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【発明の名称】 混数性を利用した倍数体植物の作出方法
【発明者】 【氏名】井上 絵理子

【氏名】脇塚 巧

【氏名】西山 聡
【要約】 【課題】混数性を利用した倍数体植物の作出方法を提供する。

【解決手段】倍数体誘発剤や放射線等による染色体倍加処理によることなく、植物体の混数性現象を利用して、植物体組織内に混在する倍数性細胞を活用して不定芽を育成し、細胞の倍数性分析により倍数性個体を分析し、選抜することを特徴とする倍数性植物体の作出方法、混数性を持つ植物体の一部を切断し、その断面から発生する不定芽を育成し、その不定芽の倍数性を細胞の倍数性分析により分析し、倍数性個体を選抜し、育成することにより、倍数体植物を効率的に育成することを特徴とする倍数体植物の生産方法、及びこれらの方法により作出された４倍体植物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
倍数体誘発剤や放射線等による染色体倍加処理によることなく、植物体の混数性現象を利用して、植物体組織内に混在する倍数性細胞を活用して不定芽を育成し、細胞の倍数性分析により倍数性個体を分析し、選抜することを特徴とする倍数性植物体の作出方法。
【請求項２】
混数性を持つ植物体の一部を切断し、その断面から発生する不定芽を育成し、その不定芽の倍数性を細胞の倍数性分析により分析し、倍数性個体を選抜し、育成することにより、倍数体植物を効率的に育成することを特徴とする倍数体植物の生産方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法により作出された、かんきつの倍数体であって、ユズ又はブンタンの４倍体植物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の方法により作出された倍数体植物を利用して、３倍体植物を育成することを特徴とする３倍体植物の生産方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、混数性を利用した倍数体植物の作出方法に関するものであり、更に詳しくは、コルヒチン等の染色体を倍加させる作用を有する薬剤や放射線を用いることなく、倍数性個体を作出することを可能とする倍数体植物の作出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人為的に倍数体を作出する方法は、いくつか開発されている。倍数体誘発方法としては、コルヒチン等の倍数体誘発剤を使用する方法、ガンマ線、エックス線、紫外線等の放射線を使用する方法、及びこれらを併用するいくつかの方法、さい頭法など生物的な性質を利用する方法、高温処理法など物理的処理による方法などが挙げられるが、倍数体を作出する効率及び作業性の面から、従来、倍数体誘発剤を用いることが多く行われている。倍数体誘発剤としては、コルヒチン、笑気ガス、コルセミド、アセナフテンなどの効果が知られ、使用されている。
【０００３】
育種目的で一般に用いられているのはコルヒチン処理法であり、例えば、コルヒチンなどの倍数体誘発剤を使って植物の組織又は器官、例えば、種子や地下茎、あるいはカルス等の培養細胞を倍数体誘発剤を含む培地に一定時間浸漬する方法などがある。コルヒチンの最適処理濃度は、植物の種類、器官、処理時間などによって異なるが、一般に、０．１〜０．２％の水溶液を外部から分裂組織に吸収させる。対象が種子であるならば、播種直前のものを溶液に２〜３日浸漬処理する。発芽直後の芽生を処理するときは、生長点に溶液を滴下したり、溶液を含ませた脱脂綿で数日間覆っておく。栄養繁殖植物の場合は、側芽を芽生の生長点処理と同様に行う。材料の分裂能力や処理法によって成功率は異なるが、普通、コルヒチン処理によって５％内外の倍加個体が得られる。しかし、倍数化に付随してさまざまな遺伝的変化が生じるので、育種上重要な同質４倍体の獲得は容易ではない（非特許文献１）。
【０００４】
また、遺伝的な変異による倍数体個体の選抜も考えられる。珠心胚形成による多胚現象は、かんきつ類に多くみられるものである。その多胚について検討すると、多胚にみられる珠心胚実生は、遺伝的には母親と同一のはずであるが、それらの実生の中にはいくらかの変異が認められるので、それらの変異がかんきつ類の変異選抜育種に利用されてきた。珠心胚は１個の珠心細胞から発生すると考えられているので、その珠心細胞が倍加していれば、これから生ずる実生は全組織が倍加した個体となる。珠心胚形成は倍数的進化を遂げるためにはきわめて有利な機構といえる。事実かんきつ類では、珠心胚実生の中にかなりの頻度で４倍体が見いだされている。しかも、それは同質４倍体であると考えられている。しかし、かんきつ類のほとんどの種、品種は２倍体にとどまっており、倍数体がその生存繁栄のために何らかの不利な条件を持っているため、淘汰されたものと思われる。このほか、遺伝子突然変異とみなすべき変異がかなり認められている（非特許文献２）。
【０００５】
以上のような、珠心胚実生による４倍体個体を選抜する方法も考えられるが、偶然の要素が大きく関与するため、計画的に作出することは困難である。また、かんきつには、多胚性品種と単胚性品種の２種類があるが、珠心胚実生は、多胚性品種にのみ存在する。つまり、実生の中から偶然的に４倍体を見いだすことが期待できるのは、多胚性品種の場合に限られる。単胚性品種から交配により発生した４倍体は、雑種であるので、異質４倍体である。異質４倍体では、後に同質３倍体を得ることは困難である。
【０００６】
このほか、珠心胚実生では、遺伝子突然変異とみなすべき変異がかなり認められている。このような突然変異が、いつどこで生起するのかは全くわかっていない。しかし、珠心胚及びその実生の全組織が変異体になることは間違いない。突然変異は、最初はキメラ状に存在する。母体の一部にキメラ的に介在して検知できなかった突然変異が、珠心の１細胞を通じて全組織が変異した珠心胚実生となり、目に留まりやすくなることは確かである（非特許文献３）。
【０００７】
倍加処理が成功したかどうかの判別は、次の方法による。まず、外部形態により４倍体の諸特性を考慮して第一次選抜を行う。４倍体は、２倍体に比べて一般に葉は大きくて気孔孔辺細胞の単位面積当たりの数は少ないが、形は大きくてその中に含まれる葉緑粒数は多い。花は大きくて花粉粒も大きいが、不稔性は高い。果実は大きいが、結果率は低い。枝張りは粗剛で、樹勢は強健であるなどの特徴を持っている。この際、一般には、気孔孔辺細胞の大きさ及びその中の葉緑粒数の多少により判定し、次いで細胞分裂時の染色体数を数えて倍加を確かめる。しかし、この検定を行い難い場合には、花粉粒の大小や花粉稔性などで二次選抜を行い、次いで得られる種子を用い、次代における体細胞染色体数の確認から４倍性を判定する。なお、果樹類では処理から開花結実までに長時間を要する（非特許文献４）。このように、倍数体を判別するにはいろいろあるが、確定するまでには時間と手間を要する。
【０００８】
第１の問題点は、倍加個体を作出するためには、それぞれの植物にとって最適な倍数体発現方法を探さねばならないことである。仮に、倍数体誘発剤を利用するにしても、倍加に最適な植物の組織又は器官、処理濃度、処理時間などの条件設定が必要になってくる。そのためには、時間と労力を要する。また、倍数体誘発剤で処理した場合、高濃度や時間超過によって枯死に至ったり、逆に処理濃度や時間が不足するとコルヒチンの効果も無いなど、無駄が多い。
【０００９】
【非特許文献１】農学大事典，１１９４頁，養賢堂（１９９４）
【非特許文献２】果樹園芸大事典，１１２頁，（１９９１）
【非特許文献３】果樹園芸大事典，１１２頁，（１９９１）
【非特許文献４】果樹園芸大事典，１０６−１０７頁，（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、従来の方法は、時間と労力がかかっていた。本発明は、このような技術背景の下になされたものであり、その目的とするところは、簡単、確実に倍加個体が作出され、省力的に検定して同質４倍体個体を得られることにある。本発明は、従来の倍加方法に固執せず、植物が本来持っている、１つの個体に２つ以上の倍数性が存在する現象、混数性を利用して、２倍体の植物から発生する不定芽から、４倍体の不定芽を選抜し、育成させることで、同質４倍体を直接得ることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）倍数体誘発剤や放射線等による染色体倍加処理によることなく、植物体の混数性現象を利用して、植物体組織内に混在する倍数性細胞を活用して不定芽を育成し、細胞の倍数性分析により倍数性個体を分析し、選抜することを特徴とする倍数性植物体の作出方法。
（２）混数性を持つ植物体の一部を切断し、その断面から発生する不定芽を育成し、その不定芽の倍数性を細胞の倍数性分析により分析し、倍数性個体を選抜し、育成することにより、倍数体植物を効率的に育成することを特徴とする倍数体植物の生産方法。
（３）前記（１）又は（２）に記載の方法により作出された、かんきつの倍数体であって、ユズ又はブンタンの４倍体植物。
（４）前記（１）又は（２）に記載の方法により作出された倍数体植物を利用して、３倍体植物を育成することを特徴とする３倍体植物の生産方法。
【００１２】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、植物体の組織の中に、その植物体の本来の倍数性とは異なる倍数性の細胞が存在する、混数性という現象を利用し、通常２倍体の組織を切断し、その断面に不定芽を発生させ、発生した不定芽のＤＮＡ量を細胞の倍数性分析により確認し、４倍体個体を得ることを特徴とするものである。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明するが、以下、代表的なものとして、かんきつ類の場合を例として説明する。しかし、混数性は、ミカン科以外の多くの植物、例えば、ナス科植物でも確認されており、本発明は、広く一般の植物に適用されるものであり、かんきつ類に限定されるものではない。本発明では、もとの植物体は、本来は２倍体に限らない。よって、倍加して得られた個体も、４倍体とは限らない。
【００１４】
材料とする植物としては、不定芽が得られる植物であればどのようなものでもよい。植物の種子を暗黒下におき、実生を伸長させ、実生上胚軸を切断する。そこから出た不定芽を成長させる。このように発生させたすべての不定芽について、細胞の倍数性分析方法により倍数性の分析を行う。この分析では、ＤＮＡ量を測定し、対比することで細胞の倍数性が分析される。分析方法については、特定の倍数性分析法に限定されず、汎用のＤＮＡ量測定装置を用いたフローサイトメトリー法や顕微鏡によって確認する方法、染色体数を算定する方法が挙げられる。また、倍加植物は倍加処理前の植物に比べて細胞容積が大きくなるため、葉や花弁が厚くなり、孔辺細胞の大きさが増大することが知られているため、孔辺細胞の大きさを測定して倍加植物を選抜してもよい。しかし、これに限らず、好適の方法を用いて、倍加した可能性がある個体を選抜し、育成する。
【００１５】
本発明の作出方法によって得られた植物は、４倍体であることから、実用果実の重要な要素である種なしを目的とした３倍体育種に利用できる。本発明は、倍数体誘発剤や放射線による倍加処理に伴う突然変異を避けることができる。また、かんきつ類においては、多胚性品種と単胚性品種の２種類が存在し、多胚性品種だけでなく、単胚性品種においても同質４倍体が得られるようになる。植物全般においては、ゲノムの倍加によって細胞や器官の大型化、発育の旺盛化、各種の抵抗性の強化、含有成分の増減、晩生化、稔性低下など、特にクワ、果樹類、花類などの育種では利用性が高い。果樹の場合、たとえば、リンゴ等においては、４倍体は２倍体に比べて一般に果実が大きく、不稔性が高く、樹勢が強健であるなどの特徴を持っており、実用性が高い。
【００１６】
本発明により作出された４倍体と本来の２倍体とをかけ合わせて同質３倍体を作ることができる。一般に、３倍体は、種なし、大果、強健、豊産の性質が高まる。このとき、種子繁殖作物では３倍体の初期生育の弱さが栽培性からみて欠点となる場合があるが、いったん選抜が終わった成木であれば、栄養繁殖によってそれらの持つ強健性、大果性、豊産性などを利用することができる。３倍体個体が無核化するのは、３倍体は還元分裂の過程において染色体の配分が均等に行われず、多くは異数性配偶子となって不稔になるからである。このため、多くの３倍体は、種なし果となる。３倍体が簡単に作出できれば果樹生産において有用な品種となる。柑橘にとどまらず、他の果樹や植物に応用でき、様々な場面で必要となるので、３倍体を作る前の段階として、倍数体誘発剤を用いずに本来存在する混数性を利用して簡単に４倍体を作ることができる本発明は、今後、有効な育種素材作出法としての利用価値が非常に高いと考えられる。
【００１７】
本発明は、植物の組織に存在する混数性の現象を利用し、その組織から発生させた不定芽を育成し、倍数性個体を選抜するものである。コルヒチン等の染色体を倍加させる薬剤を使用したときには、適切な濃度や時間調整の模索が必要で、また、作出された個体にも、様々な変異個体が発生し、キメラ個体も多く発生する。それに対し、本発明の方法を用いると、目的の倍数体を確実に得ることが可能である。本発明で作出された倍数体は、交配によるものではないので、更に、倍数体育種をする場合、大変有利になる。
【００１８】
本発明では、４倍体植物の作出に費やす労力を大幅に削減し、効率的に作出することが可能である。そのため、その４倍体を利用し、もとの２倍体と交配することで、３倍体個体の作出に利用することができる。３倍体は、無核化又は大型化するなどの特徴をもつことから、様々な植物の育種に応用されている。果樹を例に挙げると、種なしや大型の果実となり、消費者にとっては食べ易く、大変好まれるため、需要が拡大し、生産農家にも利益をもたらす。よって、本発明により得られる倍数体は、育種素材としての利用価値が高いと考えられる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、１）混数性を利用した新しい倍数体植物の作出方法を提供することができる、２）本発明の方法により、簡便な手段で、効率よく、４倍体個体を作出することができる、３）本発明の方法を利用することにより、計画的に４倍体個体を作出することができる、４）本発明の方法により作出された倍数体植物は、育種素材として有用である、という格別の効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、該実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
以下、ユズ（Citrus junos Sieb. ex Tanaka）と土佐文旦（Citrus grandis Osbeck forma Tosabuntan）植物の場合を例として説明する。
かんきつ類は、種子の胚の数によって、多胚性品種と単胚性品種とに分けられる。ユズは、多胚性、土佐文旦は、単胚性であるが、多胚性、単胚性共に混数性の性質を持っている。それは、本来は２倍体の個体であるのに、その実生胚軸には２倍体と４倍体の細胞が入り混じった状態で存在している（図３及び５）。特に若い個体ほど混在率が高いので、播種して伸長した実生胚軸は、早い時期に切断して不定芽を得る方が、発生する不定芽のうち、倍数性不定芽の割合がより高くなる。そのことを利用して、本発明の方法により４倍体が得られる。しかし、本発明は、広く一般の植物に適用されるものであり、ユズや土佐文旦をはじめとするかんきつ類に限定されるものではない。また、本発明は、実生に限らず、混数性が存在する組織、例えば、茎・葉・花器などの組織に適用される。
【００２２】
ユズの種皮を除去し、珠心胚を蒸留水で浸したろ紙の上で数日間暗黒下（２６℃、湿度７０％）で発根させる。一方、土佐文旦は種皮を除去した胚を、ユズと同様の方法で発根させる。それぞれに発根させた種子を、バーミキュライトを入れたプランターへ植え付け、数日間暗黒下（２６℃、湿度７０％）で胚軸を伸長させたあと、通常の育成条件下（２６℃、湿度７０％、蛍光灯１４時間日長）へ置いた。１日後、プラスチックカップに胚軸を伸長させた実生を１本ずつ植え付け、上胚軸下部を水平に切断した。播種から切断までの日数は、１６日前後とした。その切断面にパスツールピペットで蒸留水を滴下し、透明プラスティック容器を植物体全体に被せ、切断面が乾燥しないようにした。この切断した苗を、通常の育成条件（２６℃、湿度７０％、蛍光灯１４時間日長）で育成した。水平切断面から発生する全ての不定芽を約２ヶ月間育成した。
【００２３】
育成した幼苗から、下位節の葉（展開して硬化したもの）の中心部分を採取し、倍数性分析試料とした。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）により蛍光染色し、フローサイトメーターにより数千個の細胞についてＤＮＡ量を測定した。そして、ユズ７２不定芽、土佐文旦５６不定芽のうち、各１個体が４倍体であることを確認した（図１，２，４及び図６）。
更に、ＤＮＡ量による確認だけでなく、表現型によって倍数性を確認するため、葉の気孔孔辺細胞の長径と短径を顕微鏡で観察し、４倍体であることを再度確認した（表１）。
【００２４】
【表１】


【産業上の利用可能性】
【００２５】
以上詳述したように、本発明は、植物の胚軸の切断面から発生した不定芽を育成し、ＤＮＡ量を測定して、選抜するだけで、４倍体個体が得られるため、倍数体誘発剤等を用いる場合のような突然変異誘発の危険がない。また、かんきつにおいて言えば、単胚品種でも多胚品種でも同じように４倍体個体が得られる。本発明の４倍体作出方法は、簡便で、効率がよく、更には、本発明により作出された４倍体は、３倍体育種への利用が可能となる。例えば、果樹の場合、果実が種なしであることは、食用に供するかんきつのきわめて有用な条件であり、非常に食べやすいことから、消費者にも好まれ、生産者にもより多くの利益をもたらすことになる。その他、本発明の方法は、果実にとどまらず、さまざまな植物において応用が利き、可能性が広がる。このように３倍体は実用上きわめて有用であるが、その作出には通常４倍体と２倍体の交配が一般的に行われるので、計画的に４倍体を作出する技術の価値はきわめて高い。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】２倍体ユズの上胚軸切断面から得られた４倍体の植物体。
【図２】２倍体土佐文旦の上胚軸切断面から得られた４倍体植物体。
【図３】ユズの上胚軸をフローサイトメーターによって分析した結果。
【図４】ユズの上胚軸から発生した４倍体不定芽を育成し、葉をフローサイトメーターによって分析した結果。
【図５】土佐文旦の上胚軸をフローサイトメーターによって分析した結果。
【図６】土佐文旦の上胚軸から発生した４倍体不定芽を育成し、葉をフローサイトメーターによって分析した結果。
【出願人】 【識別番号】５９６１３５７５５
【氏名又は名称】株式会社愛媛柑橘資源開発研究所
【識別番号】５９８０８７５８６
【氏名又は名称】愛媛県農業協同組合連合会
【出願日】 平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【代理人】 【識別番号】１００１０２００４
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 政彦
【公開番号】 特開２００５−２８７４２３（Ｐ２００５−２８７４２３Ａ）
【公開日】 平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【出願番号】 特願２００４−１０８３２８（Ｐ２００４−１０８３２８）