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【発明の名称】 ＤＨＡ含有栄養組成物およびそれらの製造方法
【発明者】 【氏名】グラデュー，レイモンド・エム

【氏名】ベーレンス，ポール・ダブリュー
【要約】 【課題】充分なＤＨＡを稚魚に供給することができたならば、稚魚の生き残り率は、増加し、従って、養殖場で養殖した海産食物のコストは減少すると期待される。

【解決手段】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有微生物およびアラキドン酸（ＡＲＡ）含有微生物からの極性脂質抽出物を含むスラリーを乾燥させることによって調製した、ＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を持つリン脂質を含む粒子状物質が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有微生物およびアラキドン酸（ＡＲＡ）含有微生物からの極性脂質抽出物を含むスラリーを乾燥させることによって調製した、ＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を持つリン脂質を含む粒子状物質。
【請求項２】
平均粒子サイズが５ミクロンから１０ミクロンの間である、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項３】
スラリーを噴霧乾燥によって乾燥する、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項４】
前記ＤＨＡ含有微生物の脂質の中の少なくとも１０％の脂肪酸残基がＤＨＡ残基である、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項５】
前記ＤＨＡ含有微生物の極性脂質の中の少なくとも１０％の脂肪酸残基がＤＨＡ残基である、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項６】
前記ＡＲＡ含有微生物が真菌である、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項７】
前記ＡＲＡ含有微生物がＭｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ種である、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項８】
前記ＤＨＡ含有微生物が渦鞭毛虫類である、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項９】
前記微生物がＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉである、請求項１記載の粒子状物質。
【請求項１０】
ＤＨＡ含有およびＡＲＡ含有粒子状物質の調製方法であって、渦鞭毛虫類および真菌から抽出した極性脂質を含むスラリーを乾燥することを含み、乾燥された物質が５−１０ミクロンの平均粒子直径を持つ粒子の形である、調製方法。
【請求項１１】
ＤＨＡ含有およびＡＲＡ含有粒子状物質の調製方法であって、ＤＨＡを含む微生物細胞およびＡＲＡを含む微生物細胞を溶解し、溶解された細胞を溶媒で抽出し、抽出物から極性脂質フラクションを分離し、そしてその他の栄養を付加するか、または付加せずに、極性脂質フラクションを乾燥して、粒子状物質を形成させることを含む、調製方法。
【請求項１２】
極性脂質フラクションが噴霧乾燥によって乾燥される水性スラリーである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＤＨＡ含有微生物細胞が渦鞭毛虫類細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＤＨＡ含有微生物細胞がＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉの細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＲＡ含有微生物が真菌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＲＡ含有微生物がＭｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ種である、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有微生物およびアラキドン酸（ＡＲＡ）含有微生物からの極性脂質抽出物を水と共にホモジナイズすることによって調製される、ＤＨＡ残基およびＡＲＡを含む残基を持つリン脂質を含む水性乳濁液または懸濁液。
【請求項１８】
ＤＨＡ含有微生物の脂質の中の少なくとも１０％の脂肪酸残基がＤＨＡ残基である、請求項１７記載の乳濁液または懸濁液。
【請求項１９】
ＤＨＡ含有微生物の極性脂質の中の少なくとも１０％の脂肪酸残基がＤＨＡ残基である、請求項１７記載の乳濁液または懸濁液。
【請求項２０】
前記ＤＨＡ含有微生物が渦鞭毛虫類である、請求項１７記載の乳濁液または懸濁液。
【請求項２１】
前記微生物がＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉである、請求項１７記載の乳濁液または懸濁液。
【請求項２２】
前記ＡＲＡ含有微生物が真菌である、請求項１７記載の乳濁液または懸濁液。
【請求項２３】
前記ＡＲＡ含有微生物がＭｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ種である、請求項１７記載の乳濁液または懸濁液。
【請求項２４】
ＤＨＡ含有微生物およびＡＲＡ含有微生物からの極性脂質抽出物を含むスラリーを乾燥することによって調製されたＤＨＡおよびＡＲＡを持つリン脂質を含む粒子状物質、およびタンパク質、炭水化物またはその両方を含む粗粉、を含む組成物。
【請求項２５】
粗粉が微生物細胞または細胞フラグメントを含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
微生物細胞または細胞フラグメントがクロレラからである、請求項２４記載の組成物。
【請求項２７】
微生物細胞または細胞フラグメントがＣｔｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍである、請求項２４記載の組成物。
【請求項２８】
微生物細胞または細胞フラグメントが酵母である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２９】
微生物細胞または細胞フラグメントがＭｏｒｔｅｒｉｅｌｌａである、請求項２４記載の組成物。
【請求項３０】
水産養殖方法であって、
ＤＨＡ残基を伴うリン脂質およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む微生物からの極性脂質抽出物を含む粒子状物質を、アルテミア、ワムシまたはそれらの組み合わせを含む生きた幼生給餌生物に摂取させることにより、幼生生物中のＤＨＡおよびＡＲＡのレベルを富裕化し；そして
ＤＨＡ富裕化およびＡＲＡ富裕化幼生生物を、稚魚、二枚貝、甲殻類、又はそれらの組み合わせに摂取させること
を含む方法。
【請求項３１】
水産養殖方法であって、
ＤＨＡ残基を伴うリン脂質およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む微生物からの極性脂質抽出物を含む粒子状物質を、二枚貝および／または甲殻類に摂取させること
を含む方法。
【請求項３２】
ＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む粒子状物質が約５ミクロンから約１０ミクロンの平均粒子サイズを有する、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
ＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む粒子状物質が少なくとも３００：１の比のＤＨＡおよびＡＲＡを含む、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３４】
ＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む粒子状物質がビタミン、アミノ酸又は両方を含む、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３５】
ＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む粒子状物質がさらにＣｈｌｏｒｅｌｌａバイオマスを含む、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３６】
微小藻類からの脂質抽出物を精製することにおいて生成されたリン脂質含有副産物を噴霧乾燥させることによりＤＨＡ残基およびＡＲＡ残基を伴うリン脂質を含む粒子状物質を製造する、請求項３０または３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】【発明の開示】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
この十年間は、自然漁業資源の減少を目の当たりにし、今では世界的な環境危機のレベルに達した。世界の１７の主要な漁業の内の１３が、国連食糧農業機構（Ｆ．Ａ．Ｏ．）によって、危機的または衰退段階にあると分類されている。一億（メートル）トンの水産漁獲高記録および保存的母集団の増殖の両方を維持する最良のシナリオを取ったとしても、この１０年の終わりには人類史上始めて、世界的に海産食品の供給が不足するであろう。さらに、次の２０年間は、工業国から今日未開発のエマージング経済の海産食品の伝統的大量消費者に世界人口がシフトするため、一人当たりの世界の海産食品の消費は増加する、と予想される。海産食料の世界的要求を満たす唯一の方法は、２０００年までに、養殖により、不充分な天然漁業資源の漁獲高を元に戻すことである。
【０００２】
養殖工業の広がりは、いくつかの重大な問題の解決を必要とし、経済的に実行可能な養殖経営を確立し維持するための最も重大な障害の一つは、栄養的にバランスのとれた餌の供給の難しさである。野生で育った稚魚、二枚貝および甲殻類は、バランスのとれた栄養をまとめて供給する食料生物の混合母集団を消費する。一方、養殖場で飼育された稚魚、二枚貝および甲殻類では、それらの栄養として生きた餌（藻類または藻類を供給するわむし、およびアルテミア）を育て要求するのは難しい可能性がある。このような生きた餌を、生産維持するのは難しく、高い労働力の投入および専門設備を必要とし、結果として、稚魚の餌は、養殖工業の重大なコスト高の原因となる。
【０００３】
養殖の餌は、栄養的にバランスがとれ、その結果、稚魚が適当な栄養を摂取することが重要である。ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）は、明らかに稚魚の成長および生き残りに貢献する、重要な栄養素として単離された（Ｆｕｌｋｓ，Ｗ．およびＫＬＭａｉｎ編、１９９１、”Ｒｏｔｉｆｅｒａｎｄ Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ ＵＳ−Ａｓｉａ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ”，Ｈｏｎｏｌｕｌｕ，ＨＩ．ＴｈｅＯｃｅａｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｔａｍａｒｕ，ＣＳ，ＣＳＬｅｅ ａｎｄ Ｈ Ａｋｏ，１９９１、”Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅ ｌａｒｖａｌ ｒｅａｒｉｎｇｏｆ ｓｔｒｉｐｅｄ ｍｕｌｌｅｔ（Ｍｕｇｉｌｃｅｐｈａｌｕｓ）ｂｙ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙｏｆ ｔｈｅ ｒｏｔｉｆｅｒ，ＢｒａｃｈｉｏｎｕｓＰｌｉｃａｔｉｌｉｓ”、Ｗ．ＦｕｌｋｓおよびＫＬＭａｉｎ編、１９９１）。結果として、稚魚は、高レベルの不飽和ポリ脂肪酸を持つ藻類を直接摂取することによって、または不飽和ポリ脂肪酸に富む藻類で育てた、ワムシおよびアルテミアを摂取することによって、藻類からこれらの脂肪酸を獲得する。残念なことに、養殖場で用いられる藻類、アルテミアおよびワムシは、ＤＨＡが低く、低い稚魚の生き残り率をそれらの最大率より減少させ、最終的な養殖場の生産コストを増加させる。充分なＤＨＡを稚魚に供給することができたならば、稚魚の生き残り率は、増加し、従って、養殖場で養殖した海産食物のコストは減少すると期待される。
発明の要約
一つの実施態様では、本発明は、養殖用の餌としての使用に適した粒子状物質を提供する。粒子状物質は、脂質フラクション内に高い割合でＤＨＡ残基を持ち、その割合は、最大で物質の３５％であることができる。好ましくは、物質は、約５ミクロンから約１０ミクロンの平均粒子サイズを持つ。
【０００４】
もう一つの実施態様では、本発明は、微生物バイオマスからの、好ましくは高含有量のＤＨＡ残基を持つ藻類細胞からの、養殖用の餌としての使用に適した粒子状物質の調製方法であって、バイオマスから脂質フラクションを、好ましくは破砕細胞の溶媒抽出によって得、そしてリン脂質およびタンパク質を含むフラクションを脂質フラクションから分離し、そして、好ましくはタンパク質／リン脂質フラクションを噴霧乾燥させることによって、タンパク質／リン脂質フラクションから水を除去して低水分の粒子を形成させることによる、前記の粒子状物質の調製方法を提供する。
【０００５】
さらにもう一つの実施態様では、本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）残基を持つリン脂質を含む粒子状物質であって、前記粒子状物質は、ＤＨＡ含有微生物からの極性脂質抽出物を含むスラリーを乾燥させることによって調製され、そして乾燥した粒子状物質は、ＤＨＡ含有微生物からでない物質を実質上含まないスラリーから、特にスラリーを噴霧乾燥することによって、調製することができる、前記粒子状物質を提供する。典型的には、ＤＨＡ含有微生物の極性脂質抽出物中の乾燥物質の少なくとも２／３が微生物細胞からの誘導物質であり、好ましくは２５％より少ない乾燥物質が微生物由来ではなく、その割合は、より好ましくは２０％より少なく、さらにより好ましくは１５％またはそれより少ない。典型的には、噴霧乾燥した粒子は、５ミクロンから１０ミクロンの間の平均粒子サイズを持つ。
【０００６】
さらなるもう一つの実施態様では、本発明は、ＤＨＡ含有粒子状物質を調製するための方法であって、（ａ）ＤＨＡ含有微生物細胞を溶解し；（ｂ）溶解した細胞を溶媒で抽出し；（ｃ）抽出物から極性脂質フラクションを分離し；そして（ｄ）その他の栄養を付加するかまたは付加せずに、極性脂質フラクションを乾燥して、粒子状物質を形成する；ことを含む、前記のＤＨＡ含有粒子状物質の調製方法を提供する。
【０００７】
特別な実施態様では、本発明は、渦鞭毛虫類から抽出された極性脂質を含むスラリーを乾燥することを含む、ＤＨＡ含有粒子状物質を調製する方法であって、乾燥した物質が５−１０ミクロンの平均粒子直径を持つ粒子の型である、前記のＤＨＡ含有粒子状物質の調製方法を提供する。
【０００８】
さらなるもう一つの実施態様では、本発明は、ＤＨＡ含有微生物からの極性脂質抽出物から得られたＤＨＡ残基を持つリン脂質を含む水性乳濁液または縣濁液を提供する。好ましくは、ＤＨＡ含有微生物の脂質中の少なくとも１０％の脂肪酸残基が、ＤＨＡ残基である。より好ましくは、ＤＨＡ含有微生物の極性脂質の少なくとも１０％の脂肪酸残基がＤＨＡ残基である。
【０００９】
さらなるもう一つの実施態様では、本発明は、（ａ）ＤＨＡ含有微生物からの極性脂質抽出物、および（ｂ）タンパク質および／または炭水化物を含むミール、を含むスラリーを乾燥することによって調製されたＤＨＡを持つリン脂質を含む粒子状物質を含む組成物を提供する。好ましくは、ミールは、微生物細胞または細胞フラグメントを含み、それらは、細胞、または、抽出して脂質の一部分あるいは脂質の大部分を除去した細胞フラグメントであることができる。好ましい微生物細胞または細胞フラグメントは、クロレラ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｕｍ、またはサッカロミセスのような酵母、またはＭｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、あるいはＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍのような真菌である。
好ましい実施態様の詳細な説明
バイオマスからのＤＨＡ高含有油脂の製造は、いくつかの異なるプロセシングおよび精製段階を必要とする。それぞれの精製段階は、油脂精製の副産物としての廃棄フラクションを生成する。これらの副産物は、有意なレベルのＤＨＡ、および稚魚、二枚貝および甲殻類の養殖の餌として用いる可能性を持つことのできるその他の栄養を含む。
【００１０】
特に、一つの副産物は、稚魚の栄養として有用で価値のある、非常に高レベルのＤＨＡならびにその他の栄養（炭水化物、タンパク質等）を含む。この副産物は、以後「ＤＨＡリン脂質」と呼ばれ、また、稚魚に必須であると考えられるすべてのアミノ酸を有意のレベルで含む。大部分の魚の種に必須であることが一般的に認められている１０のアミノ酸は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンであり、例えば、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｊｏｎａｔｈａｎａｎｄ Ｎｉａｌ Ｂｒｏｍａｇｅ，ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＦｉｓｈ Ｆａｒｍｉｎｇ，第５章、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ、１９９２、１５４−１９７を参照のこと。ＤＨＡリン脂質物質は、いくつかのその他の養殖の餌に認められるレベルと比較しうるレベルで、これらのすべてのアミノ酸を含む。ＤＨＡリン脂質物質は、ＤＨＡ残基を高い割合で持つリン脂質、ならびに、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ステロール、糖脂質等のような、その他の脂質成分を含む。噴霧乾燥粒子として得られた、ＤＨＡリン脂質の生化学的組成を、表１に示す。粒子状物質の脂肪酸組成を、表２に示す。
ＤＨＡ含有物質の起源
生物圏内のＤＨＡの主要な起源は、藻類である。多数の藻類の種がＤＨＡを生成する。特に一つの種（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ）を巧みに操作すると、非常に高レベルのＤＨＡが生成される。この生物体を大規模で培養し、バイオマスを、ＤＨＡ高含有油脂の生成に用いた。Ｃ．ｃｏｈｎｉｉからのＤＨＡ含有バイオマスを生成する適当な方法は、合衆国特許第５，３９７，５９１号および第５，４９２，９３８号に提供されており、ここに参考として採用する。
【００１１】
類似のＤＨＡリン脂質物質を、有意な量のＤＨＡを含む、任意の単細胞生物体から生成することができる。これは、様々な油性真菌、様々な藻類（特にＤｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ、ＰｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｅｃｅａｅおよびＥｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅのクラスの藻類）、ならびに、ＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍまたはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍのような分類学的に不確かな状態の生物体を含むであろう。ＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍまたはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍからＤＨＡ含有バイオマスを製造する適当な方法は、合衆国特許第５，１３０，２４２号に提供されており、ここに参考として採用する。
【００１２】
典型的には、本発明のＤＨＡリン脂質の源として供給される微生物は、少なくとも５％の脂肪酸およびＤＨＡとしての微生物中の脂肪酸残基、より典型的には少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、を持つであろう。好ましくは、起源微生物の極性脂質内の少なくとも１０％の脂肪酸残基はＤＨＡであり、より好ましくは、少なくとも２０％の残基がＤＨＡであろう。
調製方法
ＤＨＡリン脂質は、ＤＨＡ含有バイオマスの脂質フラクションから得ることができる。適当な脂質フラクションを得るための好ましい方法は、溶解細胞の溶媒抽出物である。好ましい様式で、バイオマスを噴霧乾燥し、それにより大部分の細胞を溶解し、噴霧乾燥物質をヘキサンのような溶媒で抽出することができる。すりつぶしホモジナイズした溶媒−バイオマス混合物は、脂質フラクション（油脂）の抽出を容易にし、また、養殖の餌として望ましい非脂質成分の回収を促進することができる。ＤＨＡリン脂質物質を、水／塩含有沈殿物として油脂から分離する。そのような分離を行うための適当な方法は、野菜油の精製に類似した方法から容易に応用される。
【００１３】
ＤＨＡリン脂質副産物は、有用なレベルのＤＨＡおよびその他の栄養を含むが、この物質を稚魚に提供するための適当な方法を見つけださねばならない。多くの稚魚は生きた餌を要求し、また二枚貝および甲殻類も、生きた餌生物または限定されたサイズの範囲の粒子のいずれかを要求する。このように、さらなる処理をおこなうことが、稚魚、二枚貝または甲殻類に直接この物質をただ提供するために、好ましい。
【００１４】
生きた餌を要求するそのような生物体のためには、ＤＨＡリン脂質をアルテミアおよび／またはワムシ（両方とも稚魚の天然の食料生物）に摂取させ、アルテミア／ワムシのＤＨＡレベルを上昇させ、それに伴って稚魚のＤＨＡレベルを上昇させることをゴールとすることができる。フィルターフィーダーであるそのような生物体のために、物質を小さな粒子として供給し、餌に直接、豊富なＤＨＡを提供する。
【００１５】
アルテミア、ワムシ、およびフィルターフィーダーが摂取するために適当なサイズの粒子を調製するために、ＤＨＡリン脂質物質を、噴霧乾燥、顆粒化、カプセル化およびその類似法等の、任意の適当な方法によって乾燥する。ＤＨＡリン脂質物質を凍結乾燥した場合、得られた粒子は大きすぎて有用ではない。凍結乾燥物質内の脂肪含有量は高く、すりつぶしても粒子サイズを減少させることはできなかった。噴霧乾燥では、アルテミア、ワムシおよびフィルターフィーダーによる消費に適当なサイズの範囲内にある粒子からなる崩れやすい塊が得られた。平均粒子サイズは、直径約５−１０ミクロンと測定され、平均値の周りの粒子サイズの分布は、極めて広かった（少なくとも＞３０ミクロンから＜１ミクロンまで）。物質は、乾燥処理の間、熱をかけるが、ドライヤーの温度によるＤＨＡレベルの減少は、感知されるほどではなかった。このように、噴霧乾燥すると、高含有量のＤＨＡおよび適当な粒子サイズを持つ生成物が得られた。
【００１６】
好ましくは、噴霧乾燥物質のＤＨＡレベルは、最大であるべきであり、これにより、物質を、稚魚にとってより価値の高いＤＨＡ源とする。典型的には、ＤＨＡレベルは、ＤＨＡリン脂質物質内のＤＨＡ含有油脂の量を増加させることによって上がり、精製されたトリグリセリド油脂、部分精製されたトリグリセリドまたはＤＨＡ高含有の微生物からの脂質の粗抽出物を加えることによって、成し遂げることができる。本発明者は、（エステル化された脂肪酸レベルとして測定された）トリグリセリドレベルが、ＤＨＡリン脂質の全乾燥重量の約３０％を越えた場合、物質はうまく噴霧乾燥されず、この適用にはあまり適当でない非常に大きな粒子が形成されるらしいことに気付いた。トリグリセリド含有量約４０％では、最終的な噴霧乾燥生成物は、脂肪の含有量の高さにより非常に粘着性を持ち、見かけ上の粒子サイズの大きさを説明することができる。この物質は、より低いトリグリセリド物質と比べて取り扱いにくいが、それでもなお、アルテミアおよびワムシの豊富な生成物として用いることができる。もちろん、補充用ＤＨＡを、精製されたＤＨＡ−アルカノールエステルを含む、非微生物源から供給することもできるが、これらの原料は、経済的でない可能性が高い。
【００１７】
ＤＨＡリン脂質を、直接、噴霧乾燥することもできるが、スラリーが典型的噴霧乾燥剤を含むならば、それを噴霧乾燥器内に供給する場合、噴霧乾燥を容易にすることができる。適当な噴霧乾燥キャリヤーには、マルトデキストリン、デンプン、ゼラチン、糖および糖蜜が含まれる。適当なキャリヤーには、アルギン酸ナトリウムおよびアラビアゴムが含まれる。さらに、酵母抽出物、デンプン、ゼラチン、グルテン等のような添加物を含む、タンパク質、炭水化物、脂肪酸および脂質、またはビタミン源のように、栄養学的理由から最終粒子内に存在することが、望ましい様々な添加物を、乾燥前にスラリーに添加することができる。さらに、魚の栄養に特に重要なアミノ酸である、メチオニンのようなアミノ酸をスラリーに加えることもできる。代わりに、好ましくは、ワムシまたは稚魚の自然の餌である藻類を用い、藻類バイオマスを噴霧乾燥の補助としてスラリーに加えることもできる。
【００１８】
一つの実施態様では、微生物バイオマスを含むＤＨＡリン脂質を調合し噴霧乾燥することによって、粒子状物質を調製することができ、前記微生物バイオマスは、全細胞、溶解細胞または脂質抽出後の細胞内物質であることができる。ＤＨＡリン脂質は、１：１００−１００：１、好ましくは１：１０−１０：１の比率を含む、任意の比率でバイオマスと混合することができる。典型的には、混合物は、水性スラリーから噴霧乾燥され、コーンミールの出現または調和と共に物質を形成する。典型的には、バイオマスは、クロレラのような、栄養的用途が知られている微生物からのものであろう。クロレラは、ヒトの食料品として消費されており、ＤＨＡは重要なヒトの栄養であり、そのような粒子状物質は、ヒトの栄養にも有用である。もちろん、処理条件およびスラリーに含まれる任意のその他の添加物がヒトの消費に適当である限りにおいて、粒子がクロレラを含むか含まないかにかかわらず、発明に従って製造された粒子状物質は、ヒト栄養にＤＨＡを供給するために用いることができる。
【００１９】
ＤＨＡリン脂質は、特に噴霧乾燥に適しているが、本発明では、高レベルのＤＨＡを含む粒子状物質もまた、顆粒化またはカプセル化によって、調製することができる。熟練者は、ＤＨＡリン脂質の顆粒化またはカプセル化の条件を、容易に選択することができ、典型的には、アルギン酸塩またはアカシアゴムのような、噴霧乾燥での使用について上記した一つ以上の添加剤が用いられる。もちろん、また、ＤＨＡリン脂質をオイルシードミール（例えば、大豆ミール、綿実ミール、トウモロコシ胚種等）上に被覆することもできる。さらに、溶媒抽出された藻類バイオマス（「バイオミール」）を含むＤＨＡリン脂質の混合物は、また、凍結乾燥にも適当である。この発明は特にＤＨＡに富む乾燥製品の製造に適しているが、この発明に従って微生物から得られたＤＨＡリン脂質は、特に栄養添加物として、後に使用するために、縣濁液または乳濁液として調合することもできる。極性脂質を含むそのような乳濁液または縣濁液は、この技術分野で既知の方法に従って、日常的に調製することができる。
【００２０】
乾燥させた物質内での粒子サイズの分布は、例えば、サイクロンまたはフィルターバッグ内で分画することによって調整し、大きすぎる粒子を除去することができるが、平均粒子サイズが５−１０ミクロンの粒子状物質になるように、乾燥法を提供することが好ましいであろう。典型的には、乾燥したＤＨＡリン脂質を、稚魚、ワムシまたはアルテミアに食糧として供給する前に、海水と混合するであろう。この混合段階での攪拌を変えると、乾燥後に粒子サイズを調整することができるであろう。
【００２１】
水産業ならびにヒトおよび動物の栄養の両方に重要なその他の脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＡ）である。アラキドン酸は、また、微生物の脂質抽出物内でも得ることができるが、ＡＡの好ましい源は、好ましいＤＨＡ源とは異なる種である。適当な微生物のＡＡ源およびそれらを増殖させる方法は、例えば、合衆国特許第５，６５８，７６７号に教授されている。ＡＡ含有微生物からの粗脂質の抽出物は、脂肪酸および／または脂肪酸残基として少なからぬ量のＡＡを持つことのできる、タンパク質−および−炭水化物含有残基を残す。この物質は、ＡＡバイオミールと呼ばれる。
【００２２】
ＡＡ含有脂質粗抽出物の処理工程および精製の間に、ＡＡリン脂質を含むいくつかのフラクションが作り出される。また、ＡＡリン脂質を、ＤＨＡリン脂質と混合し、最適な栄養として提供されるであろう比率で両脂肪酸を含む物質を製造することもできる。そのような混合物を、乾燥物質として、または乳濁液あるいは懸濁液として、調製することができる。また、ＡＡリン脂質をＤＨＡバイオミールと混合して、乾燥するかまたは乳化して、アラキドン酸高含有物質を作ることもできる。異なる比率のＤＨＡリン脂質、ＤＨＡバイオミール、ＡＡバイオミール、および／またはＡＡリン脂質の使用を通して、最適な栄養として適当なＤＨＡおよびＡＡの比率を持つ物質を、作り出すこともできる。
実施例
本発明のより完全な理解を容易にするために、多数の実施例を以下に提供する、しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示された具体的実施態様により制限されるものではなく、これらの実施例は、説明の目的のためのみに提供される。
実施例１． ＤＨＡリン脂質の生成方法
Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｍｉｕｍｃｏｈｎｉｉを、合衆国特許第５，４０７，９５７号（ここに参照として採用する）に記載の方法に従って、従属栄養発酵により増殖させる。発酵終了時、ＤＨＡを多く含むバイオマスを、遠心分離により、固体約１８％（固体５−３５％の範囲）に濃縮した。濃縮したバイオマスを、噴霧乾燥するまで、冷蔵タンク（５０−６０゜Ｆ）に保つ。物質を、ポンプで高圧下、噴霧乾燥器を通し、その入り口温度は、３００−４００゜Ｆの範囲、典型的には３５０−３８０゜Ｆ、とする。噴霧乾燥器内の流速は、出口温度が１８０−２４０゜Ｆ、典型的には、２０５−２１５゜Ｆに達するために必要なように、調整する。噴霧乾燥器から回収した乾燥バイオマスは、１−１５％（典型的には６％）の範囲の水分含量を持つ。
【００２３】
乾燥したバイオマスを、ヘキサンで、ヘキサン約２リットル／ｋｇ（乾燥バイオマス）の比率で、スラリーにする。ヘキサン／バイオマス混合物を、コロイドミルにかけ、すべての細胞の破砕および油脂の最大抽出を確かなものにする。代わりに、バイオマス／ヘキサン混合物をホモジナイズ（例えば、おおよそ７−８００ａｔｍの圧力でオリフィスを通して加圧）することもできる。ヘキサンフラクション（ＤＨＡの豊富な油脂を含む）を、向流抽出器を用いて固体から分離する。抽出器から抽出したヘキサンは、約５％（ｖ：ｖ）の油脂含量を持つ。
【００２４】
油脂／ヘキサン混合物を遠心分離して、前に抽出器内で取り出されなかった任意の微細粒子を取り出す。ヘキサンを蒸発により部分除去すると、ヘキサン中約６５％油脂の混合物が生成された。この油脂／ヘキサン混合物を約４０゜Ｆに冷却し、この温度に約１２時間保った。低温状態下で沈殿した物質を遠心分離により除去する。油脂を含む残留ヘキサンを蒸発により除去し、ヘキサンを含まない油脂を生成させる。
【００２５】
油脂を精製タンクに移し、５０％アルカリ（油脂の０．７４％ｗ／ｗ）、８５％リン酸（油脂の０．２％ｗ／ｗ）、およびオレイン酸（油脂内の最終遊離脂肪酸レベルを５％にする）を、粗油に加える。混合物を攪拌し、おおよそ７０゜Ｆに１５−３０分加熱する。熱と化学薬品の組み合わせにより、ＤＨＡリン脂質を油脂から沈殿させる。ＤＨＡリン脂質を、遠心分離により収集する。
【００２６】
ＤＨＡリン脂質フラクションをホモジナイズして、均一混合物にする。この時点で、物質を「そのまま」噴霧乾燥するか、または、噴霧乾燥を行う前に様々な栄養素およびその他の化合物（例えば、ビタミン、タンパク質、アルギン酸塩、消泡剤等）と混合することができる。ＤＨＡリン脂質の固体含量は、１０％から最大で８０％を超える範囲であることができる。典型的には、固体含量を、おおよそ２５−３５％に希釈し、噴霧乾燥用ポンプを通過できるスラリーにするが、スラリー中の固体含量は、１０−５０％の範囲内であることができる。高圧注入ノズルまたは回転噴霧器のいずれかを用いて、物質を噴霧乾燥する。適当な入り口温度は、１７０−２４０゜Ｆ、典型的には２００゜Ｆ周辺、の範囲であり、物質は、噴霧乾燥器の出口温度を１５０−２００゜Ｆ、典型的には１８０−１９０゜Ｆに保持する十分な速度で、噴霧乾燥器に供給される。代わりの様式では、スラリーを入り口温度約３００゜Ｃ（５４０゜Ｆ）および出口温度約１１０゜Ｃ（２３０゜Ｆ）で、噴霧乾燥する。本発明では、本明細書中に提供されたガイドラインにかんがみて入り口温度および流速を調整することにより、乾燥条件を日常的に最適化することを、計画している。
【００２７】
噴霧乾燥器から収集されたＤＨＡリン脂質物質は、水分含量約４％であり、３つのそれぞれのバッチの生化学組成を表１に示し、これと同じ３バッチ＋４番目のバッチの脂肪酸組成を表２に示す。これらのバッチは、すべて噴霧乾燥に適している。もし、エステル化された脂肪酸レベルが約３０−３５％を越えたならば、物質はうまく噴霧乾燥されない。それは、別個の粒子を形成するというよりはむしろ、多分、物質内の油脂含量がより高いことにより、大きな塊を形成する傾向にある。
実施例２． ＤＨＡ含有粒子状混合物
ＤＨＡリン脂質は、その他の物質および栄養素と調合することができる。表３に、噴霧乾燥したＤＨＡリン脂質を、以下の方法に従って調製したＤＨＡリン脂質＋バイオミールおよびＤＨＡリン脂質＋クロレラの組成と比較する：ａ． ＤＨＡリン脂質を、溶媒抽出後、実施例１からの乾燥バイオマスからなるバイオミールと混合し、次に実施例１に記載の方法に従って、噴霧乾燥した。この混合の目的は、粘らないように、噴霧乾燥する物質の全脂肪酸含量を減少させることである。この混合物は確かに粘りが少ないので、たとえバイオミール中への混合が元のＤＨＡリン脂質と比較して全脂肪含量を減少させたとしても、この物質は元の物質を改良すると考えることができる。
【００２８】
ｂ． ＤＨＡリン脂質を、藻類クロレラと混合し、この混合物を、実施例１記載の方法に従って、噴霧乾燥した。クロレラは、ワムシの天然の食料源であり、タンパク質を多く含む。クロレラと混合することによって、噴霧乾燥した最終のＤＨＡリン脂質の粘りを減少させ、同時に天然の食料源からの栄養素を提供することができる。最初の試行では、３：１（ｗ：ｗ）ＤＨＡリン脂質：クロレラの混合であり、これは非常に扱いやすい物質を作り出した。広範囲の混合比率を用いることができる。一つの変法は、ＤＨＡリン脂質に対して高比率のクロレラを持つことである。これは、基本的に余分なＤＨＡを持つ天然の海洋食料源を提供し、その結果、物質は、それらを稚魚に与える前のワムシのＤＨＡ含量を増加させるための強化物としてではなく、正規の日常的食料としてあることができる。
【００２９】
ｃ． また、ＤＨＡリン脂質を、噴霧乾燥物質のタンパク質含量（その後の栄養物含量）を改善する目的で、タンパク質源と混合した。具体的には、ＤＨＡリン脂質を、比率３：１（ｗ：ｗ）のＤＨＡ−リン脂質：大豆タンパク質加水分解物で、大豆タンパク質加水分解物と混合した。このことは、ＤＨＡリン脂質をその他の栄養素と混合すると、粒子状にすることができることを、証明している。
実施例３． ＤＨＡおよびアラキドン酸物質の混合
ＤＨＡリン脂質を、アラキドン酸と調合して、単一の栄養生成物内にこれらの両脂肪酸を提供する物質を作り出すことができる。アラキドン酸含有バイオマスを、合衆国特許第５，６５８，７６７号に概説された方法に従って、Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａから製造する。Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａバイオマスを遠心分離により集菌し、真空下で乾燥させる。乾燥バイオマスをヘキサンで抽出し、アラキドン酸含有脂質をとりだし、そして粗脂質フラクションを、実施例１に用いた方法に類似した様式で、処理した。脂質抽出除去後に残ったマス（ＡＡバイオミールと呼ぶ）は、高レベルのタンパク質を含むが、また有意量のアラキドン酸も含む。このＡＡバイオミールを、ＤＨＡリン脂質と混合すると、有意量のアラキドン酸とＤＨＡの両方を含むより高いタンパク質物質を作り出すことができる。
【００３０】
理解を明確化にする目的で、前述の発明を、具体的実施態様と結びつけた説明および実施例に詳細に記載するが、その他の態様、利益および修飾は、本発明に関連する当業者らに、明らかであろう。前述の記載および実施例は、説明を意図しており、発明の範囲の制限を意図するものではない。食用油脂抽出物および処理工程、微生物発酵、栄養、医薬、薬理学、および／または関連分野の熟練者には明らかな、本発明を行うにあたっての上記の様式の修飾は、本発明の範囲内にあるつもりであり、添付クレイムによってのみ制限される。
【００３１】
この明細書中に取り上げたすべての文献および特許明細書は、本発明に関連する当業者の技術レベルで示している。各々の個々の文献または特許明細書を、具体的にそして個別的に、参照として採用することを示すように、すべての文献および特許明細書を、同じ範囲で、ここに参照として採用する。
【００３２】
【表１】


【００３３】
【表２】


【００３４】
【表３】


【００３５】
【表４】
【出願人】 【識別番号】５９８０８３７０６
【氏名又は名称】マーテック・バイオサイエンスィズ・コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】Ｍａｒｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】６４８０ Ｄｏｂｂｉｎ Ｒｏａｄ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２１０４５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願日】 平成１７年７月４日（２００５．７．４）
【代理人】 【識別番号】１０００８９７０５
【弁理士】
【氏名又は名称】社本 一夫

【識別番号】１０００７６６９１
【弁理士】
【氏名又は名称】増井 忠弐

【識別番号】１０００７５２７０
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 泰

【識別番号】１０００８０１３７
【弁理士】
【氏名又は名称】千葉 昭男

【識別番号】１０００９６０１３
【弁理士】
【氏名又は名称】富田 博行
【公開番号】 特開２００５−３３３９９２（Ｐ２００５−３３３９９２Ａ）
【公開日】 平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願番号】 特願２００５−１９４７７６（Ｐ２００５−１９４７７６）