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【発明の名称】 花の形態が改変された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用
【発明者】 【氏名】高木 優

【氏名】小山 知嗣
【要約】 【課題】花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。

【解決手段】ＴＣＰドメインを有する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質が転写因子が標的とする遺伝子の発現を抑制し、花の形態が改変された植物体が生産される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列からなるドメインを含む転写因子の標的となる遺伝子の転写を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法。
（ｉ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列の第６３位から第１２１位までのアミノ酸配列。
（ｉｉ）上記（ｉ）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、植物体の花の形態を改変させることを特徴とする請求項１に記載の植物体の生産方法。
【請求項３】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１又は２に記載の植物体の生産方法。
【請求項４】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項３に記載の植物体の生産方法。
【請求項５】
上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、上記ドメインを有するタンパク質。
【請求項６】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項３または４に記載の植物体の生産方法。
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、上記ドメインを有する転写因子をコードする遺伝子。
【請求項７】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ｅ）配列番号１８又は１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｆ）配列番号１８又は１９に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、又は４０に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１３】
上記機能性ペプチドが、配列番号３６又は３７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、花の形態が改変された植物体。
【請求項１５】
植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１４に記載の植物体。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
上記ドメインを有する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の花の形態改変キット。
【請求項１７】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１６に記載の植物体の花の形態改変キット。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、花の形態が改変された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものであり、特に遺伝子の転写を抑制することによる花の形態が改変された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、トウモロコシのＴＥＯＳＩＮＴＥ ＢＲＡＮＣＨＥＤ１（ＴＢ１）遺伝子や、キンギョソウのＣＩＮＣＩＮＮＡＴＡ（ＣＩＮ）遺伝子を欠損する突然変異体は、枝分かれや葉の形状に異常を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照。）。すなわち、ＴＢ１遺伝子を欠損するトウモロコシの突然変異体は、野生型にみられる頂芽優性がみられず、側芽が抑制されることなく成長する。また、ＣＩＮ遺伝子を欠損するキンギョソウの突然変異体は、葉の縁部分における成長が過剰となり、葉が波状となる。
【０００３】
上記非特許文献１、２では、トランスポゾンタギングを用いた解析により、ＴＢ１遺伝子及びＣＩＮ遺伝子は、共に、ＴＣＰファミリータンパク質が共通して有する相同なドメインをコードする塩基配列を有していることが報告されている。このＴＣＰファミリータンパク質が共通して有するドメインであるＴＣＰドメインは、トウモロコシのＴＢ１遺伝子、キンギョソウのＣＹＣＬＯＩＤＥＡ（ＣＹＣ）遺伝子、イネのＰＣＦ１、ＰＣＦ２遺伝子が共通してコードする領域として同定されている。また、このＴＣＰファミリータンパク質は、ＰＣＦ１、ＰＣＦ２タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質として機能していることから、転写因子ファミリーであることが示唆されている。
【０００４】
さらに、ＴＢ１遺伝子及びＣＹＣ遺伝子はそれぞれ腋芽および花芽の分裂組織の成長制御に関与し、ＣＩＮ遺伝子は葉における部位特異的な細胞分裂の制御に関与すると推定され、ＰＣＦ１、ＰＣＦ２遺伝子は細胞分裂に必要な遺伝子のプロモーター領域に結合し、その転写を制御する転写因子であることから、ＴＣＰファミリータンパク質のうち、これらは細胞分裂制御に関与していると推定されている。しかし、植物界に存在する他のＴＣＰファミリーの個々のタンパク質の機能についてはよくわかっていない。
【０００５】
ところで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献３、４参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【０００６】
さらに、本発明者は、種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することを試みている。そして、これにより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することに成功している。
【０００７】
なお、花の発生は、花序分裂組織から花原基として分化するところから始まり、花原基に含まれる花芽分裂組織から、がく片、花びら、雄しべ、雌しべの４種類の花器官が分化する。その後、分化した花器官を含む複合器官として成熟した花が形成される。花の形態が改変された植物は、新規な園芸植物の創出や、新規な形態を持つ果実の創出に利用できる等、農業上の有用性が高い。これまで、植物の花の形態の改変は、一般に植物の品種を掛け合わせる交配育種により行われている。しかし、従来の交配育種では、目的とする形態を有する植物を生産するためには、長い年月と、熟練者の経験が必要であるため、簡易かつ確実に花の形態を改変する方法が求められている。これまでに、遺伝子工学的に花の形態を改変する方法としては、花びらの形成を制御する遺伝子の一つであるシロイヌナズナのAPETALA３（ＡＰ３）遺伝子の発現をＡＰ３遺伝子のプロモーター領域に結合するリプレッサーを用いて抑制し、ＡＰ３遺伝子の変異体と同様な表現型を得る方法が知られている（非特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】Doebley,J., Stec,A., Hubbard,L., Nature,386,485-488(1997)
【非特許文献２】Nath,U., Crauford,B.C.W., Carpenter,R., Coen,C., Science,299,1404-1407(2003)
【非特許文献３】Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M.,The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001
【非特許文献４】Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters, 514, 351-354 (2002)
【非特許文献５】Guan,X., Stege J., Kim M., Dahmani Z., Fan N., Heifetz P., Barbas CF 3rd., Briggs SP., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13296-13301(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来、転写因子を転写抑制因子に変換することにより花の形態を改変する技術は知られていなかった。一方、上述のように、ＴＣＰファミリータンパク質には細胞分裂制御に関与すると推定されているものもあるが、そのほとんどは機能未知である。そこで、ＴＣＰファミリータンパク質の中から、花の正常な形態形成に必要な転写因子を見出し、当該転写因子を転写抑制因子に転換したキメラタンパク質を組換え植物内で過剰発現させることにより、花の正常な形態形成に関与する標的遺伝子の転写を抑制できれば、花の形態を効率的に改変することができると考えられる。
【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、花の形態形成に関与する遺伝子の転写を抑制することによって、簡易かつ確実に、花の形態が改変された植物体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＴＣＰドメインを有するＴＣＰファミリータンパク質であって、その機能が明らかにされていない転写因子を転写抑制因子に転換することによって、花の形態が改変された植物体を生産することができることを初めて明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明にかかる花の形態が改変された植物体の生産方法は、上記課題を解決すべく、以下の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列からなるドメインを含む転写因子の標的となる遺伝子の転写を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させることを特徴としている。（ｉ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列の第６３位から第１２１位までのアミノ酸配列。（ｉｉ）上記（ｉ）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【００１２】
これにより得られる植物体では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制され、花の形態が改変された植物体を生産することができる。
【００１３】
本発明にかかる花の形態が改変された植物体の生産方法は、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、植物体の花の形態を改変させるものであることが好ましい。
【００１４】
これにより、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の標的遺伝子の転写を効果的に抑制することができる。それゆえ、花の形態が改変されるという効果を奏する。
【００１５】
上記生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいてもよい。また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００１６】
これにより、上記キメラタンパク質を形質転換された上記植物細胞内で発現させることができる。それゆえ、該キメラタンパク質が標的遺伝子の転写を抑制し、花の形態が改変されるという効果を奏する。
【００１７】
上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、上記ＴＣＰドメインを有するタンパク質。
【００１８】
これにより、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制され、花の形態が改変されるという効果を奏する。
【００１９】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、上記ＴＣＰドメインを有する転写因子をコードする遺伝子。
【００２０】
上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００２１】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００２２】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであってもよい。（ｅ）配列番号１８又は１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｆ）配列番号１８又は１９に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【００２３】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２４】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２５】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、又は４０に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００２６】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３６又は３７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００２７】
上記機能性ペプチドが、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド又は上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００２８】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、花の形態が改変されていることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００２９】
また、本発明にかかる植物体の花の形態改変キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記ドメインを有する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記花の形態改変キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係る植物体の生産方法は、以上のように、（ｉ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列の第６３位から第１２１位までのアミノ酸配列または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるドメインを含む転写因子の標的となる遺伝子の転写を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させる構成を備えているので、上記転写因子が標的とする標的遺伝子の転写が抑制され、簡便に花の形態を改変することができるという効果を奏する。より具体的には、花びらや雌しべ等に形態変化を持つ花卉植物を作製することができるため、新規な園芸品種を創出することができるという効果を有する。また、果樹においては果実の形態を変化させることができるため、新規な形態を持つ果実を創出することができるという効果を有する。さらに、本発明は、交配育種によるよりも簡易かつ確実に花の形態を改変することができるため、労働力を削減することができるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
本発明は、植物体の花の形態を改変させる技術であって、下記（ｉ）または（ｉｉ）記載のアミノ酸配列からなるドメインを含む転写因子の標的となる遺伝子の転写を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させる。
（ｉ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列の第６３位から第１２１位までのアミノ酸配列。
（ｉｉ）上記（ｉ）記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【００３３】
上記転写因子の標的となる遺伝子の転写を抑制する方法は特に限定されるものではないが、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることが好ましい。これによって得られる植物体では、標的遺伝子の転写が抑制されるため、花の形態が改変された植物体を生産することができる。
【００３４】
つまり、上記転写因子は、花の正常な形態形成に不可欠なものであるため、上記転写因子が転写抑制因子に転換されることにより、花の形態形成に異常が引き起こされるといえる。ここで、本方法においては、上記転写因子が標的とする標的遺伝子は特定される必要がない。結果として、花の形態が改変されることから、上記標的遺伝子は、花の形成過程において、花の形態に影響を与える機能を有する遺伝子であることが推定されるが、その機能や構造の特定がされていなくても、本方法においては、その転写抑制を有効に行うことができる。
【００３５】
以降の説明では、本発明にかかる花の形態が改変された植物体の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。
【００３６】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、上記ドメインを含む転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。そこで、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００３７】
（Ｉ−１）上記ドメインを含む転写因子
本発明で用いられる転写因子は、上記（ｉ）または（ｉｉ）記載のアミノ酸配列からなるドメインを含む転写因子であれば特に限定されるものではない。上記（ｉ）または（ｉｉ）記載のアミノ酸配列は、ＴＣＰファミリータンパク質に共通して含まれるＴＣＰドメインのアミノ酸配列である。かかるＴＣＰドメインは、植物界で広く保存されているため、かかるドメインを含む転写因子は多くの植物が有している。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様のドメインを有するタンパク質が含まれる。
【００３８】
上記転写因子は、（ｉ）または（ｉｉ）記載のアミノ酸配列を少なくとも含むタンパク質であればその長さは特に限定されるものではない。
【００３９】
このような転写因子としては、例えば、キンギョソウのＣＹＣタンパク質や、ＣＩＮタンパク質、イネのＰＣＦ１タンパク質や、ＰＣＦ２タンパク質、トウモロコシのＴＢ１タンパク質、シロイヌナズナのＴＣＰ２タンパク質、ＴＣＰ３タンパク質、ＴＣＰ４タンパク質、ＴＣＰ５タンパク質、ＴＣＰ２４（ＴＡＬ１）タンパク質、ＴＣＰ１０タンパク質等を挙げることができるが特に限定されるものではない。
【００４０】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、シロイヌナズナのＴＣＰ５タンパク質を挙げることができる。ＴＣＰ５タンパク質は、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。後述する実施例においては、このＴＣＰ５タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＴＣＰ５タンパク質を転写抑制因子に転換させている。
【００４１】
ただし、上記転写因子としては、ＴＣＰ５タンパク質に限定されるものではなく、上記ＴＣＰドメインを有する転写因子であればよい。具体的には、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記ドメインを有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「（ｉ）記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」及び「配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００４２】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００４３】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＴＣＰ５タンパク質を用いる場合には、このＴＣＰ５タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＴＣＰ５遺伝子と称する）を挙げることができる。ＴＣＰ５遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４４】
もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１３５に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００４５】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００４６】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００４７】
（Ｉ−２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７、非特許文献１・２等参照）を挙げることができる。
【００４８】
本発明者は、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子およびこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献１〜４参照）。また、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献６参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００４９】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００５０】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００５１】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５２】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５３】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００５４】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４１、４２に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列である。
【００５５】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５６】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５７】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００５８】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４３、４４に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４４に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４５に示す。
【００５９】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００６０】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６１】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
【００６２】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００６３】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４６〜５４に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４６、４７または４８に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４９、５０または５１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５２、５３または５４に示すアミノ酸配列である。
【００６４】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号５、１４、５５に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐのアミノ酸配列が配列番号５５に示すアミノ酸配列である。
の場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合 特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００６５】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００６６】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）又は（ｆ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｅ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００６７】
上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００６８】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて変異が導入される。
【００６９】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００７０】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００７１】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００７２】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００７３】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３８、３９、又は４０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２７、２８、３０、３２、３８、３９、又は４０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２０、２３、３３、３４又は３５のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２４、２５、２６、２９、又は３１のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２１又は２２のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００７４】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３６または３７で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００７５】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００７６】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。
【００７７】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００７８】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号５６、５８、、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、又は１３２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、又は１３３に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９０、９１に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号１〜４０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００７９】
【表１】


【００８０】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００８１】
（ＩＩ）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、花の形態を改変する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００８２】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００８３】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００８４】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００８５】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００８６】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００８７】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【００８８】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００８９】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００９０】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００９１】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００９２】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００９３】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００９４】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【００９５】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。
【００９６】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００９７】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【００９８】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【００９９】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１００】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのものの花の形態から選抜してもよい。例えば、花の形態から選抜する例としては、形質転換体の花の形態を、形質転換していない植物体の花の形態と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。特に花の形態は、単に比較するだけでも選抜が可能になるとともに、花の形態の改変という本発明の効果そのものも確認することができる。
【０１０１】
本発明において「花の形態」が改変されているとは、花の形態に関する形質が改変されていれば、特に限定されるものではない。花の形態としては、例えば、花柄の長さ、花びらの形状、花びらの模様、花びらの色、がくの形状、さやの形状、雄しべの形状、雌しべの形状等を挙げることができ、果実の形態も含まれるが、これらに限定されるものではない。また、花の形態が改変されるとは、単独の形態が改変される場合と、複数の形態が同時に改変される場合を含む。
【０１０２】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により花の形態が改変された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１０３】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１０４】
（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、キメラタンパク質を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花の正常な形態形成に関与する標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。その結果、花の形態形成に異常が引き起こされ、得られる植物体の花の形態を改変することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１０５】
（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかる花の形態が改変された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、花の形態の改変によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目、モクレン目、クスノキ目、コショウ目、ウマノスズクサ目、シキミ目、スイレン目、キンポウゲ目、ケシ目、ヤマグルマ目、マンサク目、ユズリハ目、ブナ目、ナデシコ目、タデ目、バラ目、マメ目、ヤマモガシ目、カワゴケソウ目、アリノトウグサ目、フトモモ目、ミズキ目、ビャクダン目、ラフレシア目、ニシキギ目、トウダイグサ目、クロウメモドキ目、アマ目、ムクロジ目、フウロソウ目、セリ目等を挙げることができる。
【０１０６】
（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明では、植物体の花の形態を改変することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、花の形態の改変により効果がある分野であればよい。
【０１０７】
まず、本発明にかかるキメラタンパク質を植物体内で発現させることにより、花びらや雌しべ等の形態を変化させた新規な花卉植物を作製することができるため、新規な園芸品種を創出することが可能となる。例えば、これまでにない新たな鑑賞植物を得ることができる。
【０１０８】
また、本発明にかかるキメラタンパク質を植物体内で発現させることにより、さやの形態に異常を示す植物体が得られることが多い。さやは果樹の果実に相当するため、本発明にかかるキメラタンパク質を果樹の体内で発現させることにより、今までにない形態の果実を作ることができ、新規な農業上の市場を開拓することが可能となる。
【０１０９】
また、本発明によれば、交配育種によるよりも簡易かつ確実に花の形態を改変することができるため、労働力を削減することができ、農業上有用である。
【０１１０】
（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち花の形態改変キットを挙げることができる。
【０１１１】
この花の形態改変キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例及び図１ないし図７に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１３】
〔実施例１〕
以下の実施例１においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチドをＴＣＰ５遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１１４】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１１５】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１３６）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１３７）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１３８）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１３９）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１１６】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１１７】
（３）以下の配列番号１４０、１４１の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４０、１４１の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号１４０）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号１４１）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１１８】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１１９】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5'-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3'（配列番号１４２）
5'-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3'（配列番号１４３）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
【０１２０】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図３に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１２１】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１２２】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収した。
【０１２３】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１２４】
＜構築用ベクターへのＴＣＰ５遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＴＣＰ５タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１２５】
（１）シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＴＣＰ５遺伝子（At5g60970）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＴＣＰ５−Ｆ）5'-atgagatcaggagaatgtgatg-3'（配列番号１４４）
プライマー２（ＴＣＰ５−Ｒ stopless）5'-agaatctgattcattatcgctac -3'（配列番号１４５）
ＴＣＰ５遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３５および１３４に示す。
【０１２６】
（２）得られたＴＣＰ５コード領域のＤＮＡ断片を、図２に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１２７】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１２８】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１２９】
（１）まず、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）５．５μＬを加えた。
【０１３０】
（２）この溶液にＬＲ clonase４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１３１】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１３２】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
【０１３３】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸを、土壌細菌（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell １９８６))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、表２）に懸濁した。
【０１３４】
【表２】


【０１３５】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Triton Ｘ-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（表３）に蒔種した。
【０１３６】
【表３】


【０１３７】
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＣＰ５ＳＲＤＸの遺伝子が発現していることを確認した。
【０１３８】
ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナの表現型を野生型の表現型と比較した結果を図４ないし図７に示す。図４は、花柄の長さを示したものである。図４（a）は野生型の植物体、（ｂ）はｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体である。図４から明らかなように、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナの花柄の長さは野生型に比べて非常に短かった。
【０１３９】
図５は、花びらの形態を示したものである。図５（a）は野生型の植物体、（ｂ）はｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体である。図５から明らかなように、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナは、野生型に比べて小さい花びらを有していた。
【０１４０】
図６は、がくの形態を示したものである。図６（a）は野生型の植物体、（ｂ）はｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体である。図６から明らかなように、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナのがくは野生型に比べて幅が広く、（ｂ）において矢印で示したように、がくの縁からしばしば雌しべ様の組織を分化していた。
【０１４１】
図７は、さやの形態を示したものである。図７（a）は野生型の植物体、（ｂ）および（ｃ）はｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体をそれぞれ示している。図７（a）に示すように、野生型のシロイヌナズナのさやは、細長く扁平である。これに対し、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナのさやの形態は、例えば図７（ｂ）において矢印で示したように、柱頭から新たな組織を分化したものや、図７（ｃ）において矢印で示したように、野生型では二枚ある心皮のうち一枚から花が形成され、さやに形態変化したもの等が見られた。図７に示したもの以外にも、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナのさやの形態は異常を示すものが多かった。
【０１４２】
以上説示したごとく、ｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸで形質転換された植物体は、花の形態が改変されていることが確認され、ＴＣＰ５をコードする遺伝子は、花の正常な形態形成に不可欠であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明では、ＴＣＰドメインを有する転写因子の標的とする遺伝子の転写を抑制することによって花の形態や果実の形態が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や園芸、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子とＴＣＰ５遺伝子とを組み込む工程図である。
【図３】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図４】（ａ）は野生型のシロイヌナズナの花柄の長さを示す図であり、（ｂ）は組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの花茎の長さを示す図である。
【図５】（ａ）は野生型のシロイヌナズナの花びらの形態を示す図であり、（ｂ）は組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの花びらの形態を示す図である。
【図６】（ａ）は野生型のシロイヌナズナのがくの形態を示す図であり、（ｂ）は組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナのがくの形態を示す図である。
【図７】（ａ）は野生型のシロイヌナズナのさやの形態を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＴＣＰ５ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナのさやの形態を示す図である。
【出願人】 【識別番号】５０３３６０１１５
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】３０１０２１５３３
【氏名又は名称】独立行政法人産業技術総合研究所
【出願日】 平成１６年４月９日（２００４．４．９）
【代理人】 【識別番号】１０００８００３４
【弁理士】
【氏名又は名称】原 謙三
【公開番号】 特開２００５−２９５８７９（Ｐ２００５−２９５８７９Ａ）
【公開日】 平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【出願番号】 特願２００４−１１６２４９（Ｐ２００４−１１６２４９）