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを、抽出液に加え、発生する沈殿を回収する工程、を含む前記製造方法。
【請求項１５】
請求項２〜８のいずれか１項に記載の画分の製造方法であって、
ａ）冬虫夏草菌糸体を８５〜１００℃で水による加熱抽出を行い抽出液を得る工程；
ｂ）前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを、抽出液に加え、発生する沈殿を取り除き上澄み液を回収する工程；および
ｃ）前記上澄み液が容積比で７０％〜９０％の量のエタノールを含むこととなる量のエタノールをさらに当該上澄み液に加えることより得られる沈殿を回収する工程、を含む前記製造方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本出願は、薬理効果を有する冬虫夏草由来の分画物、および当該分画物の製造方法に関する。さらに本発明は、当該分画物を含む経口摂取組成物、医薬組成物、飲食物組成物、もしくは免疫賦活効果を有するおよび／または癌の予防または治療に用いられる医薬品、医薬部外品、飲食物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬虫夏草は昆虫などから生じるきのこの総称であり、子のう菌類・麦角菌目・麦角菌科の一属として位置づけられる。そのうちのコルジセプス シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｙ）Ｓａｃｃａｒｄｏ）は鱗翅類のコウモリ蛾の幼虫に寄生し、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布するきのこである。中国では古くから不老不死、強壮強精の漢方薬として珍重され、伝承されてきた。近年の研究により冬虫夏草に含まれる成分は種々の生理活性を有することがわかり、免疫賦活効果、抗腫瘍活性、血糖値降下作用、血圧降下作用および血管拡張作用についての報告がなされている（非特許文献１〜６参照）。このような生理活性に注目して、有効成分を効率よく摂取するための試みもなされているが（特許文献１参照）、抽出物における有効成分の含有量および活性面において十分であるとは言い難い。
【０００３】
また、近年の培養技術の進歩により、天然物とほぼ同等の冬虫夏草の菌糸体培養物が生産可能となっている。そのため冬虫夏草の菌糸体は、従来利用されてきた子実体の部分と比べて、工業的に生産する上での原料としてより適している。したがって、当該菌糸体培養物を利用して、冬虫夏草の有効成分を含む画分を効率よく取り出すための方法が求められている。
【特許文献１】特開平１１−２２８４４０号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、第２２巻（第９号）、第９６６−９７０頁、１９９０年
【非特許文献２】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第７９巻、第５０５−５０８頁、１９９９年
【非特許文献３】Ｊ．Ｋａｎａｚａｗａ Ｍｅｄ．Ｕｎｉｖ．、第１６巻、第４６−５４頁、１９９１年
【非特許文献４】Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、第１６巻（第１２号）、第１２９１−１２９３頁、１９９３年
【非特許文献５】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５１巻、第８９１−８９８頁、１９９９年
【非特許文献６】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第６６巻（第１４号）、第１３６９−１３７６頁、２０００年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、特異的に生理活性を有する冬虫夏草菌糸体の分画物の調製方法を見出した。
本発明の目的は、免疫賦活効果および／または癌の予防効果または治療効果を有する冬虫夏草菌糸体由来の分画物、および当該分画物を含む経口摂取用組成物、ならびに当該経口摂取組成物を含む飲食物、免疫賦活剤、抗癌剤および癌予防剤を提供することである。
【０００５】
すなわち本願発明の一つの側面によれば、冬虫夏草菌糸体を熱水抽出して得られる抽出液に、エタノールを加えることにより得られる沈殿画分が提供される。ここで加えるエタノールの量は、例えば前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量であってよい。
【０００６】
本発明の他の側面によれば、前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを当該抽出液に加え、生じる沈殿画分を取り除いた上澄み液として得られる抽出液に、当該抽出液が容積比で７０％〜９０％の量のエタノールを含むこととなる量のエタノールをさらに加えることより得られる前記沈殿画分が提供される。
【０００７】
本発明の他の側面によれば、前記沈殿画分であって、冬虫夏草菌糸体を熱水抽出液、および／または当該抽出液に一定量のエタノールを加え生じる沈殿画分を取り除いた上澄み液を、エタノールを加える前に濃縮し、その後エタノールを加えることにより得られる沈殿画分が提供される。本発明の他の側面によれば、前処理としてエタノールによる加熱抽出を行い得られる残査を前記冬虫夏草菌糸体として、熱水抽出して得られる抽出液に、エタノールを加えることにより得られる沈殿画分が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、前記沈殿画分が１０万以上の分子量を有する多糖類を含むことを特徴とする、前記沈殿画分が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、哺乳類における、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生亢進活性を有することを特徴とする、前記沈殿画分が提供される。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、前記沈殿画分をさらに透析により分子量分画することにより得られる分子量１０万以上の画分が提供される。
本発明の別の側面によれば、前記沈殿画分または分子量１０万以上の画分を含む経口摂取用組成物が提供される。また本発明の別の側面によれば、前記経口摂取用組成物を含む飲食物が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記経口摂取用組成物を含む免疫賦活剤が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記経口摂取用組成物を含む抗癌剤または癌予防剤が提供される。
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、前記画分の製造方法であって、
ａ）冬虫夏草菌糸体を８５〜１００℃で水による加熱抽出を行い抽出液を得る工程；および
ｂ）前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを、抽出液に加え、発生する沈殿を回収する工程、を含む前記製造方法が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記画分の製造方法であって、
ａ）冬虫夏草菌糸体を８５〜１００℃で水による加熱抽出を行い抽出液を得る工程；
ｂ）前記抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量のエタノールを、抽出液に加え、発生する沈殿を取り除き上澄み液を回収する工程；および
ｃ）前記上澄み液が容積比で７０％〜９０％の量のエタノールを含むこととなる量のエタノールをさらに当該上澄み液に加えることより得られる沈殿を回収する工程、を含む前記製造方法もまた提供される。
【００１０】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明における冬虫夏草とは、子のう菌類・麦角菌目・麦角菌科の一属を意味し、例えば、コルジセプス シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｙ）Ｓａｃｃａｒｄｏ）である。
【００１１】
本発明における冬虫夏草菌糸体は、培養により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよく、例えば培養物の乾燥粉末などが用いられる。
本発明において行われる熱水抽出は、例えば液温で７０〜１２０℃において行われる。好ましい温度は８５〜１００℃であり、より好ましくは９０〜９５℃である。抽出時間は、例えば１時間〜２４時間であり、好ましくは２〜１２時間であり、より好ましくは３〜７時間である。熱水抽出は複数回行ってもよく、例えば１〜４回、好ましくは２〜３回行われる。抽出に用いる水のｐＨ値は特に限定されないが、例えば蒸留水を用いて行うことができる。
【００１２】
前記熱水抽出により得られる抽出液は、そのまま使用することもできるが、使用するエタノールの量を低減させ効率よく分画物を得るために、当該抽出液を濃縮して使用することもできる。濃縮率は特に限定されないが、例えば容積比で８０〜２０％であってよく、好ましくは６０％〜２５％であり、さらに好ましくは５０％〜３０％である。また当該濃縮は常圧下または減圧下のいずれにおいても行われうるが、好ましくは減圧下で行われる。
【００１３】
抽出液に加えるエタノールの量は、特に限定されないが、例えば濃縮後の抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量であってよく、好ましくは０．８〜１．２倍であり、濃縮しない場合も同様である。得られた沈殿画分は、当該技術分野に周知の方法により精製することができ、例えば、再度水に溶解した後にエタノールを加えて沈殿画分を得る操作を１回または複数回行うことにより精製することもできる。
【００１４】
また、前記抽出液に一定量のエタノールを加え生じる沈殿画分を回収した後の上澄み液として得られる抽出液に、さらにエタノールを加えることにより、さらに沈殿画分を得ることもできる。当該上澄み液として得られる抽出液は、そのまま使用することもできるが、濃縮して使用することもできる。濃縮率は特に限定されないが、例えば容積比で８０〜２０％であってよく、好ましくは６０％〜２５％であり、さらに好ましくは５０％〜３０％である。また当該濃縮は常圧下または減圧下のいずれにおいても行われうるが、好ましくは減圧下で行われる。また、最初に加えるエタノールの量は、特に限定されないが、例えば濃縮後の抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍の量であってよく、好ましくは０．８〜１．２倍である。２回目にエタノールを加えた後の抽出液中に含まれるエタノールの量は特に限定されないが、例えば容積比で７０％〜９０％であってよく、好ましくは７５％〜８５％である。例えば抽出液に対する容積比で０．５〜２．０倍のエタノールを加えて生ずる沈殿画分を回収した後の上澄み液に、例えば減圧濃縮してエタノールを除去した後に、容積比で３．０〜５．０倍のエタノールを加え、沈殿画分を得ることもできる。
【００１５】
本発明における経口摂取用組成物とは、例えば、飲食物組成物および医薬組成物などを含むものである。
有効成分の含有量の高い分画物を得るために、本発明において熱水抽出に付される冬虫夏草菌糸体については前処理を行ってもよい。当該前処理は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜４のアルコールまたは当該アルコール水溶液を用いての加熱抽出などが挙げられ、好ましくはエタノールが用いられる。加熱の際の温度は、例えば液温で７０〜１２０℃、好ましくは８０〜１００℃であり、より好ましくは９０〜９５℃である。抽出時間は、例えば１時間〜２４時間であり、好ましくは２〜１２時間であり、より好ましくは３〜７時間である。エタノール抽出は複数回行ってもよく、例えば１〜４回、好ましくは２〜３回行われる。異なる溶媒を用いて複数回行ってもよく、例えば、９５〜９９．５％のエタノールを用いて抽出した後に、その残査を容積比で６０〜８０％のエタノール水溶液により抽出し、その残査を熱水抽出に付す原料として使用することができる。
【００１６】
本発明において得られる沈殿画分は、その成分として例えば多糖類などを含みうる。当該多糖類は、特に限定されないが、天然に存在する単糖類から構成されるものであり、その分子中の１または２以上の箇所においてアシル化、リン酸化などの修飾、またはタンパク質、核酸が結合することによる修飾を受けていてもよい。当該多糖類の分子量は、特に限定されないが、例えば、１０万以上２００万以下であり得る。本発明の画分の糖含量は、当該技術分野における当業者にとって周知の方法により測定することができ、例えばフェノール−硫酸法などを用いることができる。本発明の糖含量は、特に限定されないが、例えばＤ−グルコース換算で４０〜９０重量％であり、好ましくは５０〜８０重量％であり、さらに好ましくは６０〜８０重量％である。
【００１７】
前記沈殿画分は、例えば透析などの手段により、例えば分子量５万未満の画分、分子量５万以上１０万未満の画分、分子量１０万以上の画分に分画することができる。
本発明の免疫賦活剤は、哺乳類におけるインターフェロン−γおよび／また腫瘍壊死因子−αの産生亢進作用を有するため、免疫賦活を必要とする被験者に対して予防薬および／または治療薬として使用することができる。また、本発明の抗癌剤は、有意な抗腫瘍効果を示すことから、癌に対する有効な予防薬および治療薬となりうるものである。従って、本発明の免疫賦活剤および抗癌剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含みうる。
【００１８】
本発明の免疫賦活剤および抗癌剤の投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができるが、例えば、一般に１〜５０００ｍｇ／日／成人の用量で使用される。
【００１９】
また、本発明の経口摂取組成物は、そのまま機能性食品として使用できるほか、医薬部外品、飲食物等の成分、食品添加物などとして使用することができる。当該使用により、本発明の免疫賦活効果および抗腫瘍効果を有する当該経口摂取組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な免疫賦活による体質改善、癌の治療および癌の発症の予防が可能となる。本発明の経口摂取組成物が食品素材として使用される例としては、免疫賦活効果もしくは癌治療効果または予防効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）が挙げられる。
［実施例］
【００２０】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ コルジセプス シネンシス菌糸体の分画物の調製
本発明を実施するに当たり、原料となるコルジセプス シネンシス菌糸体培養物の粉末としては、例えば中国で市販されている"発酵虫草菌粉"（製品名：ＣＯＲＢＲＩＮ ＣＡＰＳＵＬＥ、製造会社：杭州中美華東製薬有限公司）を用いることができる。
【００２１】
原料の冬虫夏草菌糸体粉末を９９．５％エタノールで９０〜９５℃、６時間抽出した。エタノール量は、菌糸体１ｇあたり２ｍＬとした。残査を濾別し、再度残査をこの方法で抽出して濾過により抽出液と残査に分けた。２度の抽出で得られた抽出液は合わせて減圧濃縮し、粘凋な濃褐色液体のエタノールエキス（Ｅｔ Ｅｘｔ）を原料換算で１５．０％（重量比）得た。次に残査を７０％エタノール水溶液（体積比）で９０〜９５℃，６時間抽出した。７０％エタノールの量は、残査１ｇあたり２ｍＬとした。残査を濾別し、再度残査をこの方法で抽出して濾過により抽出液と残査に分けた。２度の抽出で得られた抽出液は合わせて体積が約４０％になるまで減圧濃縮し、凍結乾燥により濃褐色粉末の７０％エタノールエキス（７０％Ｅｔ Ｅｘｔ）を原料換算で４５．８％（重量比）得た。次に残査を蒸留水で９０〜９５℃，６時間抽出した。蒸留水量は、残査１ｇあたり４ｍＬとした。残査を濾別し、再度残査をこの方法で抽出して濾過により抽出液と残査に分けた。２度の抽出で得られた抽出液は合わせて体積が約４０％になるまで減圧濃縮し、体積比で等量の９９．５％エタノールを添加し、一晩冷暗所に静置した。遠心分離により沈殿物を回収し、蒸留水に溶解させて凍結し、凍結乾燥により吸湿性の高い濃茶色粉末の５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）を原料換算で１７．９％（重量比）得た。上清は体積が約４０％になるまで減圧濃縮した後に体積比で４倍量の９９．５％エタノールを添加し、一晩冷暗所に静置した。遠心分離により沈殿物を回収し、蒸留水に溶解させて凍結し、凍結乾燥により茶色粉末の８０％エタノール沈殿画分（８０％ＥＰ）を原料換算で６．０％（重量比）得た。
【００２２】
５０％エタノール沈殿画分を蒸留水に溶解し、スペクトラム社製Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＣＥ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ：１００，０００で蒸留水に対し透析する。５０％エタノール沈殿画分を溶解する蒸留水量は、画分１ｇあたり５０ｍＬとした。透析内液を凍結乾燥することにより原料換算で１０．０％（重量比）の分子量１０万以上の画分（Ｍ１）を得た。透析外液を減圧濃縮し、スペクトラム社製Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）６ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ：５０，０００で蒸留水に対し透析した。透析内液を凍結乾燥することにより原料換算で３．９４％（重量比）の分子量５万以上１０万未満の画分（Ｍ２）を得た。透析外液を減圧濃縮し、凍結乾燥することにより原料換算で３．４５％（重量比）の分子量５万未満の画分（Ｍ３）を得た。
【００２３】
Ｍ１画分について、フェノール−硫酸法による糖含量の定量を行った結果、Ｍ１画分の糖含量は、Ｄ（＋）−グルコース換算で６９．９％であった。なお、フェノール−硫酸法は、一般的な方法によりおこなった（例えば、「新実験化学講座２０ 生物化学［ＩＩ］」、１０８５頁、日本化学会編、１９７８年１０月２０日発行、丸善株式会社を参照のこと。）。
【００２４】
［製造例１］熱水抽出物の調製例
実施例における比較対照として用いている熱水抽出物は、以下の方法で調製した。冬虫夏草菌糸体粉末を蒸留水で９０〜９５℃，４時間撹拌しながら抽出した。蒸留水量は、菌糸体１ｇあたり２０ｍＬとした。残査を濾別し、濾液を減圧濃縮して凍結乾燥することにより吸湿性のある茶褐色粉末である熱水抽出物（ＨＷＥ）を得た。
【００２５】
［実施例２］ ヒト末梢血を用いた免疫賦活効果の測定
４８穴細胞培養用プレートに、ヒトから採血した末梢血５００μＬと、末梢血と等量のＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。被験物質を最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃，５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。培養上清を回収し、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）をそれぞれ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による測定キット（バイオソース社製）を用いて定量した。キットの使用方法と定量結果の解析方法はキット添付の手順書に従った。
【００２６】
実施例１において調製した５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）、８０％エタノール沈殿画分（８０％ＥＰ）、エタノールエキス（Ｅｔ Ｅｘｔ）、７０％エタノールエキス（７０％Ｅｔ Ｅｘｔ）および製造例１において調製した熱水抽出物（ＨＷＥ）について、ＩＦＮ−γ産生量およびＴＮＦ−αの産生量を測定した結果を、それぞれ図１および図２に示す。当該測定結果より、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのいずれにおいても、５０％ＥＰおよび８０％ＥＰは、ＨＷＥ、Ｅｔ Ｅｘｔおよび７０％Ｅｔ Ｅｘｔと比べて顕著な産生量亢進効果を有することが明らかとなり、ヒト由来の末梢血を用いた試験系における本発明の分画物の効果が確認された。また、５０％ＥＰは、８０％ＥＰと比してより高い亢進効果を有することも明らかとなった。
【００２７】
実施例１において調製した、５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）の分子量分画物Ｍ１（分子量１０万以上の画分）、Ｍ２（分子量５万以上１０万未満の画分）およびＭ３（分子量５万未満の画分）について、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生量を測定した結果を、それぞれ図３および図４に示す。当該測定結果より、ＩＦＮ−γ産生量およびＴＮＦ−αのいずれにおいても、Ｍ１が５０％ＥＰを上回る産生量亢進効果を有することが明らかとなった。また、当該産生量亢進活性はＭ１（分子量１０万以上の画分）のみに集中しており、５０％ＥＰにおけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生量亢進活性には、分子量１０万以上の化合物が深く関与していることが確認された。
【００２８】
［実施例３］ 担癌マウスを用いた抗腫瘍効果の測定
日本エスエルシー株式会社より購入した６週齢の交雑群Ｓｌｃ：ＢＤＦ１マウス雄３２匹を８匹１群として４群に分け、４匹を１ゲージに入れて１週間馴化させた。７週齢のマウスにマウスの腫瘍Ｓａｒｃｏｍａ１８０を１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ となるように右腋下の皮下に接種した。なお、接種に先立ち接種部の体毛を剃り、腫瘍の定着及び成長の観察をより正確に行うようにした。腫瘍成長は腫瘍の短径と長径をデジタルノギスで計測し、腫瘍の大きさ（長径×短径2／２ｍｍ3）を算出した。４群は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ群）、熱水抽出物群（ＨＷＥ群）、５０％エタノール沈殿画分群（５０％ＥＰ群）と８０％エタノール沈殿画分群（８０％ＥＰ群）であり、各群は腫瘍接種日から毎日午前１０時に被験物質をゾンデにより経口投与した。投与量は、ｃｏｎｔｒｏｌ群は生理食塩水を体重１０ｇあたり０．１ｍＬとなるように投与し、ＨＷＥ群はＨＷＥが２５０ｍｇ／ｋｇとなるように生理食塩水に溶解させて投与し、５０％ＥＰ群は５０％ＥＰが４４．８ｍｇ／ｋｇとなるように生理食塩水に溶解させて投与し、８０％ＥＰ群は８０％ＥＰが１５．０ｍｇ／ｋｇとなるように生理食塩水に溶解させて投与した。
【００２９】
７日目および１０日目の腫瘍体積の測定結果を図５に示す。当該測定結果より、ｉｎ ｖｉｖｏの試験系において、本発明の分画物の有する抗腫瘍活性が確認された。さらに投与量ではＨＷＥの１／５以下の５０％ＥＰが、ＨＷＥを上回る抗腫瘍効果を示すことも明らかとなり、同時にこの結果は実施例２における結果を支持するものであった。
【００３０】
［実施例４］Ａ４３１細胞増殖抑制試験
Ａ４３１細胞（ヒト扁平上皮癌細胞株；大日本製薬より入手）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）に４×１０4個／ｍＬとなるように懸濁し、９６穴マイクロプレート（住友ベークライト製）の各ウェルに５０μＬずつ（２×１０3個／ウェル）添加した。６時間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した後、被検物質としてＨＷＥ、７０％Ｅｔ Ｅｘｔ、５０％ＥＰ、８０％ＥＰをそれぞれ２０００μｇ／ｍｌおよび１０％ＦＢＳを含む培地を、各ウェルに５０μＬずつ添加（終濃度１０００μｇ／ｍｌ）した。２００μＭのＧｅｎｉｓｔｅｉｎを含む培地を５０μＬ添加したものを陽性対照とした。４日間培養した後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（和光純薬）を５μｌずつ添加し、６０分後の吸光度（波長４５０ｎｍ）を測定した。被検物質を含まない系との比較により抑制率を算出した。
【００３１】
試験結果を以下の表１に示す。当該試験結果においては、すべての被検物質が細胞増殖の抑制効果を示す中で、特に８０％ＥＰの抑制率が顕著に高かった。
【００３２】
【表１】


【００３３】
［実施例５］Ａ４３１細胞障害性試験
Ａ４３１細胞（ヒト扁平上皮癌細胞株；大日本製薬より入手）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）に５×１０5個／ｍＬとなるように懸濁し、９６穴マイクロプレート（住友ベークライト製）の各ウェルに１００μＬずつ（５×１０4個／ウェル）添加した。２４時間培養（３７℃， ５％ＣＯ2）した後、ＨＷＥ、７０％Ｅｔ Ｅｘｔ、５０％ＥＰ、８０％ＥＰをそれぞれ１０００μｇ／ｍＬ含む無血清培地に交換した。４８時間培養した後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（和光純薬）を５μＬずつ添加し、３０分後の吸光度（波長４５０ｎｍ）を測定した。被検物質を含まない系との比較により生存率を算出した。
【００３４】
試験結果を以下の表２に示す。当該試験結果においては、ＨＷＥおよび７０％Ｅｔ Ｅｘｔが若干の細胞毒性を示したのに対し、本発明の分画物である５０％ＥＰおよび８０％ＥＰは、Ａ４３１細胞の生存率に何らの影響も示さなかった。このことより、実施例４で５０％ＥＰおよび８０％ＥＰが示した細胞増殖抑制効果は、細胞障害性によるものではないことが確認された。
【００３５】
【表２】


【発明の効果】
【００３６】
本発明の経口摂取組成物は、免疫賦活作用および／または抗腫瘍作用を有することから、本発明は、免疫賦活のための有効な手段、および癌に対する有効な予防手段または治療手段を提供し、また健康食品の製造において有用な組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、熱水抽出画分（ＨＷＥ）、５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）、８０％エタノール沈殿画分（８０％ＥＰ）、エタノールエキス（Ｅｔ Ｅｘｔ）、７０％エタノールエキス（７０Ｅｔ Ｅｘｔ）のＩＦＮ−γの産生量亢進活性を、ヒト末梢血を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により測定した結果を示すものである。
【図２】図２は、熱水抽出画分（ＨＷＥ）、５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）、８０％エタノール沈殿画分（８０％ＥＰ）、エタノールエキス（Ｅｔ Ｅｘｔ）、７０％エタノールエキス（７０Ｅｔ Ｅｘｔ）のＴＮＦ−αの産生量亢進活性を、ヒト末梢血を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により測定した結果を示すものである。
【図３】図３は、透析による分子量分画により得られた、分子量１０万以上の画分（Ｍ１）、分子量５万以上１０万未満の画分（Ｍ２）および分子量５万未満の画分（Ｍ３）、熱水抽出画分（ＨＷＥ）および５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）のＩＦＮ−γの産生量亢進活性を、ヒト末梢血を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により測定した結果を示すものである。
【図４】図４は、透析による分子量分画により得られた、分子量１０万以上の画分（Ｍ１）、分子量５万以上１０万未満の画分（Ｍ２）および分子量５万未満の画分（Ｍ３）、熱水抽出画分（ＨＷＥ）および５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）のＴＮＦ−αの産生量亢進活性を、ヒト末梢血を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により測定した結果を示すものである。
【図５】図５は、熱水抽出画分（ＨＷＥ）、５０％エタノール沈殿画分（５０％ＥＰ）、８０％エタノール沈殿画分（８０％ＥＰ）をマウスに投与することによる、腫瘍体積の変動を示すものである。
【出願人】 【識別番号】０００１８６５８８
【氏名又は名称】小林製薬株式会社
【住所又は居所】大阪府大阪市中央区道修町四丁目３番６号
【出願日】 平成１５年７月１４日（２００３．７．１４）
【代理人】 【識別番号】１０００８９７０５
【弁理士】
【氏名又は名称】社本 一夫

【識別番号】１０００７６６９１
【弁理士】
【氏名又は名称】増井 忠弐

【識別番号】１０００７５２７０
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 泰

【識別番号】１０００８０１３７
【弁理士】
【氏名又は名称】千葉 昭男

【識別番号】１０００９６０１３
【弁理士】
【氏名又は名称】富田 博行

【識別番号】１０００９１６３８
【弁理士】
【氏名又は名称】江尻 ひろ子
【公開番号】 特開２００５−３５９２８（Ｐ２００５−３５９２８Ａ）
【公開日】 平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願番号】 特願２００３−２７４３６８（Ｐ２００３−２７４３６８）