| 【発明の名称】 |
乳酸菌含有食品組成物 |
| 【発明者】 |
【氏名】松山 恵理子
【住所又は居所】東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号わかもと製薬株式会社内
【氏名】澤井 映里
【住所又は居所】東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号わかもと製薬株式会社内
【氏名】鈴木 信之
【住所又は居所】東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号わかもと製薬株式会社内
【氏名】平田 晴久
【住所又は居所】東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号わかもと製薬株式会社内
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| 【要約】 |
【課題】乳酸菌の機能を高める作用を有し、かつ保健効果を有する食品成分を配合した、より有効な乳酸菌含有食品の提供。
【解決手段】生きた乳酸菌、該乳酸菌培養物、該乳酸菌培養ろ液、又はその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、紫玄米抽出物、ギムネマ抽出物、甘草抽出物、ハス胚芽抽出物、緑茶抽出物、黄杞葉抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、ラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、イチョウ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、ドクダミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、キシリトール、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、紅麹、アスパルテーム、シイタケ抽出物、ウコン抽出物、クランベリー抽出物、ラズベリー抽出物、ブルーベリー抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種を含有する食品組成物。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、紫玄米、ギムネマ、甘草、ハス胚芽、緑茶、黄杞葉、ルイボス茶、ヨモギ、ラカンカ、月桃葉、イチョウ、刺梨、マリアアザミ、ドクダミ、大棗、カリン、霊芝、サンザシ、キシリトール、枸杞子、エレウテロコック、紅麹、アスパルテーム、シイタケ、ウコン、クランベリー、ラズベリー、ブルーベリーからなる群から選ばれた少なくとも１種を含有する食品組成物。
【請求項２】
生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、及びその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種と、紫玄米抽出物、ギムネマ抽出物、甘草抽出物、ハス胚芽抽出物、緑茶抽出物、黄杞葉抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、ラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、イチョウ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、ドクダミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、紅麹抽出物、シイタケ抽出物、ウコン抽出物、クランベリー抽出物、ラズベリー抽出物、ブルーベリー抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種を含有する食品組成物。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス属に属する乳酸菌である請求項１又は２記載の食品組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・サリバリウスである請求項３記載の食品組成物。
【請求項５】
ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガッセリである請求項３記載の食品組成物。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌に１種以上の保健効果を有する食品成分を配合した食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、乳酸菌製剤を、極めて安全性に優れた整腸用医薬品として長年使用してきた。又、乳酸菌を含有する整腸用のいわゆる健康食品も多数市販されている。さらに、従来から健康的な食品として親しまれていた、乳酸菌を含有するヨーグルトや醗酵乳が、最近、おなかの調子をととのえる特定保健用食品の承認を受け、注目を集めている。一方、欧米でも乳酸菌含有食品（プロバイオティクス）は、整腸効果のみならず、多様な作用を発揮して健康維持に効果を示す保健健康食品の代表選手として注目され、多数市販されている。又、プロバイオティクスの製品開発を目的とした乳酸菌の研究が盛んに行われている（Reuter G.: 腸内フローラとプロバイオティクス（光岡知足編）、17-39頁、学会出版センター 、1998年)。
【０００３】
乳酸菌は以下に示す多様な機能を有することが研究されている(Sanders ME 及び Huis in't Veld J：Antonie van Leeuwenhoek、76巻、293-315頁、1999年)。1）乳糖消化補助、2）腸管病原菌抵抗性、3）大腸癌発癌抑制、4）小腸細菌過剰増殖抑制、5）免疫機能調節、6）抗アレルギー、7）血中脂質低下、8）降圧、9）尿路感染抑制、10）ヘリコバクター・ピロリ感染抑制、11）肝性脳疾患抑制。さらに最近では、乳酸菌による歯磨きが歯周病に対しても効果を示すことが示された（今井龍弥：歯周病が3日でよくなる乳酸菌歯みがき、マキノ出版、2000年）。このように、乳酸菌は、腸内菌叢のみならず、口腔、胃等、他の消化管内菌叢及び膣等、泌尿生殖器内菌叢のバランスを改善することにより宿主にとって有益な作用、保健効果をもたらすことがわかってきた。
【非特許文献１】Reuter G.: 腸内フローラとプロバイオティクス（光岡知足編）、17-39頁、学会出版センター 、1998年
【非特許文献２】Sanders ME 及び Huis in't Veld J：Antonie van Leeuwenhoek、76巻、293-315頁、1999年
【非特許文献３】今井龍弥：歯周病が3日でよくなる乳酸菌歯みがき、マキノ出版、2000年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上のように乳酸菌単独の摂取でも種々の保健効果が期待されるが、乳酸菌の機能を高める作用を有し、かつ保健効果を有する食品成分を乳酸菌と同時に摂取すれば、より顕著な保健効果を得ることが期待される。ところが、この観点に基づいた乳酸菌及び他の食品成分の組合せについてはこれまでにほとんど検討されていない。本発明は、乳酸菌の機能を高める働きを有し、かつ保健効果を有する食品成分を配合した、より有効な乳酸菌含有食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、乳酸菌の機能の一指標として、消化管病原菌（好ましくはヘリコバクター・ピロリ、腸炎ビブリオ、サルモネラ、黄色ブドウ球菌又は大腸菌等）および口腔内病原菌（好ましくはミュータンス等虫歯菌又はジンジバリス等歯周病菌等）に対する増殖抑制効果に注目し、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、生きた乳酸菌、該乳酸菌含有物、該乳酸菌培養ろ液、又はその処理物に添加することにより、乳酸菌単独と比較して、消化管病原菌に対する増殖抑制効果を高める作用を示す食品成分を発見した。すなわち本発明は、生きた乳酸菌、該乳酸菌培養物、該乳酸菌培養ろ液、又はその処理物からなる群から選ばれた少なくとも１種（以下、これらの成分を「乳酸菌成分」と呼ぶこともある）と、紫玄米、ギムネマ、甘草、ハス胚芽、緑茶、黄杞葉、ルイボス茶、ヨモギ、ラカンカ、月桃葉、イチョウ、刺梨、マリアアザミ、ドクダミ、大棗、カリン、霊芝、サンザシ、キシリトール、枸杞子、エレウテロコック、紅麹、アスパルテーム、シイタケ、ウコン、クランベリー、ラズベリー、ブルーベリー等及び、これらの抽出物が得られる場合は、これらの抽出物が挙げられるが、好ましくは紫玄米、甘草、ハス胚芽、黄杞葉、ルイボス茶、ラカンカ、月桃葉、マリアアザミ、大棗、カリン、霊芝、サンザシ、キシリトール、枸杞子、エレウテロコック、紅麹、アスパルテーム、シイタケ、ウコン、クランベリー、ラズベリー、ブルーベリー及び、これらの抽出物が得られる場合は、これらの抽出物からなる群から選ばれた少なくとも１種（以下、これらの成分を「添加食品成分」と呼ぶこともある）を含有する食品組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、乳酸菌の機能を高める働きを有し、かつ保健効果を有する食品成分が配合された、より有効な乳酸菌含有食品組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明に用いる乳酸菌としては特に制限はないが、ラクトバチルス属の乳酸菌、特にヒト消化管内常在菌であるラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）が安全性の面でも好適である。これら乳酸菌は、本発明の組成物の一日摂取量あたり、乳酸菌数で、好ましくは100万個から1000億個、より好ましくは1億個から1000億個、最も好ましくは10億個から1000億個を配合することが望ましい。
【０００８】
生きた乳酸菌としては、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。乳酸菌含有物としては、乳酸菌懸濁液；乳酸菌培養物（菌体、培養上清液、培地成分を含む）；等が挙げられる。乳酸菌培養ろ液としては、乳酸菌培養物から乳酸菌を除去した培養ろ液が挙げられる。処理物としては、乳酸菌、乳酸菌含有物、乳酸菌培養ろ液の濃縮物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物）、液状物、希釈物等が挙げられる。
【０００９】
乳酸菌成分の配合量は、任意でよいが、通常0.0001〜90質量％、好ましくは0.001〜20質量％、さらに好ましくは0.01〜10質量％の範囲が適当である。添加食品成分の配合量は、保健効果が得られるものであれば、特に限定されるものでないが、好ましくは、通常0.0001〜90質量％、好ましくは0.001〜30質量％である。
【００１０】
本発明の食品組成物の形態は、乳酸菌成分の少なくとも１種と、添加食品成分の少なくとも１種を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、粉末、錠菓、チューインガム、キャンデー、チョコレート、ヨーグルト等の形態が好ましい例として挙げられる。
【００１１】
本発明の食品組成物には、乳酸菌成分と添加食品成分以外に、通常食品組成物に含まれるような添加物、食品成分、例えば有機酸、糖、糖アルコール、甘味料、香料、ビタミン、ｐＨ調整剤等を適宜配合することができる。
【００１２】
以下に試験例、実施例を示し、より詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されないことは言うまでもない。なおこの明細書中「％」は、他に明記しない限り「質量％」である。使用した乳酸菌株はラクトバチルス・サリバリウスWB21株（FERM BP-7792）（以下、Ｌｓと記載）、ラクトバチルス・ガッセリWB2001株（医療用乳酸菌製剤レベニンSの配合菌株で旧分類名はLactobacillus acidophilus）である。
【実施例】
【００１３】
試験例１ 乳酸菌のヘリコバクター・ピロリの増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌によるヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori ATCC43504、以下Ｈｐと記載）の増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。乳酸菌成分として、培養ろ液を用いた。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：馬血清を5％となるように添加したBrain Heart Infusion培地（ディフコ）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を25％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、グルコースを1％となるように添加したGAM培地（日水製薬）で37℃、24時間培養したＬｓの培養液を遠心分離（7200 rpm、20分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過して調製したもの。
Ｈｐ生菌数測定培地：馬脱繊維血を5％となるように添加したBrain Heart Infusion寒天培地
ＨｐをＨｐ生菌数測定培地で37℃、3〜4日間微好気培養したシャーレ2枚分の菌体をかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）1 mlに懸濁した。この菌懸濁液4 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、0.05〜10％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び0.05〜10％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で48時間微好気培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｈｐ生菌数測定培地に塗布し、37℃で4日間微好気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表１に示した。
【００１４】
【表１】
【００１５】
表１に示したように、Ｈｐの増殖に対し、紫玄米抽出物、甘草抽出物、ハス胚芽抽出物、緑茶抽出物、黄杞葉抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、ラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、ドクダミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、キシリトール、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、紅麹、アスパルテーム、クランベリー抽出物がＬｓの培養ろ液の増殖抑制効果を高める作用を示した。特に紫玄米抽出物、甘草抽出物、ハス胚芽抽出物、黄杞葉抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、ラカンカ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、ドクダミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、霊芝抽出物、サンザシ抽出物、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、紅麹、アスパルテーム、クランベリー抽出物はＬｓの培養ろ液の増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００１６】
試験例２ 乳酸菌の腸炎ビブリオの増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌による腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus ATCC17802、以下Ｖｐと記載）の増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを1％となるように添加したGAM培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を10％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、試験例１に記載したのと同様の方法で調製したもの。
Ｖｐ生菌数測定培地：TCBS寒天培地（日水製薬）
Ｖｐを培地Ａで37℃、一晩培養した前培養液2 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、0.1〜10％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び0.05〜10％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で6時間静置培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｖｐ生菌数測定培地に塗布し、37℃で一晩好気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表２に示した。
【００１７】
【表２】
【００１８】
表２に示したように、Ｖｐの増殖に対し、紫玄米抽出物、ギムネマ抽出物、甘草抽出物、ハス胚芽抽出物、緑茶抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、ラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、イチョウ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、サンザシ抽出物、キシリトール、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、アスパルテーム、シイタケ抽出物、ウコン抽出物が、Ｌｓの培養ろ液の増殖抑制効果を高める作用を示した。特に紫玄米抽出物、ギムネマ抽出物、甘草抽出物、ハス胚芽抽出物、緑茶抽出物、ルイボス茶抽出物、ヨモギ抽出物、ラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、イチョウ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、サンザシ抽出物、キシリトール、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、シイタケ抽出物、ウコン抽出物は、Ｌｓの培養ろ液の増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００１９】
試験例３ 乳酸菌のサルモネラの増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌によるサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis、以下Ｓｅと記載）の増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを1％となるように添加したGAM培地（日水製薬）
培地Ｂ：Ｌｓの培養ろ液を50％となるように添加した培地Ａ
Ｌｓの培養ろ液は、試験例１に記載したのと同様の方法で調製したもの。
Ｓｅ生菌数測定培地：DHL寒天培地（日水製薬）
Ｓｅを培地Ａで一晩培養した前培養液2 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、1〜25％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び1〜25％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で6時間静置培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｓｅ生菌数測定培地に塗布し、37℃で一晩好気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表３に示した。
【００２０】
【表３】
【００２１】
表３に示したように、Ｓｅの増殖に対し甘草抽出物、緑茶抽出物、黄杞葉抽出物、ラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、イチョウ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、ドクダミ抽出物，大棗抽出物、カリン抽出物、霊芝抽出物，サンザシ抽出物、枸杞子抽出物、エレウテロコック抽出物、紅麹、ウコン抽出物がＬｓの培養ろ液の増殖抑制効果を著しく高める作用を示した。特にラカンカ抽出物、月桃葉抽出物、イチョウ抽出物、刺梨抽出物、マリアアザミ抽出物、大棗抽出物、カリン抽出物、霊芝抽出物，サンザシ抽出物、枸杞子抽出物はＬｓの培養ろ液の増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００２２】
試験例４ 乳酸菌のヘリコバクター・ピロリの増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌とＨｐを混合培養し増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。混合培養に用いた乳酸菌液は１%になるようにグルコースを添加したＧＡＭ培地を用いて２０時間培養し、これを乳酸菌液とした。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：馬血清を5％となるように添加したBrain Heart Infusion培地（ディフコ）
培地Ｂ：Ｈｐ接種時に乳酸菌液を1％接種した培地Ａ
Ｈｐ生菌数測定培地：ヘリコバクター寒天培地(ニッスイ)
Ｌｓ生菌数測定培地：変法LBS寒天培地
ＨｐをＨｐ生菌数測定培地で37℃、3〜4日間微好気培養したシャーレ2枚分の菌体をかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）1 mlに懸濁した。この菌懸濁液4 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、0.2〜10％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び0.2〜10％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で48時間微好気培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、Ｈｐは37℃で4日間微好気培養し、Ｌｓは37℃で2日間嫌気培養を行なった。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表4に示した。
【００２３】
【表４】
【００２４】
表4に示したように、Ｈｐの増殖に対し、ギムネマ抽出物、緑茶抽出物、ヨモギ抽出物、刺梨抽出物、ドクダミ抽出物、サンザシ抽出物は、Ｌｓと混合することにより、その増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００２５】
試験例５ 乳酸菌のサルモネラの増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌によるＳｅの増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。混合培養に用いた乳酸菌液は１%になるようにグルコースを添加したＧＡＭ培地を用いて２０時間培養し、これを乳酸菌液とした。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを1％となるように添加したGAM培地（ニッスイ）
培地Ｂ：Se接種時に乳酸菌液を1％接種した培地Ａ
Ｓｅ生菌数測定培地：DHL寒天培地（ニッスイ）
Ｌｓ生菌数測定培地：変法ＬＢＳ寒天培地
Ｓｅを培地Ａで一晩培養した前培養液2 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、1.25〜25％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び1.25〜25％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で8時間静置培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、Ｓｅは37℃で一晩好気培養し、Lsは37℃で2日間嫌気培養を行なった。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表5に示した。
【００２６】
【表５】
【００２７】
表5に示したように、Ｓｅの増殖に対し、ドクダミ抽出物、サンザシ抽出物がＬｓと混合することにより、その増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００２８】
試験例６ 乳酸菌の黄色ブドウ球菌の増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌による黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923、以下Ｓａと記載)の増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。混合培養に用いた乳酸菌液は１%になるようにグルコースを添加したGAM培地を用いて２０時間培養し、これを乳酸菌液とした。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを1％となるように添加したGAM培地（ニッスイ）
培地Ｂ：Sa接種時に乳酸菌液を1％接種した培地Ａ
Ｓa生菌数測定培地：スタフィロコッカスNo.110寒天培地（ニッスイ）
Ｌｓ生菌数測定培地：変法ＬＢＳ寒天培地
Ｓaを培地Ａで一晩培養した前培養液2 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、1〜10％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び1〜10％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で8時間静置培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、Ｓaは37℃で一晩好気培養し、Lsは37℃で2日間嫌気培養を行なった。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表5に示した。
【００２９】
【表６】
【００３０】
表6に示したように、Ｓａの増殖に対し、ヨモギ抽出物、刺梨抽出物、サンザシ抽出物がＬｓと混合することにより、その増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００３１】
試験例７ 乳酸菌の毒素原性大腸菌の増殖抑制効果を高める食品成分の探索
乳酸菌による毒素原性大腸菌(Enterotoxigenic Escherichia coli ＷＨ043、以下ETECと記載)の増殖抑制効果を増強する物質の探索を行った。混合培養に用いた乳酸菌液は１%になるようにグルコースを添加したＧＡＭ培地を用いて２０時間培養し、これを乳酸菌液とした。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを1％となるように添加したGAM培地（ニッスイ）
培地Ｂ：ETEC接種時に乳酸菌液を1％接種した培地Ａ
ETEC生菌数測定培地：DHL寒天培地（ニッスイ）
Ｌｓ生菌数測定培地：変法LBS寒天培地
ETECを培地Ａで一晩培養した前培養液2 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、1〜10％の各種食品成分を添加した培地Ａ及び1〜10％の各種食品成分を添加した培地Ｂ）に接種し、37℃で44時間静置培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、ETECは37℃で一晩好気培養し、Lsは37℃で2日間嫌気培養を行なった。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表7に示した。
【００３２】
【表７】
【００３３】
表7に示したように、ETECの増殖に対し、ギムネマ抽出物、ヨモギ抽出物、刺梨抽出物、ドクダミ抽出物、サンザシ抽出物がＬｓと混合することにより、その増殖抑制効果を１０倍以上高める著しい作用を示した。
【００３４】
試験例８ 乳酸菌とクランベリー抽出物の口腔内病原菌に対する増殖抑制効果の検討
クランベリー抽出物が、乳酸菌による口腔内病原菌（Streptococcus mutans JCM5705、以下Ｓｍと記載、Prevotella intermedia ATCC25611、以下Ｐｉと記載、Porphyromonas gingivalis ATCC33277、以下Ｐｇと記載、Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum JCM8532T、以下Ｆｎと記載、Actinobacillus actinomycetemcomitans JCM8577、以下Ａａと記載）の増殖抑制効果を増強する作用を示すか調べた。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：グルコースを1％となるように添加したGAM培地（ニッスイ）
培地Ｂ：Heminを0.5μg/mlとVitaminＫ3を1μg/mlになるように添加した培地Ａ
培地Ｃ：Brain Heart Infusion培地（ディフコ）
培地Ｄ：Ｌｓの培養ろ液を20％となるように添加した培地Ｂ
培地Ｅ：Ｌｓの培養ろ液を25％となるように添加した培地Ｃ
培地Ｆ：Ｌｓの培養ろ液を30％となるように添加した培地Ａ
培地Ｇ：Ｓｍ接種時に乳酸菌液を1％接種した培地Ａ
混合培養には、１%になるようにグルコースを添加したＧＡＭ培地を用いてＬｓを２０時間培養し、これを乳酸菌液とした。Ｌｓの培養ろ液は、試験例１に記載したのと同様の方法で調製したものを用いた。
Ｓｍ生菌数測定培地：10μg/mlバシトラシンと1％になるようにグルコースを添加したGAM寒天培地（日水製薬）
Ｐｉ生菌数測定培地：馬脱繊維血を5％となるように添加したＥＧ寒天培地(ニッスイ)
Ｐｇ生菌数測定培地：Heminを0.5μg/mlとVitaminＫ3を1μg/mlと馬脱繊維血を5％となるように添加したＥＧ寒天培地
Ａａ生菌数測定培地：Brain Heart Infusion寒天培地（ディフコ）
Ｆｎ生菌数測定培地：1％になるようにグルコースを添加したGAM寒天培地（ニッスイ）
Ｓｍ、Ｐｉを培地Ａ、Ｐｇを培地Ｂ、Ａａを培地Ｃで一晩、Ｆｎを培地Ａで3日間培養した前培養液2 μlを0.2 mlの各培地（Ｓｍは培地Ａ、培地Ｇ、5％のクランベリー抽出物を添加した培地Ａ、及び培地Ｇ。Ｐｉは培地Ａ、培地Ｆ、0.2％のクランベリー抽出物を添加した培地Ａ、培地Ｆ。Ｐｇは培地Ｂ、培地Ｄ、0.5％のクランベリー抽出物を添加した培地Ｂ、培地Ｄ。Ａａは培地Ｃ、培地Ｅ、0.25％のクランベリー抽出物を添加した培地Ｃ、培地Ｅ。Ｆｎは培地Ａ、培地Ｆ、1.0％のクランベリー抽出物を添加した培地Ａ、培地Ｆ）に接種し、37℃でＳｍは９時間（嫌気）、Ｐｇは24時間（嫌気）、Ｐｉは24時間（嫌気）、Ａａは9時間（微好気）、Ｆｎは24時間（嫌気）培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、37℃でＳｍ、Ｐｇ、Ｐｉ、Ｆｎは３〜4日間嫌気培養し、Ａａは3日間微好気培養を行った。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表8に示した。
【００３５】
【表８】
【００３６】
表8に示したように、クランベリー抽出物は、Ｌｓの口腔内病原菌（Ｓｍ、Ｐｉ、Ｐｇ、Ａａ、Ｆｎ）に対する増殖抑制効果を著しく高める作用を示した。
【００３７】
試験例９ 乳酸菌とクランベリー抽出物のヘリコバクター・ピロリに対する増殖抑制効果の検討（１）
乳酸菌としてＬｓの代わりにラクトバチルス・ガッセリを用いて、クランベリー抽出物がＨｐの増殖抑制効果を増強するかどうか検討を行なった。乳酸菌成分として、培養ろ液を用いた。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：馬血清を5％となるように添加したBrain Heart Infusion培地（ディフコ）
培地Ｂ：Lactobacillus gasseri WB2001（以下Ｌｇとする）の培養ろ液を25％となるように添加した培地Ａ
Ｌｇの培養ろ液は、グルコースを1％となるように添加したGAM培地（日水製薬）で37℃、24時間培養したＬｇの培養液を遠心分離（7200 rpm、20分）して上清を回収し、さらに無菌ろ過し5%馬血清を添加したもの。
Ｈｐ生菌数測定培地：馬脱繊維血を5％となるように添加したBrain Heart Infusion（BHI）寒天培地
ＨｐをＨｐ生菌数測定培地で37℃、3〜4日間微好気培養したシャーレ2枚分の菌体をかきとり、BHI 1mlに懸濁した。この菌懸濁液4 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、2％のクランベリー抽出物を添加した培地Ａ及び培地Ｂ）に接種し、37℃で24時間微好気培養を行った。培養液を適当に希釈し、Ｈｐ生菌数測定培地に塗布し、37℃で4日間微好気培養した。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。結果を表１に示した。
【００３８】
【表９】
【００３９】
表９に示したように、Ｌｇ乳酸菌の培養ろ液にクランベリー抽出物を２%添加することによりＨｐの増殖抑制効果は著しく高められた。
【００４０】
試験例１０ 乳酸菌とクランベリー抽出物によるヘリコバクター・ピロリの増殖抑制効果の検討（２）
乳酸菌とＨｐを混合培養し、クランベリーがＨｐ増殖抑制効果を増強するかどうか検討を行なった。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：馬血清を5％となるように添加したBrain Heart Infusion培地（ディフコ）
培地Ｂ：Ｈｐ接種時に24時間0.7%Glc添加GAM培地を用いて前培養した乳酸菌液を1％接種した培地Ａ
Ｈｐ生菌数測定培地：ヘリコバクター寒天培地(ニッスイ)
Ｌｓ、Ｌｇ生菌数測定培地：変法LBS寒天培地
Ｈｐを５%馬脱繊維血/BHI寒天培地で37℃、3〜4日間微好気培養したシャーレ2枚分の菌体をかきとり、BHI 1mlに懸濁した。この菌懸濁液4 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、クランベリ-を2%添加した培地Ａ及び培地Ｂ）に接種し、37℃で24時間微好気培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、Ｈｐは37℃で4日間微好気培養し、Ｌｓ、Ｌｇは37℃で2日間嫌気培養を行った。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。Ｈｐの生菌数を測定した結果を表10に示した。
【００４１】
【表１０】
【００４２】
表10に示したように、クランベリー抽出物を添加することにより、乳酸菌のＨｐに対する増殖抑制効果は著しく高まった。一方、Ｌｓ、Ｌｇの増殖はクランベリー抽出物の添加の影響を受けなかった。
【００４３】
試験例１１ Ｌｓとラズベリー抽出物，ブルーベリー抽出物によるヘリコバクター・ピロリの増殖抑制効果の検討
乳酸菌とＨｐを混合培養し、ラズベリー、ブルーベリーがＨｐ増殖抑制効果を増強するかどうか検討を行なった。用いた培地は以下の通りである。
培地Ａ：馬血清を5％となるように添加したBrain Heart Infusion培地（ディフコ）
培地Ｂ：Ｈｐ接種時に24時間0.7%Glc添加GAM培地を用いて前培養したＬｓを1％接種した培地Ａ
Ｈｐ生菌数測定培地：ヘリコバクター寒天培地(ニッスイ)
Ｌｓ生菌数測定培地：変法LBS寒天培地
Ｈｐを５%馬脱繊維血/BHI寒天培地で37℃、3〜4日間微好気培養したシャーレ2枚分の菌体をかきとり、BHI 1mlに懸濁した。この菌懸濁液4 μlを0.2 mlの各培地（培地Ａ、培地Ｂ、ラズベリーを5%添加した培地Ａ及び培地Ｂ、ブルーベリーを5%添加した培地Ａ及び培地Ｂ）に接種し、37℃で9時間微好気培養を行った。培養液を適当に希釈し、生菌数測定培地に塗布し、Ｈｐは37℃で4日間微好気培養し、Ｌｓは37℃で2日間嫌気培養を行った。生じたコロニー数を計測し、生菌数を求めた。Ｈｐの生菌数を測定した結果を表11に示した。
【００４４】
【表１１】
【００４５】
表11に示したように、ラズベリー抽出物またはブルーベリー抽出物を添加することにより、ＬｓのＨｐに対する増殖抑制効果が著しく高まった。一方、Ｌｓの増殖はラズベリー抽出物およびブルーベリー抽出物の添加の影響を受けなかった。
【００４６】
試験例１２ ヘリコバクター・ピロリ感染マウスに対する乳酸菌及びクランベリー抽出物の効果
[方法]
無菌マウス（BALB/c、4週齢）に5%ウマ血清を含むBrain Heart Infusion液体培地で増殖したヘリコバクター・ピロリNo.130（臨床分離株、以下Hp）を、マウス当たり5〜6×108cfuを3日間連続経口投与して感染させた。感染開始から4週間飼育後、Hp感染マウスを6群に分け（n = 5〜6）、以下の試験群を設定した。I. 対照群、II. 2%クランベリー投与群、III. 10%クランベリー投与群、IV. Ls与群、V. Ls＋2%クランベリー投与群およびVI. Ls＋10%クランベリー投与群。
クランベリーはクランベリー粉末（キッコーマン）を精製水にて2%および10%（w/v）に溶解後、フィルターにて滅菌した液をマウス当たり0.5ml、1日1回4週間連続経口投与した。Lsは、MRS 液体培地（ディフコ）にて37℃、一夜培養した培養液を、マウス当たり1×109cfu、週1回経口投与した。対照群には、滅菌水を投与した。
クランベリーおよび/あるいはLsを投与4週間後にマウスを屠殺し、胃を摘出した。胃を開き、内容物を取り除いた後、組織重量を測定し、9容のリン酸緩衝生理食塩液（以下PBS）を加え、ガラスホモジナイザーにて均一化後、PBSにて適宜希釈した。Hpの測定には、10 g/mlバシトラシン添加スキロー寒天培地を用い、微好気にて、37℃、5〜7日培養した。Lsの測定には、変法LBS寒天培地を用い、37℃、3日間嫌気培養した。
【００４７】
[結果]
マウス胃組織のHp感染菌数を表１２に示す。クランベリー投与群、Ls投与群ともに1/10程度減少が認められた。Lsとクランベリーの併用投与群では、感染菌数は1/100に低下した。本結果から、クランベリーが、Lsの抗Hp作用を10倍以上高めることが動物実験においても確認された。
【００４８】
【表１２】
【００４９】
実施例１ 乳酸菌の乾燥菌末の調製
Ｌｓ又はＬｇを、0.3％の炭酸カルシウムを含むブリックス・リバー液体培地（光岡知足：腸内菌の世界、叢文社、1980年）に接種後、37℃、12〜18時間静置培養を行った。培養終了後、7000 rpm、15分間遠心分離を行い、培養液の1/100量の濃縮菌体及び培養ろ液を得た。濃縮菌体にグルタミン酸ソーダ5％（重量）、可溶性澱粉5％（重量）、ショ糖5％（重量）および硫酸マグネシウム7水和物1％（重量）を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ7.0に修正後、−40℃以下で凍結してから凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥菌末を60メッシュのフルイで粉末化して乾燥菌末を調製した。
【００５０】
実施例２ 乳酸菌ギムネマ含有ガム（糖尿病が気になる人向け食品）の製造
Ｌｓ乳酸菌末倍散物（実施例１の乾燥菌末をバレイショデンプンで1ｇあたり100億個の生菌を含むように倍散した物）1ｇ、ギムネマ抽出物10ｇ、ガムベース35ｇ、キシリトール35ｇにマルチトール19ｇを用いて常法に従って、ガムを製造した。
【００５１】
実施例３ 乳酸菌甘草含有粉末食品（肝臓が気になる人向け食品）の製造
Ｌｓ乳酸菌末倍散物（実施例１の乾燥菌末をバレイショデンプンで1ｇあたり100億個の生菌を含むように倍散した物）50ｇ、甘草抽出物10ｇ、ビタミンＣ40ｇ、キシリトール100ｇ、フラクトオリゴ糖110ｇに、乳糖190ｇ、バレイショデンプン500ｇを加えて均一に混合し、粉末健康食品を製造した。
【００５２】
実施例４ 乳酸菌刺梨サンザシヨモギ含有粉末食品（健胃食品）の製造
Ｌｓ乳酸菌末倍散物50ｇ、刺梨抽出物40ｇ、サンザシ抽出物40ｇ、ヨモギ抽出物40ｇ、フラクトオリゴ糖110ｇに、乳糖220ｇ、バレイショデンプン500ｇを加えて均一に混合し、粉末食品を製造した。
【００５３】
実施例５ 乳酸菌ドクダミ緑茶含有粉末食品（便秘が気になる人向け食品）の製造
Ｌｓ乳酸菌末倍散物50ｇ、ドクダミ抽出物30ｇ、緑茶抽出物30ｇ、ビタミンＣ40ｇ、フラクトオリゴ糖110ｇに、乳糖240ｇ、バレイショデンプン500ｇを加えて均一に混合し、粉末食品を製造した。
【００５４】
実施例６ 乳酸菌紅麹含有粉末（コレステロールが気になる人向け食品）の製造
Ｌｓ乳酸菌末倍散物50ｇ、紅麹抽出物50ｇ、緑茶抽出物30ｇ、フラクトオリゴ糖110ｇに、乳糖260ｇ、バレイショデンプン500ｇを加えて均一に混合し、粉末食品を製造した。
【００５５】
実施例７ 乳酸菌紫玄米含有粉末食品（肌が気になる人向け食品）の製造
Ｌｓ乳酸菌末倍散物50ｇ、紫玄米抽出物30ｇ、ビタミンＣ40ｇ、グラニュー糖50ｇに、乳糖330ｇ、バレイショデンプン500ｇを加えて均一に混合し、粉末食品を製造した。
【００５６】
実施例８ 乳酸菌クランベリー抽出物含有粉末食品（健胃食品）の製造
Ｌｇ乳酸菌末倍散物50ｇ、クランベリー抽出物（キッコーマン社）30ｇ、ビタミンＣ40ｇ、グラニュー糖50ｇに、乳糖330ｇ、バレイショデンプン500ｇを加えて均一に混合し、粉末食品を製造した。
【００５７】
実施例９ 乳酸菌クランベリー抽出物含有錠菓（オーラルケア健胃食品）の製造
キシリトール（東和化成）500ｇ、エリスリトール（日研化学）345ｇ、粉末還元麦芽糖（東和化成）200ｇ、コメデンプン（島田化学）250ｇ、デキストリン（松谷化学）100ｇに90％エタノール400ｍｌを添加して練合し、続いて練合物を押し出し造粒機（菊水製作所製）を用いて0.8ｍｍのスクリーンで押し出し造粒を行った。通風乾燥した造粒物970ｇにクランベリー抽出物粉末10ｇ（キッコーマン）、Ｌｇ乳酸菌末倍散物10ｇ、ショ糖脂肪酸エステル10ｇ（三菱化学フーズ）を添加し、十分に混合した後、ロータリー打錠機（畑鉄工所製）を用いて、硬度10ｋｇ、直径12ｍｍ、重量0.5ｇの錠菓を製造した。
【００５８】
実施例１０ 乳酸菌クランベリー抽出物含有乳酸菌食品（健胃食品）の製造
Ls乳酸菌末倍散物６ｇ、サイリウム３００ｇ、クランベリーパウダー（キッコーマン社）１００ｇ、果糖１００ｇ、ブドウ糖６４ｇ、クエン酸２０ｇ、香料１０ｇを加えて均一に混合し粉末食品を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
乳酸菌の機能を高める働きを有し、かつ保健効果を有する食品成分が配合された、より有効な乳酸菌含有食品組成物として利用できる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００１００４９２
【氏名又は名称】わかもと製薬株式会社
【住所又は居所】東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号
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| 【出願日】 |
平成１５年９月２５日（２００３．９．２５） |
| 【代理人】 |
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| 【公開番号】 |
特開２００５−１３２１１（Ｐ２００５−１３２１１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１７年１月２０日（２００５．１．２０） |
| 【出願番号】 |
特願２００３−３３３５８９（Ｐ２００３−３３３５８９） |
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