| 【発明の名称】 |
抗アレルギー剤を含む飲食物 |
| 【発明者】 |
【氏名】辻 顕光
【氏名】山本 万里
【氏名】川本 恵子
【氏名】立花 宏文
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| 【要約】 |
【課題】副作用がなく、長期連用においても安全性の高い、かつ飲食物などのように日常的に用いるものに利用できるアレルギー疾患の治療、予防剤を提供すること。
【解決手段】ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する経口抗アレルギー剤を含む飲食物、並びに、アレルギー症状の予防,抑制,軽減のために、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する経口抗アレルギー剤を飲食物へ添加する方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項1】 ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する経口抗アレルギー剤を含む飲食物。 【請求項2】 アレルギー症状の予防,抑制,軽減のために、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する経口抗アレルギー剤を飲食物へ添加する方法。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】 【0001】 本発明は、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有する飲食物に関し、詳しくは即時型アレルギーを抑制する作用を有する飲食物に関するものである。 【背景技術】 【0002】 近年、アレルギー疾患の増加がみられ、生まれる子供の1/3がアトピー性皮膚炎もしくは喘息を発症するとの報告がある。また、花粉症発症の劇的な増加も大きな社会問題となっている。 食習慣の欧米化、大気汚染、食品添加物、ストレス過多といった私たちを取り巻く環境の変化が、このようなアレルギー症状増加の原因であると考えられている。 【0003】 アレルギー反応は、関与する免疫担当細胞や免疫グロブリンによりI型からIV型に分けられている。アレルギー性鼻炎,気管支喘息に代表される疾患はI型アレルギー反応に属しており,アレルゲンに曝露されることによりIgE 抗体が多量に産生され、そのIgE 抗体を介してマスト細胞や好塩基球からヒスタミン,ロイコトリエン,プロスタグランジン等のケミカルメディエータが産生・放出され、血管拡張,血管透過性亢進,気管支平滑筋の収縮,神経末端の刺激等が引き起こされることによる。そのため、I型アレルギー疾患の治療には、抗ヒスタミン剤とマスト細胞からのケミカルメディエータ遊離抑制作用をもつ抗アレルギー薬が使われている。 しかし、抗ヒスタミン剤や塩基性抗アレルギー薬には眠気,口渇,胃腸障害等の副作用があり、長期間に渡る連用が問題となる。 【0004】 IV型アレルギー反応は、T細胞が関与する遅延型の反応で、ランゲルハンス細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞を介して抗原情報を受けたT細胞が、様々なサイトカインを産生・放出し、これにより好酸球やマクロファージの集積により遅延型の炎症反応が起こるものである。 アレルギー性接触皮膚炎は、IV型アレルギー反応に基づいて発症する代表的な疾患である。IV型アレルギー疾患の治療には、ステロイド剤が用いられるが、このステロイド剤は、T細胞のサイトカイン産生を抑制して、湿疹の治療では劇的な効果を示す。その反面、長期間の連用によって、副腎皮質機能の低下,皮膚紅潮,委縮,毛細血管拡張などの重篤な副作用を引き起こす可能性がある。 【0005】 一方、茶は代表的な嗜好飲料であり、2000年余にも渡り多くの人々に飲用されてきた。また、茶は様々な生理機能を有していることが判明しており、例えば抗酸化作用,抗腫瘍作用,発ガン抑制作用,抗菌作用,抗ウイルス作用,抗う触作用などが報告されている。 アレルギー作用に関しては、特許文献1において、ウーロン茶抽出物を主成分とする抗アレルギー剤としてマスト細胞からのヒスタミン遊離抑制作用を指標としてI型アレルギー反応に対する治療薬の例が、特許文献2において、天然カフェインのI型アレルギー症状の血管透過性亢進作用反応に有効な事例が、特許文献3および4において、ウーロン茶抽出物を有効成分とする抗アレルギー剤,抗炎症剤,抗アトピー性皮膚炎剤,抗乾癬剤とした治療薬の例が挙げられている。 さらに、エピガロカテキンガレート,エピカテキンガレートなどの緑茶カテキン類が、ラット腹腔内マスト細胞からのヒスタミン遊離を抑制することが報告されている(非特許文献1および2)。しかし、ストリクチニン等のポリフェノール類がアレルギー反応の起源となるB細胞によるIgE 産生を抑制するとの報告は行われていない。 【0006】 【特許文献1】特開平3−258726号公報 【特許文献2】特開平7−17865号公報 【特許文献3】特開平10−77231号公報 【特許文献4】特開平10−175874号公報 【非特許文献1】日本食品科学工学会誌,Vol.42, No.11, pp 952-958, 1995 【非特許文献2】Allergy, Vol.52, No.1, pp 58-64, 1997 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 【0007】 アレルギー疾患に応じた医薬品が開発され、治療に用いられているが、これらは副作用を伴うため、長期連用が可能で、安全性が高く副作用のない、天然物由来の抗アレルギー剤の開発が強く望まれていた。 そこで、本発明の目的は、副作用がなく、長期連用においても安全性の高い、かつ飲食物などのように日常的に用いるものに利用できるアレルギー疾患の治療、予防剤を提供することである。 【課題を解決するための手段】 【0008】 本発明者らは、上記の課題を解決するため、抗アレルギー作用を有する物質をIgE 産生抑制効果を指標にスクリーニングを行い、ストリクチニン等のポリフェノール類にこれらの効果があることを見出し、かかる知見に基づいて本発明に到達した。 【0009】 請求項1記載の本発明は、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する経口抗アレルギー剤を含む飲食物である。 請求項2記載の本発明は、アレルギー症状の予防,抑制,軽減のために、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも1種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する経口抗アレルギー剤を飲食物へ添加する方法である。 【発明の効果】 【0010】 本発明の抗アレルギー剤を含有する飲食物は、アレルギー反応に基づく症状の予防,抑制又は軽減に有効である。さらに、この飲食物は、茶に含まれるストリクチニン等のポリフェノール類を有効成分としているため、安全性にも優れ、長期連用の場合にも人体に有害な副作用がなく、日常的に使用できる。 ストリクチニン等のポリフェノール類を主体とする茶抽出物を含む飲食物を日常的に摂取することにより、アレルギー反応による症状の予防や軽減に役立てることができる。 【発明を実施するための最良の形態】 【0011】 本発明に係るストリクチニンは、下記の構造式で表される化合物であり、本発明には当該化合物の他、そのメチル化誘導体ポリフェノール類あるいはこれらの混合物も使用することができる。ポリフェノール類としては、例えばグルコースのC1〜C4及びC6の水酸基の少なくとも1つにガロイル基、ジガロイル基、トリガロイル基、ヘキサヒドロキシフェノイル基、3−O−メチルガロイル基、4−O−メチルガロイル基が導入されたもの等が挙げられる。 【0012】 【化1】
【0013】 茶 (camellia sinensis)は、古来より飲用され、長期にわたって常飲されているが、人体に悪影響はなく、非常に安全性の高い飲料であることが認められている。そのため、本発明で使用するストリクチニン等のポリフェノール類を主体とする茶葉抽出物も、安心して摂取することが受け入れられるものである。 【0014】 本発明に使用するストリクチニン等のポリフェノール類は、‘やぶきた’などの乾燥茶葉を水系溶剤で抽出して得られるポリフェノール画分から分離、採取することができる。抽出物が、最終的に飲食物や化粧料等に利用され、摂取されることを考えると、安全性の立場から、水,エタノールまたはこれらの混合物を溶剤として用いるのが好ましい。 【0015】 抽出に際して、茶葉と溶剤との比率(重量比)は、特に限定されないが、茶葉1に対して溶剤5から100倍の割合が好ましい。抽出温度についても、特に限定されるものではなく、通常は室温〜常圧下で溶剤の沸点の範囲が作業上都合がよい。抽出時間は、10分から6時間の範囲とするのが好ましい。 【0016】 本発明において用いるストリクチニン等のポリフェノール類を主体とする茶葉抽出物は、抽出物をそのままの形で、あるいは抽出物をエキス、粉末化して飲食物の形として投与できる。一般に用いられている飲食物素材及び飲食物製造上許容される担体等と配合し、飲料として混合茶ドリンク,炭酸飲料,果実飲料,乳酸菌飲料,スポーツ飲料,豆乳などが挙げられる。また、菓子類としては、例えばビスケット類,チョコレート類,キャンデー類,チューインガム類,スナック菓子類,油菓類,洋生菓子類,和菓子類,アイスクリーム類,ゼリー菓子等が挙げられ、食品としては、パン類,めん類,豆腐などの大豆加工品,ヨーグルト,バターなどの乳製品,ハム,ソーセージなどの肉製品,玉子焼き,かまぼこなどの魚肉練り製品,ソース,ドレッシング,マヨネーズ,ふりかけなどの調味料,カレー,シチュー、ハンバーグ,スープなどの料理が挙げられる。これらは、常法により製造することができる。 【0017】 飲食物製造上許容できる担体としては、砂糖,ブドウ糖,果糖,異性化液糖,フラクトオリゴ糖,アスパルテーム,ソルビトール,ステビアなどの甘味料;赤キャベツ色素,ぶどう果皮色素,エルダベリー色素,カラメル,クチナシ色素,コーン色素,サフラン色素,カロチン等の着色料;ペクチン分解物,安息香酸,ソルビン酸,パラオキシ安息香酸エステル類,ソルビン酸カリウムなどの保存料;アルギン酸ナトリウム,アルギン酸プロピレングリコールエステル,繊維素グリコール酸カルシウム,繊維素グリコール酸ナトリウム等の糊料;L−アスコルビン酸,トコフェロール,エリソルビン酸,ルチンなどの酸化防止剤;硫酸第一鉄,亜硝酸ナトリウム,硝酸カリウムなどの発色剤;亜硫酸水素ナトリウム,メタ重亜硫酸カリウムなどの漂白剤;プロピレングリコールなどの品質保持剤;L−システイン塩酸塩,ステアリル乳酸カルシウムなどの品質改良剤;塩化アンモニウム,d−酒石酸水素カリウム,炭酸アンモニウム,炭酸カリウム,炭酸水素ナトリウム,ミョウバンなどの膨張剤;レシチン,スフィンゴ脂質,植物性ステロール,大豆サポニン,アルギン酸ナトリウム,アルギン酸プロピレングリコールエステル,カゼインナトリウム,グリセリン脂肪酸エステル,ショ糖脂肪酸エステル,ソルビタン脂肪酸エステルなどの乳化剤;コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの乳化安定剤;レモン油,ユーカリ油,ハッカ油,バニラ抽出物,オレンジ油,ガーリック油,アセト酢酸エチル,アニスアルデヒド,エチルバニリン,桂皮酸,酢酸シトロネリル,シトラール,バニリン,酪酸ブチル,エステル類などの着香料;L−アスコルビン酸,L−アスパラギン,L−アラニン,イノシトール,L−グルタミン,カロチン,トコフェロール,ビタミンA,葉酸,クエン酸鉄,ヘム鉄,未焼成カルシウムなどの強化剤;過酸化ベンゾイル,過硫酸アンモニウム,二酸化塩素などの小麦粉改良剤;サラシ粉,過酸化水素,次亜塩素酸等の殺菌料;アセチルリシノール酸メチル,エステルガム,酢酸ビニル樹脂,ポリイソブチレン,ポリブテンなどのチューインガム基礎剤;D−マンニットなどの粘着防止剤;酸性ピロリン酸ナトリウム,ピロリン酸カリウム,ピロリン酸ナトリウムなどの結着剤;アジピン酸,クエン酸,グルコン酸,コハク酸,D−酒石酸,乳酸,DL−リンゴ酸などの酸味料;魚介エキス,酵母エキス,昆布エキス,しょうゆ,トマトピューレ,肉エキス,みりん,果実ピューレ,かつおぶし,L−アスパラギン酸ナトリウム,DL−アラニン,L−アルギニン,L−グルタミン酸塩,5’−イノシン酸二ナトリウム,クエン酸三ナトリウム,L−グルタミン酸,L−グルタミン酸ナトリウム,コハク酸,L−酒石酸,乳酸ナトリウムなどの調味料などがある。 【0018】 本発明において、ストリクチニン等のポリフェノール類は、使用目的などを考慮して適量を用いればよく、飲食物の場合は、有効成分であるストリクチニン等のポリフェノール類は、1日に5〜100mg/kg、好ましくは5〜50mg/kgの範囲で用いる。なお、1日1回もしくは数回に分けて使用することができる。 【実施例】 【0019】 次に、本発明を詳細に説明するための代表的な実施例や実験例等を示すが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。 実験例1 各種茶葉からのポリフェノール画分の抽出(茶葉抽出物) マイクロ波にて乾燥した茶葉100gを50%メタノールで抽出し、抽出画分を30%クロロホルムで抽出した。その水相をさらに酢酸エチルで抽出した後の酢酸エチル層をODSカラムで分画した。ストリクチニンの精製方法の1例を図1に示す。分画したそれぞれの画分を、Fr.1〜5とした。Fr.1〜5は、すべて一度凍結乾燥し、それを各1mg/mLとなるように、Fr.1〜2は水、Fr.3〜4は0.2%DMSO、Fr.5は0.1%DMSOで溶解した。 【0020】 実験例2 活性画分の同定 実験例1のFr.1〜5について、それぞれ in vitro での抗アレルギー作用をヒトB細胞でのIgE 産生抑制(IgE クラススイッチ抑制)を調べる IgE重鎖胚型転写物発現法で評価した。ヒトB細胞をIL−4で刺激して IgE産生を誘導すると、Ig遺伝子の定常部領域遺伝子のうちε領域(Cε)にあたる上流イントロンから転写が開始されて転写産物(CεGT:胚型転写物)が発現し、その後DNA組換えにより IgEのクラススイッチが引き起こされることを利用した方法である。CεGTは IgE産生が誘導される前に必ず発現するRNAであり、CεGT発現量と IgE遺伝子のクラススイッチ量は比例している。そのため、CεGT発現量の程度を検出することにより、 IgEクラススイッチ量を推定することができる。 【0021】 IgE 重鎖胚型転写発現法は、以下の手順で行った。 ヒトB細胞株DND39(林原生物化学研究所より入手)を1×105 個/mLに調製し、IL−4を終濃度25U/mLとなるように添加して刺激した。このとき、実験例1で得たFr.1〜5を濃度10μg/mLにてIL−4と同時に添加した。 一方、上記ヒト細胞株にIL−4(終濃度25U/mL)と2ng/mLのトランスフォーミング成長因子β(TGF−beta、ペプロテック社製)を添加したものを、CεGTの発現を抑制するポジティブコントロールとした。 これらを48時間培養後、遠心分離(300×g、37℃)を行って細胞を集め、全RNAをRNA採抽出試薬(商品名:Trizol、ギブコ社製)1mLで抽出した。 【0022】 次いで、以下の手順によりcDNAライブラリーを作製した。まず、抽出した全RNAの濃度を吸光光度計で測定し、10μg分を0.6mLチューブに取り、水を加えて11.8μLとなるようにした。これに0.5μg/μLのオリゴdTプライマー及び20μMのCεGTアンチセンスプライマーをそれぞれ1.0μL加えた。このチューブを70℃で10分間インキュベートした後、続いて氷中で10分間急冷し、mRNAとオリゴdTプライマー、CεGTアンチセンスプライマーをアニールさせた。これにRNase−freeの10mM dNTP(アマシャム社製)2.0μLとMMLV−reverse transcriptase(アマシャム社製)に付属の5×buffer 4.0μL、RNase inhibitor(宝酒造製)0.1μL、MMLV−reverse transcriptase 0.1μL(終濃度20−200unit/チューブ)を混合した。これを37℃で1時間インキュベートし、cDNAを合成した。合成したcDNAは、PCRを行い増幅した。Gene bankに登録されているCεGT及びヒトGAPDHの塩基配列をもとにセンス並びにアンチセンスプライマーを作成した。その構造を配列表に示す。すなわち、CεGTセンスプライマーを配列番号1に、CεGTアンチセンスプライマーを配列番号2に、ヒトGAPDHセンスプライマーを配列番号3に、ヒトGAPDHアンチセンスプライマーを配列番号4に、それぞれ示す。 【0023】 当該プライマーを用いてポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)法によりCεGT−DNAを増幅させた。PCRの鋳型としてcDNA原液を1μL用い、CεGT検出の際には10mM dNTP 0.8μL、センスプライマー0.5μL、アンチセンスプライマー0.5μL、AmpliTaq Gold(パーキンエルマー社製)0.1μL、AmpliTaq Gold付属の10×buffer 1μLを混合し、蒸留水を加えて総量10μLとした。 GAPDHの検出の際には10mM dNTP 0.8μL、MgCl2 1μL、センスプライマー0.5μL、アンチセンスプライマー0.5μL、Taqポリメラーゼ(ファーメンタス社製)0.1μL、Taqポリメラーゼ付属の10×Taq buffer 1μLを混合し、蒸留水を加えて総量10μLとした。 PCRは、GeneAmp PCR System2400(パーキンエルマー社製)を用いて行い、その条件は次の通りである。CεGT検出の際には、95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間を15サイクル行い、最後に72℃で7分間反応させた。GAPDH検出の際には、95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間を10サイクル行い、最後に72℃で7分間反応させた。次に、得られたPCR産物について、分離用アガロースゲル(濃度1%、サワディーテクノロジー社製)で電気泳動を行った。電気泳動終了後、プラスチャージのナイロン膜(アマシャム社製)に転写した(サザントランスファー)。 【0024】 続いて、泳動パターンが転写したナイロン膜に、上記のPCRにおいて15回増幅したCεGT−DNAを蛍光標識したオリゴDNA(ヒトCεGTの塩基配列をもとに、PCRに用いた前述のセンス及びアンチセンスプライマーに挟まれる領域からオリゴヌクレオチド(配列表の配列番号5)を選びだし、このオリゴヌクレオチドをオリゴラベリングキット(アマシャム社製)を用いて調製したもの)をプローブとして用いて、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、蛍光検出薬であるCDP−Star(アマシャム社製)と反応させ、その蛍光強度によりCεGTの発現量を測定した。図2は、ヒトB細胞株DND39におけるIL−4によるCεGT誘導発現に対する各フラクションの影響を表したものである。図中、GADPHはグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素を表し、□はコントロールを表している。 図2から明らかなように、Fr.3の画分において、CεGTの発現量は他の画分よりも抑制されていた。このことから、Fr.3の画分に活性成分があることが判明し、その後、ODSカラムを用いて細かく分画し、その中の1つの画分がストリクチニンのみを含む画分であることを確認した。 【0025】 実験例3 ヒトB細胞株における抗アレルギー活性の測定 実験例2で活性成分と同定したストリクチニンを用いて、ヒトB細胞株における抗アレルギー活性の測定を、実験例2のIgE 重鎖胚型転写物発現法と同様に測定した。なお、ストリクチニンは、IL−4と同時に添加した。ストリクチニンの添加濃度は1,10,25μMである。図3は、ヒトB細胞株DND39におけるIL−4によるCεGT誘導発現に対するストリクチニンの影響を示したものである。図中、GADPHはグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素を表し、□はコントロールを表している。 図3に示した通り、ストリクチニンは、ヒトB細胞株においてIL−4添加によるIgE クラススイッチを強く抑制することが明らかとなった。IgE はアレルギー反応に深く関与する免疫グロブリンであるため、IgE クラススイッチを抑制することは抗アレルギー活性を有することを意味する。 【0026】 実験例4 ヒト末梢血正常細胞における抗アレルギー活性の測定 実験例3のヒトB細胞株DND39の代わりに、ヒト末梢血正常細胞(単核球:ヒト健常人ボランティアより採血し、その血液から分離した)を用いて、抗アレルギー活性を実験例2のIgE 重鎖胚型転写物発現法と同様に測定した。この例においても、実験例2と同様に、ストリクチニンはIL−4と同時に添加した。なお、ストリクチニンの添加濃度は25μMとした。図4は、ヒト末梢血正常細胞におけるIL−4によるCεGT誘導発現に対するストリクチニンの影響を表したものである。図中、GADPHはグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素を表し、□はコントロールを表している。 図4に示した通り、ストリクチニンはヒト末梢血正常細胞において、IL−4添加によるIgE クラススイッチを強く抑制する作用を有しており、抗アレルギー活性を有することが認められた。 【0027】 実施例1 飴の製造 以下の材料を使用して、常法にしたがって飴を製造した。なお、ストリクチニン等を含有するポリフェノール画分としては、実験例1のFr.3を用いた(以下の実施例はすべて同じ。)。 粉末ソルビトール 97.7g 香料 0.2g ソルビトールシード 0.05g ストリクチニン等を含有するポリフェノール画分 0.05g 合計 100g 【0028】 実施例2 チューインガムの製造 以下の材料を使用して、常法にしたがってチューインガム製造した。 ガムベース 20g 炭酸カルシウム 2g ステビオサイド 0.1g ストリクチニンを含有するポリフェノール画分 0.05g 乳糖 76.85g 香料 1g 合計 100g 【図面の簡単な説明】 【0029】 【図1】ストリクチニンの精製方法の1例を示したフローチャートである。 【図2】分画した各画分のIL−4によるCεGT誘導発現に対する影響を表したものである。 【図3】ヒトB細胞株DND39におけるIL−4によるCεGT誘導発現に対するストリクチニンの影響を表したものである。 【図4】ヒト末梢血正常細胞におけるIL−4によるCεGT誘導発現に対するストリクチニンの影響を表したものである。
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| 【出願人】 |
【識別番号】501203344 【氏名又は名称】独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
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| 【出願日】 |
平成17年3月22日(2005.3.22) |
| 【代理人】 |
【識別番号】100074077 【弁理士】 【氏名又は名称】久保田 藤郎
【識別番号】100086221 【弁理士】 【氏名又は名称】矢野 裕也
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| 【公開番号】 |
特開2005−198664(P2005−198664A) |
| 【公開日】 |
平成17年7月28日(2005.7.28) |
| 【出願番号】 |
特願2005−80892(P2005−80892) |
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