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【発明の名称】 植物病害防除剤及びその製造方法並びに農薬及び肥料
【発明者】 【氏名】大野 裕和

【氏名】宮川 久義
【要約】 【課題】

【解決手段】甘草の中性乃至アルカリ性水抽出液を酸処理することにより生成した沈殿物のエタノール抽出液の活性炭脱色液より、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液からなることを特徴とする植物病害防除剤。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘草の中性乃至アルカリ性水抽出液を酸処理することにより生成した沈殿物のエタノール抽出液の活性炭脱色液より、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液からなることを特徴とする植物病害防除剤。
【請求項２】
植物病害が、イネのいもち病、苗腐病、紋枯病もしくはばか苗病、キュウリの炭疽病もしくは褐斑病、トマトの葉かび病、灰色かび病、輪紋病もしくは褐色輪紋病、ナスのすすかび病、スイカのつる枯病、ホウレンソウの萎凋病又はピーマンの斑点病であること特徴とする請求項１記載の植物病害防除剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の植物病害防除剤を含有してなる農薬。
【請求項４】
請求項１又は２記載の植物病害防除剤を含有してなる肥料。
【請求項５】
甘草を中性乃至アルカリ性下で水抽出し、この抽出液を酸処理することにより得られる沈殿物をエタノール抽出し、得られたエタノール抽出液に対し活性炭脱色処理を施した後、グリチルリチンを晶析させ、その晶析母液を採取することを特徴とする植物病害防除剤の製造方法。
【請求項６】
リクイリチゲニン及び／又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、甘草由来成分、リクイリチゲニン又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤及びその製造方法、並びに農薬及び肥料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
古くから甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）は生薬として知られ、現在では主に食品用甘味料や医薬品・医薬部外品等の原料として使用されている。特に、その水溶性成分であるグリチルリチンには、抗炎症作用、抗潰瘍作用及び抗アレルギー作用等の優れた薬理作用があることから、広く食品、医薬品及び化粧品等に利用されている。甘草及びその成分のグラム陽性菌に対する抗菌作用については既に知られている（非特許文献１〜３参照）。また、甘草抽出物を配合した土壌改良剤（特許文献１参照）及び甘草抽出物を含有する植物生長促進剤及び該植物生長促進剤を使用した肥料（特許文献２参照）が提案されている。
しかしながら、現状の甘草抽出物では、植物病原菌に対する抗菌性は充分でないため、より効果の高いものが望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−２４５９５９号公報
【特許文献２】特開２０００−３０９５０２号公報
【非特許文献１】築山良一、「食品と開発」、２００２年、３７巻、６号、ｐ５９−６１
【非特許文献２】Ｋｅｎｚｏ Ｏｋａｄａ 「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．」、１９８９年、Ｖｏｌ３７、Ｎｏ．９、ｐ２５２８−２５３０
【非特許文献３】Ｓａｃｈｉｏ Ｄｅｍｉｚｕ 「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．」、１９８８年、Ｖｏｌ３６、Ｎｏ．９、ｐ３４７４−３４７９
【非特許文献４】「第十四改正日本薬局方解説書」、廣川書店、平成１３年６月２７日
【非特許文献５】「食品添加物公定書解説書」、廣川書店、平成１１年６月９日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、広範囲にわたる植物病原菌に対する抗菌作用を有し、植物病害の防除ができる甘草由来成分、リクイリチゲニン又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤及びその製造方法、並びに植物病害防除剤を含有してなる農薬及び肥料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記目的を達成するため、農業において問題になっている数種の植物病原菌に対する抗菌作用について鋭意研究を重ねてきた。その結果、甘草を中性乃至アルカリ性下で水抽出し、この抽出液を酸処理することにより得られる沈殿物をエタノール抽出し、得られたエタノール抽出液に対し活性炭脱色処理を施した後、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液に抗菌作用を見出し、本発明をなすに至ったものである。
【０００６】
さらに、抗菌作用を有する成分が、リクイリチゲニン又はイソリクイチゲニンであることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【０００７】
従来、一般の甘草抽出物といわれているものは、熱水又は含水アルコール抽出によるものであり、グリチルリチン含量として５〜２５質量％程度、フラボノイド含量として１〜５質量％程度のものが多い（非特許文献４、５参照）。また、グリチルリチンの誘導体を製造するために使用されている方法は、アルカリ抽出を行い、晶析を行った結晶物を使用し、結晶物を取り除いた母液は廃棄されるのが通常であった。これに対し、これまで廃棄されていた母液が、植物病原菌に対して抗菌作用を有することは、本発明者による新知見である。
【０００８】
従って、本発明は
[１]．甘草の中性乃至アルカリ性水抽出液を酸処理することにより生成した沈殿物のエタノール抽出液の活性炭脱色液より、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液からなることを特徴とする植物病害防除剤、
[２]．植物病害が、イネのいもち病、苗腐病、紋枯病もしくはばか苗病、キュウリの炭疽病もしくは褐斑病、トマトの葉かび病、灰色かび病、輪紋病もしくは褐色輪紋病、ナスのすすかび病、スイカのつる枯病、ホウレンソウの萎凋病又はピーマンの斑点病であること特徴とする[１]記載の植物病害防除剤、
[３]．[１]又は[２]記載の植物病害防除剤を含有してなる農薬、
[４]．[１]又は[２]記載の植物病害防除剤を含有してなる肥料、
[５]．甘草を中性乃至アルカリ性下で水抽出し、この抽出液を酸処理することにより得られる沈殿物をエタノール抽出し、得られたエタノール抽出液に対し活性炭脱色処理を施した後、グリチルリチンを晶析させ、その晶析母液を採取することを特徴とする植物病害防除剤の製造方法、
[６]．リクイリチゲニン及び／又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、甘草由来成分、リクイリチゲニン又はイソリクイチゲニンを有効成分とする、安全性の高い植物病害防除剤及びその製造方法、並びに農薬及び肥料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明につき、さらに詳しく説明する。
本発明の第１の発明は、甘草の中性乃至アルカリ性水抽出液を酸処理することにより生成した沈殿物のエタノール抽出液の活性炭脱色液より、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液からなる植物病害防除剤である。
【００１１】
本発明の植物病害防除剤の原料となる甘草は、マメ科Ｇｌｙｃｙｒｒｉｈｉｚａ属に属する植物で、例えば、Ｇ．ｇｌａｂｒａ、Ｇ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓ、Ｇ．ｉｎｆｌａｔａ等が使用可能であるが、本発明においては、Ｇ．ｉｎｆｌａｔａを使用することが好ましい。また、使用部位は根、根茎、葉、茎のいずれの部位でも原料として使用することができるが、根及び／又は根茎を原料として使用することが好ましい。また、これらは、生のものを使用しても乾燥させたものを使用してもよいが、工業的に製造されているグリチルリチンの抽出原料となっている乾燥根及び乾燥根茎を原料として使用することができる。なお、甘草は生産地の名前を冠して呼ばれることが多く、例えば、東北甘草、西北甘草、新疆甘草、モンゴル産甘草、ロシア産甘草、アフガニスタン産甘草等を挙げることができる。
【００１２】
本発明の植物病害防除剤を得るための抽出条件としては、上記の甘草に対し中性乃至アルカリ性下で水抽出するが、通常、水抽出液のｐＨは７〜１１、特に９〜１０が好ましく、抽出温度は、冷水、温水又は熱水いずれでもよいが、５〜１００℃、特に５０〜１００℃が好ましい。ｐＨの調製には、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができる。抽出時間は抽出温度によって異なるが、通常１〜７２時間であり、特に２〜２４時間が好ましい。
【００１３】
次に、上記抽出液を酸処理することにより得られる沈殿物をエタノール抽出し、得られたエタノール抽出液に対し活性炭脱色処理を施した後、グリチルリチンを晶析させ、その結晶母液を得る。
【００１４】
酸処理は、硫酸、塩酸、硝酸等の酸性溶液にて、ｐＨ２〜４の酸性で析出処理を行い、グリチルリチン等を沈殿させる。濾過により沈殿物と濾液に分ける。得られた沈殿物１００質量部に対して２〜１０質量部、好ましくは１〜５質量部のエタノールを加え、エタノール抽出液を得る。この抽出液を撹拌して濾過する。得られた濾液に対して２〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％の活性炭を加え、還流抽出を行う。その後、セライト、珪藻土、パーライト等の濾過助剤を用いて濾過を行い、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ水を加えてｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０〜５．５に調整する。さらに、３〜１０℃、好ましくは５〜７℃で１〜５日間、好ましくは２日間静置することでグリチルリチンを晶析させた後、濾過して、晶析したグリチルリチンを除去する。
【００１５】
この場合、上記エタノール抽出液を乾燥して得られた抽出物中のグリチルリチン量は、固形あたり１０〜３０質量％である。上記晶析工程で、このグリチルリチンの２０〜５０質量％、特に３０〜４０質量％が晶析され、除去されるように晶析を行い、晶析工程後の晶析母液を乾燥して得られた抽出物中のグリチルリチン含有量は、固形あたり５〜２０質量％、特に８〜１５質量％であることが好ましい。
【００１６】
本発明の植物病害防除剤は上記晶析母液からなるものであるが、晶析母液をそのまま使用することもでき、さらに、常法により濃縮して使用することもできる。また、適当な方法で抽出液を乾燥させることにより、黄褐色の甘草抽出物の粉末又は固形物として用いることもできる。
【００１７】
本発明の植物病害防除剤のグリチルリチン含有量は、固形あたり５〜２０質量％、特に８〜１５質量％が好ましく、フラボノイド類（リクイリチン、イソリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン）の含有量は、固形あたり５〜２５質量％、特に１０〜２０質量％が好ましい。本発明の植物病害防除剤のフラボノイド類含量は従来の甘草抽出物と比較して２〜２０倍程度であり高含量である。本発明は、グリチルリチン含量としては、従来の甘草抽出物と比較して同程度であるが、高含量のフラボノイド類を含有しているため、抗菌活性が高いものである。なお、グリチルリチン含有量、フラボノイド類含有量は後述の実施例記載の測定法による。
【００１８】
本発明の植物病害防除剤は、植物病原菌に対する抗菌作用を有するものであり、特に、真核生物に属する植物病原菌（一般に糸状菌）に対する抗菌作用を有するものである。真核生物に属する病原菌には穀類、いも類、豆類、野菜、果樹、花き、特用作物、飼料作物等多数の農作物を侵し、今までに報告されている病害数（作物と病原菌の組み合わせ）は３，０００以上にのぼる。主要な病原菌としてはイネではいもち病菌（ピリキュラリア オリゼ：Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）、苗腐病菌（ピシウム グラミニコラ：Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、紋枯病菌（リゾクトニア ソラニ：Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、ばか苗病菌（ジベレラ フジクロイ：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ごま葉枯病菌（コクリオボラス ミヤベナス：Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）、苗立枯病菌（リゾープス オリゼ：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ムギ類の赤かび病菌（フザリウム グラミネアルム：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ダイズの紫斑病菌（サーコスポラ キクチイ：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）、野菜では各種野菜共通に発生する灰色かび病菌（ボトリチス シネレア：Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、うどんこ病菌（一例：スファエロテカ フリギニア：Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、菌核病菌（一例：スクレロチニア スクレロチオルム：Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、炭疽病菌（一例：コレトトリカム オルビキュラレ：Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、疫病菌（一例：ファイトフソラ メロニス：Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｌｏｎｉｓ）、各種立枯性病害を起こすフザリウム病菌（一例：フザリウム オキシスポラム：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、個別にはトマトの葉かび病菌（フルビア フルバ：Ｆｕｌｖｉａ ｆｕｌｖａ）、輪紋病菌（アルタナリア ソラニ：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）、褐色輪紋病菌（コリネスポラ カシコラ：Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、斑点病菌（ステムフィリウム リコペルシイシイ：Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ナスの褐紋病菌（ホーモプシス ベサンス：Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｖｅｘａｎｓ）、すすかび病菌（マイコベロシネラ ナトラシ：Ｍｙｃｏｖｅｌｌｏｓｉｅｌｌａ ｎａｔｔｒａｓｓｉｉ）、褐色円星病菌（パラサーコスポラ エゲヌラ：Ｐａｒａｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｅｇｅｎｕｌａ）、キュウリ（スイカ等を含む）のべと病菌（シュードペロノスポラ キュベンシス：Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、褐斑病菌（コリネスポラ カシコラ：Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、つる枯病菌（ディディメラ ブリオネ：Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ ｂｒｙｏｎｉａｅ）、ピーマンの斑点病菌（サーコスポラ カプシィシィ）、ホウレンソウの萎凋病菌（フザリウム オキシスポラム フォルマスペシーズ スピナシエ：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ）、果樹では、リンゴの斑点落葉病菌（アルタナリア マリ：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｍａｌｉ）、黒星病菌（ベンチュリア イネクアリス：Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、ナシの黒斑病菌（アルタナリア キクチアナ：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｋｉｋｕｃｈｉａｎａ）、赤星病菌（ギムノスポランギウム アシアチウム：Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ａｓｉａｔｉｕｍ）、カンキツの黒点病菌（ディアポルテ シトリ：Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｃｉｔｒｉ）、青カビ病菌（ペニシリウム イタリカム：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｉｔａｒｉｃｕｍ）、ブドウの晩腐病菌（グロメレラ シンギュラータ：Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、べと病菌（プラズモパラ ビチコラ：Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）等が挙げられる。この中でも、イネのいもち病菌、苗腐病菌、紋枯病菌もしくはばか苗病菌、キュウリの炭疽病菌もしくは褐斑病菌、トマトの葉かび病菌、灰色かび病菌、輪紋病菌もしくは褐色輪紋病菌、ナスのすすかび病菌、スイカのつる枯病菌、ホウレンソウのの萎凋病菌又はピーマンの斑点病菌に対して、本発明の植物防除剤は特に有効である。
【００１９】
本発明の第２の発明は、リクイリチゲニン及び／又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤である。リクイリチゲニン及びイソリクイチゲニンの取得方法は、特に制限されない。リクイリチゲニン及びイソリクイチゲニンは、精製された市販のものを用いてもよいし、カンゾウ、ラッキョウ、アルファルファ等の植物から抽出してもよい。抽出方法としては、特に限定されず、水又はエタノール等の有機溶媒等で、抽出温度及び時間を適宜調整して抽出することができる。精製は、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離等で行うことができる。なお、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンは、甘草の中性乃至アルカリ性水抽出液を酸処理することにより生成した沈殿物のエタノール抽出液の活性炭脱色液より、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して得られるものでもよい。
【００２０】
リクイリチゲニン及び／又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤において、植物病害、病原菌は上記と同様のものを挙げることができる。
【００２１】
本発明の植物病害防除剤は、そのまま又は任意の農薬成分や肥料成分と混合し農薬や肥料として用いることができる。その他の成分としては、界面活性剤、乳化剤、増量剤、保湿剤等が挙げられる。剤型は特に限定されないが、液剤、水溶剤、粉剤、粒剤、水和剤、乳剤、フロアブル剤、マイクロカプセル剤等にすることができる。使用方法としては、これらをそのまま、又は水で希釈し散布する方法が挙げられる。
【００２２】
本発明の植物病害防除剤は、チッソ、リン酸、カリウムの３要素を含む複合肥料と混合して製剤化し、これを圃場に散布することにより、病害防除と施肥を同時に行うことができる。また、葉面散布肥料（液状又は粉末状の複合肥料）等を用いて混合製剤に加工し、これらを水に溶解して作物の葉面に直接散布することにより病害防除と施肥を同時に行うことができる。さらに、マンガン、ホウ素、鉄、銅、亜鉛、モリブデン、塩素、ニッケル等の必要とされる微量要素を含む微量要素肥料と混合して製剤化し、それを散布することにより、病害防除と微量要素欠乏症を同時に解決することができる。このほか、各種有機質肥料と混合して使用することもできる。
【００２３】
農薬や肥料として用いる場合、甘草の中性乃至アルカリ性水抽出液を酸処理することにより生成した沈殿物のエタノール抽出液の活性炭脱色液より、グリチルリチンを晶析させた後の晶析母液からなる植物病害防除剤の場合の配合量は、農薬全量中０．１〜９０質量％が好ましく、より好ましくは１〜５０質量％であり、肥料全量中０．１〜９０質量％が好ましく、より好ましくは１〜５０質量％である。リクイリチゲニン及び／又はイソリクイチゲニンを有効成分とする植物病害防除剤の場合の配合量は、農薬全量中０．１〜９０質量％が好ましく、より好ましくは１〜５０質量％であり、肥料全量中０．１〜９０質量％が好ましく、より好ましくは１〜５０質量％である。
【００２４】
本発明の植物病害防除剤は、化学合成農薬による薬剤耐性菌の出現や副作用の問題がなく、安心して使用することができる。さらに、薬剤の残留による人体や環境に対する影響がないため、野菜、樹木、花等の植物に対する病害防除に大きく貢献できる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、下記の例において特に明記のない場合は「％」は質量％である。
【００２６】
［実施例１］
甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ）の根茎を粉砕し、チップ状にした。この甘草チップ１．０ｋｇを１０Ｌの３％アンモニア水（ｐＨ１０）で一晩抽出した後、固液分離した。得られた抽出液に対し、１％硫酸溶液により酸性析出処理を行い、グリチルリチン等を沈殿させ、濾過により沈殿物及び抽出濾液に分けた。この内、沈殿物にエタノール１Ｌを加え、常温で１時間撹拌し、セライトを用いて濾過を行った。得られた濾液に活性炭６０ｇを加え、常温で１時間、還流抽出を行った。その後、セライトを用いた濾過を行った。得られた濾液にアンモニア水を加えてｐＨ５．０〜５．５に調整した。濾液を５℃で２日間、静置することでグリチルリチンを晶析させた後、遠心分離して結晶と濾液に分けた。得られた濾液を減圧濃縮し、炭酸ナトリウムを用いてｐＨ７．０程度に中和し、さらに減圧濃縮、噴霧乾燥し、１５０ｇの黄褐色抽出物粉末である甘草抽出物を得た。この甘草抽出物についてＨＰＬＣ分析を行った結果、グリチルリチン含量は１１％であり、フラボノイド類（リクイリチン、イソリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン）含量は１５％であった。フラボノイド類含量１５％のうち、リクイリチゲニン含量は５％、イソリクイチゲニン含量は３％であった。
【００２７】
［比較例１］
甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ）の根茎を粉砕し、チップ状にした。この甘草チップ１．０ｋｇを１０Ｌの水で一晩抽出した後、固液分離し減圧濃縮後、噴霧乾燥させることで２５０ｇの褐色抽出物粉末である甘草抽出物を得た。この甘草抽出物についてＨＰＬＣ分析を行った結果、グリチルリチン含量は１０％であり、フラボノイド類（リクイリチン、イソリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン）含量は１．５％であった。フラボノイド類含量１．５％のうち、リクイリチゲニン含量は０．１％、イソリクイチゲニン含量は０．０５％であった。
【００２８】
得られた甘草抽出物について、下記の植物病原菌に対する抗菌作用評価、接種試験を行った。結果を表２〜５に併記する。
【００２９】
下記に、グリチルリチン含量、リクイリチゲニン含量、リクイリチン含量、イソリクイチゲニン及びイソリクイリチン含量のＨＰＬＣ分析条件を示す。
（１）グリチルリチン
<ＨＰＬＣ条件>
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ ＨＧ
溶媒 ：酢酸：アセトニトリル（体積比）＝６０：４０
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：２５４ｎｍ
温度 ：４０℃
注入量：２０μＬ
（２）リクイリチゲニン、リクイリチン
<ＨＰＬＣ条件>
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ ＨＧ
溶媒 ：アセトニトリル：水：酢酸（体積比）＝２０：７５：５
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：２８０ｎｍ
温度 ：４５℃
注入量：２０μＬ
（３）イソリクイリチゲニン
<ＨＰＬＣ条件>
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ ＨＧ
溶媒 ：アセトニトリル：水：酢酸（体積比）＝４０：５５：５
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：３５０ｎｍ
温度 ：４５℃
注入量：２０μＬ
（４）イソリクイリチン
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ ＨＧ
溶媒 ：アセトニトリル：水：酢酸（体積比）＝２０：７５：５
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ：３５０ｎｍ
温度 ：４５℃
注入量：２０μＬ
【００３０】
（１）抗菌作用評価
植物病原菌に対する培地上での菌糸伸長抑制率を測定することで評価を行った。
<検定培地の調製>
５０体積％エタノールに溶解した甘草抽出物１０％溶液を用いて、甘草抽出物として１００、１０００μｇ／ｍＬの各濃度に調製したＰＤＡ培地（ニッスイ製）を調製した。シャーレに調製した培地２０ｍＬを分注し、甘草抽出物添加区の培地とした。対照区の培地は、甘草抽出物を無添加にした。
<ディスクの調製>
植物病原菌を、別に用意したＰＤＡ平板培地（培地量１０ｍＬ）を用い、２５℃で数日間前培養し、菌糸先端部分を直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、ディスクとした。
<培養>
ディスクを菌糸の面を下にして検定培地中央に置き、２５℃で培養した。
<菌糸伸長量の測定>
対照区において、菌糸がシャーレの７割程度に伸長した時期に測定した。十字の線が引かれたディスク中央を基準とし、各植物病原菌の菌糸直径を測定した。１濃度につきシャーレ２〜４枚を用いて、菌糸直径を１シャーレにつき２ヶ所測定し、これらを平均して平均直径を算出した。測定結果から下記式（１）に基づいて菌糸伸長量を算出した。
菌糸伸長量＝[菌糸平均直径（ｍｍ）−ディスクの直径（５ｍｍ）]／２ （１）
<菌糸伸長抑制率>
下記式（２）により、菌糸伸長抑制率を算出した。なお、菌糸伸長抑制率がマイナスである場合は、添加区の菌糸が伸長したことを示している。
【数１】


【００３１】
植物病原菌株としては、イネのいもち病、苗腐病、紋枯病及びばか苗病、キュウリの炭疽病及び褐斑病、トマトの葉かび病、灰色かび病及び輪紋病、ナスのすすかび病、スイカのつる枯病、並びにホウレンソウの萎凋病の病原菌を用いた。
【００３２】
【表１】


【００３３】
（２）接種試験
発生する病斑数を測定することで評価を行った。
<対象植物>
イネ（品種：日本晴）、キュウリ（品種：つや太郎）、トマト（品種：強力米寿２号）を用いた。
イネは１／５０００アールワグネルポット、キュウリ及びトマトは素焼き鉢（５寸）に移植して１〜２ヶ月栽培し、草丈が５０ｃｍ程度に伸長した時期に試験に用いた。
<植物病原菌胞子液の調製>
植物病原菌株は、イネではいもち病、キュウリでは褐斑病及び炭疽病、トマトでは褐色輪紋病、ピーマンでは斑点病の原害菌株を用いた。
イネいもち病菌はオートミール栽培、キュウリ及びトマトの病原菌はＰＤＡ培地に移植し２５℃で培養した。いもち病菌についてのみ培地上の気中菌糸を絵筆で除去し、さらに培地を乾燥させる等の胞子形成促進処理を行った。１〜２週間後、培地表面に形成された病原菌胞子について絵筆を用いて蒸留水中に浮遊させ、４重ガーゼで濾過して胞子懸濁液を作製した。
この胞子懸濁液を１滴（約２０μＬ）スライドグラスに滴下し、顕微鏡下で検鏡して概ね１０４個／ｍＬの胞子濃度になるように蒸留水で調製し、植物病原菌胞子液を得た。
<試験方法>
甘草抽出物（２％）の水溶液と植物病原菌胞子液とを等量混合し、甘草抽出物として１％になるように懸濁液を調製した。この懸濁液を小型ガラス製噴霧器とコンプレッサーを用いて、植物１株当たり２０〜６０ｍＬ（葉から散布液が滴り落ちる程度）散布した。１処理につき、３鉢供試した。直ちに恒温接種箱に搬入し、２５℃、湿度１００％で２日間保湿した。その後、ガラス室に移し、約１週間後の病斑数を目視で測定した。対照区は甘草抽出物水溶液の代わりに、同量の蒸留水と植物病原菌胞子液とを等量混合した懸濁液を用いた。
【００３４】
<指数の算出>
各菌株の病斑数から平均病斑数を算出した。甘草抽出物を含む懸濁液を散布した区分（甘草抽出物添加区）の平均病斑数における、植物病原菌のみ添加した区分（対照区）の平均病斑数を１００としたときの相対値を、指数として下記式（３）により算出した。
【数２】


【００３５】
【表２】


【００３６】
【表３】


【００３７】
【表４】


【００３８】
【表５】


【００３９】
【表６】


【００４０】
表１より、実施例１の甘草抽出物における菌糸伸長抑制率は、比較例１の甘草抽出物における菌糸伸長抑制率と比較して有意に高い。また、表２〜６より、実施例１の甘草抽出物における病斑数は、比較例１の甘草抽出物における病斑数と比較して有意に少ない。
これらの結果より、実施例１の甘草抽出物においては、比較例１の甘草抽出物と比較して、有意に強い抗菌作用を有しており、有意に強い植物病害防除作用が確認された。
【００４１】
［試験例１］
上記の抗菌作用評価と同様の方法で、フラボノイド類であるリクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンそれぞれについて、トマトの褐色輪紋病の病原菌に対する培地上での菌糸伸長抑制率を測定し、抗菌作用の評価を行った。なお、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンについては、実施例１の甘草抽出物よりシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製したもの（純度９５％）を用いた。
【００４２】
【表７】


【００４３】
表７より、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンにおける菌糸伸長抑制率は共に高く、リクイリチゲニンでは実施例１の甘草抽出物と同等であり、イソリクイリチゲニンでは実施例１の甘草抽出物と比較して１．７倍であった。比較例１の甘草抽出物と比較して実施例１の甘草抽出物では、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンが有意に高含量である。これらのことより、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンは、植物病害防除を示す有効成分であることが確認された。
【００４４】
［処方例１］
下記組成の農薬を常法に基づいて調製した。
実施例１の甘草抽出物 １０部
キラヤ抽出物 ５部
エタノール １０部
水 ７５部
計 １００部
【００４５】
［処方例２］
下記組成の肥料を常法に基づいて調製した。
実施例１の甘草抽出物 １部
海藻粉末 ５部
貝殻粉末 １０部
腐葉土 ８４部
計 １００部

【出願人】 【識別番号】５９１０８２４２１
【氏名又は名称】丸善製薬株式会社
【識別番号】５０１２０３３４４
【氏名又は名称】独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
【出願日】 平成１６年４月２８日（２００４．４．２８）
【代理人】 【識別番号】１０００７９３０４
【弁理士】
【氏名又は名称】小島 隆司

【識別番号】１００１１４５１３
【弁理士】
【氏名又は名称】重松 沙織

【識別番号】１００１２０７２１
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 克成

【識別番号】１００１２４５９０
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 武史
【公開番号】 特開２００５−３１４２８５（Ｐ２００５−３１４２８５Ａ）
【公開日】 平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願番号】 特願２００４−１３３６４６（Ｐ２００４−１３３６４６）