| 【発明の名称】 |
植物による汚染土壌の浄化 |
| 【発明者】 |
【氏名】高橋 明裕
【氏名】横山 雅裕
【氏名】大森 俊雄
【氏名】野尻 秀昭
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| 【要約】 |
【課題】ダイオキシン類等の多環芳香族化合物を分解するカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を植物に導入することにより、ダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物汚染土壌を浄化し、しかも植物体を回収、焼却せずに低コストで無害化する方法を提供すること。
【解決手段】植物に、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０由来のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡであるターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）及びフェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡを導入し、ダイオキシン類等の多環芳香族化合物を吸収し、代謝分解するカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物を作製し、この形質転換植物をダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物で汚染された土壌に植栽し、汚染土壌を浄化する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とするカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
【請求項２】
カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
【請求項３】
カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが、ターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）及びフェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
【請求項４】
ターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項３記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつターミナルオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項５】
フェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項３記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するタンパク質
【請求項６】
ダイオキシン類等の多環芳香族化合物を吸収し、代謝分解することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
【請求項７】
被子植物（単子葉植物・双子葉植物）又は裸子植物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物を、ダイオキシン類等の有害な多芳香族化合物で汚染された土壌に植栽することを特徴とする汚染土壌の浄化方法。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０等に由来するカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（ｃａｒＡａ遺伝子及びｃａｒＡｃ遺伝子）を導入した植物、及び該植物を利用してダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物で汚染された土壌を無毒化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
都市ゴミや産業廃棄物等の焼却に伴い発生したダイオキシン類は、大気中に放出され、周辺の土壌や河川を汚染している。特に、飛灰に多量のダイオキシン類が含まれているため、焼却場付近の汚染が著しい。ダイオキシン類は難分解物であるために土壌に蓄積していき、年々汚染が進行する。
【０００３】
一般に、塩素数が１から８までの７５種類のポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、１３５種類のポリ塩化ジベンゾフランを含めてダイオキシン類と呼ばれているが、平面構造をもつコプラナ−ＰＣＢもダイオキシン類に含める場合が多い。これらダイオキシン類は、食物連鎖により生物濃縮され、催奇形性、発癌作用を示すことが知られており、その強い毒性による人体への悪影響が懸念されている。
【０００４】
ダイオキシン類による汚染を防止するために、発生源である焼却炉を高温焼却炉にする取組みがなされているが、多大な費用を要するためあまり改善されていないのが現状である。一方、汚染された土壌を浄化するために、汚染土壌を非汚染土壌に入れかえる方法がとられているが、この方法は一時的な処理方法であり根本的な解決とはなっていない。
【０００５】
他方、発癌性を有するカルバゾールを炭素源及び窒素源として資化しうるPseudomonas resinovorans ＣＡ１０が発見され、その分解にカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼが関与することが明らかとなった（例えば、非特許文献１参照）。この酵素はターミナルオキシゲナーゼ（ＣａｒＡａ）、フェレドキシン（ＣａｒＡｃ）並びにフェレドキシンレダクターゼ（ＣａｒＡｄ）より構成される多成分ジオキシゲナーゼで、その一次構造も解明されている（例えば、非特許文献２参照）。この酵素の基質特異性は広く、ダイオキシン類等の難分解化学物質を酸化分解するのみならず、ナフタレン、フルオレンやビフェニル等の多環芳香族化合物にも作用することが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。このPseudomonas resinovorans ＣＡ１０に由来するヘテロ多環芳香族炭化水素を安息香酸類似体ヘ変換する、微生物由来の酸化酵素遺伝子（カルバゾール 1,9-aジオキシゲナーゼ遺伝子）で形質転換した微生物を用いてジベンゾ−ｐ−ダイオキシンをジフェニルエーテルトリオール体に変換し、ダイオキシンで汚染された土壌や水を浄化する方法（例えば、特許文献１参照）も知られているが、このような微生物による環境浄化、いわゆるバイオレメディエーションが、多大な費用を要する従来の物理的、化学的処理方法の代替として検討されている。しかし、一般的に微生物による土壌浄化では、汚染土壌中に住む在来菌の増殖を抑え、接種した菌に栄養源を与えて長期間増殖し続けるために多大な労力と費用を要する。
【０００６】
このような観点から植物を用いた、いわゆるファイトレメディエーションによる環境浄化が検討され始めている。植物は独立栄養的に生育するので微生物による浄化と比べメリットがある。植物はダイオキシン類を吸収しないというのが定説であったが、近年、一部の植物で根からダイオキシン類を吸収することが報告された（環境研究機関連絡会成果発表会、2003 於筑波）。しかし、ダイオキシン類を吸収する植物を汚染地に植栽する方法（例えば、特許文献２参照）ではダイオキシン類を植物体に蓄積してしまい、植物を回収、焼却しなければならないので労力と費用を必要とする。
【０００７】
最近、環境汚染物質分解遺伝子を導入した根粒菌が耕作地を効率的に浄化する可能性があることに着目し、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０に由来するヘテロ多環芳香族炭化水素化合物酸化酵素遺伝子（カルバゾール 1,9-aジオキシゲナーゼ遺伝子）を導入した根粒菌により根粒を形成させた豆科植物を用いた環境汚染物質除去方法が報告されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−２５７８９５号公報
【特許文献２】特開平１１−３３３４４２号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５４５号公報
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol.57 P455-460(1993)
【非特許文献２】J. Bacteriol Vol.179 P4850-4858(1997)
【非特許文献３】J. Bacteriol Vol.181 P3105-3113(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ダイオキシン類等の多環芳香族化合物を分解するカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を植物に導入することにより、ダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物汚染土壌を浄化し、しかも植物体を回収、焼却せずに低コストで無害化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０由来のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼを構成するターミナルオキシゲナーゼ（ＣａｒＡａ）、フェレドキシン（ＣａｒＡｃ）並びにフェレドキシン（ＣａｒＡｄ）の内、ＣａｒＡａとＣａｒＡｃの２つのタンパク質を植物で発現させ、ＣａｒＡｄを植物が持つフェレドキシンレダクターゼで代用することによりカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼが植物体内で機能することを見い出し、ｃａｒＡａとｃａｒＡｃの２遺伝子を植物に導入することで、吸収したダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物を植物体内で分解する形質転換体を得ることに成功した。また、この形質転換植物をダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物で汚染された土壌に植栽し、汚染土壌を無害化しうることを見い出した。本発明は、これら知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、（１）植物に、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導入されている、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物や、（２）カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０由来のＤＮＡであることを特徴とする上記（１）記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物や、（３）カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが、ターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）及びフェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡである上記（１）又は（２）記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物や、（４）ターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）をコードするＤＮＡが、(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつターミナルオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである上記（３）記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物や、（５）フェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡが、(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである上記（３）記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物や、（６）ダイオキシン類等の多環芳香族化合物を吸収し、代謝分解する上記（１）〜（５）のいずれか記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物や、（７）被子植物（単子葉植物・双子葉植物）又は裸子植物である上記（１）〜（６）のいずれか記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物に関する。
【００１２】
また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれか記載のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する形質転換植物を、ダイオキシン類等の有害な多芳香族化合物で汚染された土壌に植栽する汚染土壌の浄化方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、ダイオキシン類等の多環芳香族化合物を分解するカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を植物に導入することにより、ダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物汚染土壌を浄化し、しかも植物体を回収、焼却せずに低コストで無害化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ活性を有する植物としては、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導入され、該ＤＮＡが発現する植物であれば特に制限されるものではなく、上記カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡの由来としては、Pseudomonas resinovorans strain CA10（前記特許文献１，３、非特許文献１）、Pseudomonas stutzeri strain OM1（J. Gen. Appl. Microbiol. 44, 57-63, 1998、Biotechnol. Lett., 25, 1255-1261, 2003）、Sphingomonas sp. strain KA1（FEMS Microbiol. Lett., 211, 43-49, 2002）、Sphingomonas sp. strain GTIN11（Biochem. Biophys. Res. Commun., 297,1255-1261, 2003）、Pseudomonas resinovorans strain CA06（Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 455-460, 1993）、Ralstonia sp. strain RJGII.123（Can. J. Microbiol., 46, 269-277, 2000）、Pseudomonas stutzeri strain ATCC 31258（Biosci. Biotechnol. Biochem., 58,213-214, 1994）、Pseudomonas sp. strain LD2（Environ. Sci. Technol., 30, 575-585, 1996）、Sphingomonas sp. strain CDH-7（Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 1563-1568, 1999）、Janthinobacterium sp. strain J3、Pseudomonas sp. strain K23、Pseudomonas sp. strain K15、Pseudomonas sp. strain K22、Pseudomonas putida HS01、Pseudomonas putida HS02、Janthinobacterium sp. strain J4、Pantoea sp. strain J14、Novosphingobium sp. strain J30、Pseudomonas sp. strain K11
Sphingomonas sp. strain M2、Sphingomonas sp. strain J40などを挙げることができる。
【００１５】
上記カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡとしては、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼを構成するターミナルオキシゲナーゼ（ＣａｒＡａ）、フェレドキシン（ＣａｒＡｃ）及びフェレドキシンレダクターゼ（ＣａｒＡｄ）を具体的に例示することができるが、ＣａｒＡｄを植物が持つフェレドキシンレダクターゼで代用する場合、上記カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡとして、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼを構成するターミナルオキシゲナーゼ（ＣａｒＡａ）及びフェレドキシン（ＣａｒＡｃ）を好適に例示することができる。
【００１６】
上記ターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）をコードするＤＮＡとしては、(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつターミナルオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを具体的に例示することができ、また、フェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡとしては、(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを具体的に例示することができる。そして、フェレドキシンレダクターゼ（ＣａｒＡｄ）をコードするＤＮＡとしては、ＤＤＢＪアクセッションナンバー［ＡＢ０４７５４８；３２９５１−３３２７４］を具体的に例示することができる。
【００１７】
本発明において、上記カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導入される植物としては、被子植物（単子葉植物・双子葉植物）又は裸子植物等特に制限されず、花卉、果菜、葉菜、根菜、穀類、観葉植物、芋類、豆類、工芸作物、果樹、樹木、水棲植物などの植物、それら植物の培養細胞のうちから適宜選択することができるが、強いフェレドキシンレダクターゼ活性を有する植物やカルバゾール吸収能に優れた植物が好ましい。具体的には、アオイ科のケナフ、ワタ、アカザ科のホウレンソウ、アブラナ科のインディアンマスタード、シロイヌナズナ、アブラナ、イネ科のエノコログサ、モロコシ、ウリ科のキュウリ、ズッキーニ、ヒョウタン、キク科のヒマワリ、ベニバナ、オナモミ、ゴマ科のゴマ、シソ科のシソ、シナノキ科のモロヘイヤ、ナス科のナス、チョウセンアサガオ、タバコ、マメ科のダイズ、ポプラ、アシ、スギ、ヒノキ等を挙げることができる。
【００１８】
これらの植物体へ上記カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して本発明の形質転換植物を作製するには、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ、好ましくは、ターミナルオキシゲナーゼをコードするｃａｒＡａ遺伝子、若しくはフェレドキシンをコードするｃａｒＡｃ遺伝子、又は両遺伝子を適当なベクターに組み込み、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子ＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の遺伝子ＤＮＡを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。
【００１９】
例えば、イネについては、エレクトロポレーション法（Nature 338:274, 1989）、アグロバクテリウム法（Plant J. 6:271, 1994）、パーティクルガン法（Plant Cell Rep. 14:586, 1995）等により形質転換を行うことができる。また、アブラナやタバコについては、アグロバクテリウム法（Plant Mol. Biol. 26:1115,1994）、アグロバクテリウムを用いたリーフディスク共存培養法（EMBO J. 6:2531, 1987）、エレクトロポーレーション法（Plant Tissue CultureLetters 11:199, 1994）によって形質転換することができる。大豆等についても、アグロバクテリウム法（Bio/technology 6:915, 1988）、エレクトロポーレーション法（Plant Cell Rep. 10:106, 1991）、パーティクルガン法（Theor.Appl.Gnet. 79:337, 1990）等により形質転換を行うことができる。
【００２０】
植物にカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを導入するために用いられるベクターとしては、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Blue-Ｔベクターなどのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスなどを挙げることができ、これらベクターにカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを作製する方法としては、遺伝子工学の分野で周知の手法を適用することができ、例えば、構造が既に解析されている上記ベクターの所定の位置の塩基配列を制限酵素で切断し、次いで切断ベクターの末端にカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ、例えば、ターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）及び／又はフェレドキシン（ｃａｒＡｃ）をコードするＤＮＡを酵素的に導入することにより組換えベクターを得ることができる。また、適切なプロモーターとターミネーター等の制御配列をあらかじめカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡに連結させておくこともできる。かかるプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。
【００２１】
上記組換えベクターは、通常、植物細胞（受容体細胞）に効率よく導入することができ、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導入された植物細胞は、抗生物質等の薬剤耐性の性質を利用することにより選抜することができる。カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを植物細胞のゲノムＤＮＡ内に組み入れることによって、植物細胞がカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼを産生するように形質転換を生じさせることができる。すなわち、上記組換えベクターを各種植物の培養細胞に導入することにより、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ産生能を有する植物培養細胞を得ることができる。これら形質転換植物細胞は、公知の方法で分化させることにより植物体を得ることができる。また、上記組換えベクターを用いて種々の農作物や園芸植物の形質転換を行うことによって、ダイオキシン類を含む多環芳香族化合物を吸収、分解する形質転換植物を得、これを用いてダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物で汚染された土壌を浄化することが可能となる。
【００２２】
以上のようにして作製された植物を、ダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物で汚染された土壌に植栽することにより有害物質を吸収分解し、汚染土壌を浄化することができる。ここで、有害な多環芳香族化合物として、具体的に、塩化ジベンゾーｐ−ダイオキシン、塩化ジベンゾフラン、カルバゾール、塩化ビフェニル、アントラセン、フルオレンを例示することができる。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
［ベクターの構築とシロイヌナズナへの導入］
（１）ｃａｒＡａを挿入したベクターの作製
Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０のゲノムＤＮＡから、カルバゾールの代謝分解に関与する３つの酵素、すなわちカルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼ（ＣａｒＡ）、２'−アミノビフェニル２，３−ジオール１，２−ジオキシゲナーゼ（ＣａｒＢ）及び２−ヒドロキシ−６−オキソ−６−（２'−アミノビフェニル）−ヘキサ−２，４−ジエノイックアシッドヒドロラーゼ（ＣａｒＣ）をコードする遺伝子を切りだし、クローニングベクターであるｐＵＣ１１９に挿入することにより作製されたプラスミドｐＵＣＡ１（J. Bacteriol Vol.179 P4841-4849(1997)）からターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）遺伝子（配列番号１）を得るために、プライマー合成を行った。各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＰＣＡＡ−Ｆ：５'−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡ−３'（配列番号５）
ＰＣＡＡ−Ｒ：５'−ＧＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＧ−３'（配列番号６）
【００２５】
上記の合成ＤＮＡプライマーを用い、ｐＵＣＡ１上にあるｃａｒＡａをテンプレートとし、TOYOBO KOD-Plus-ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で１５秒、６１℃で３０秒、６８℃で９０秒を３０サイクル行った。上記ＰＣＲ産物をBam HIとSac I で消化した後、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて反応液を処理し、ｃａｒＡａインサート断片を得た。次ぎに、植物用発現ベクターであるプラスミドｐＢＩ１２1（Plant Cell Report Vol.9 p55-60 1990）をBam HIとSac I で消化し、ＧＵＳ遺伝子を除去し、さらにエビアルカリフォスファターゼ（Roche）で５'末端を脱リン酸化することにより調製したベクター断片に上記のｃａｒＡａインサート断片を挿入し、ＤＮＡリガーゼ（TOYOBO）で連結した。得られたプラスミドベクターをｐＢＩｃａｒＡａと命名した（図１）。
【００２６】
（２）ｃａｒＡｃを挿入したベクター作製
プラスミドｐＵＣＡ１からフェレドキシン（ｃａｒＡｃ）遺伝子（配列番号３）を得るために、プライマー合成を行った。各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＰＣＡＣ−ＸＢ：５'−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＡＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧ−３'（配列番号７）
ＰＣＡＣ−ＳＡ：５'−ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴ−３'（配列番号８）
【００２７】
上記（１）と同様の方法で、ｐＵＣＡ１上にあるｃａｒＡｃをテンプレートとしてＰＣＲを行って得たＰＣＲ産物をXba IとSac Iで消化し、ｃａｒＡｃインサート断片を得た。次いで、植物用発現ベクターであるｐＳＭＡＢ７０４（森林総合研究所研究報告 Vol.1 p235-240 2002）をXba Iとsac Iで消化してＧＵＳ遺伝子を除去し、アルカリフォスファターゼで処理して調製したベクター断片に、上記のｃａｒＡｃインサート断片を挿入した。得られたプラスミドベクターをｐＳＭＡＢ ｃａｒＡｃと命名した（図２）。
【００２８】
（３）シロイヌナズナへの導入
凍結法にてｐＢＩｃａｒＡａ及びｐＳＭＡＢ ｃａｒＡｃを導入したAgrobacterium tumefaciens ＬＢＡ４４０４株（Plant Cell Report Vol.9 p55-60 1990）を用いて、インプランタ（in planta）法にてシロイヌナズナを形質転換した。まず、ｐＢＩｃａｒＡａを保持したAgrobacterium tumefaciens ＬＢＡ４４０４株の菌体濃度がＯＤ600＝０．８になるように３７５ｍＬの形質転換バッファー（５％ sucrose, １０ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ, ４４ｎＭ ＢＡＰ, ０．０５％ Silwet Ｌ−７７）に懸濁した。次ぎに、蕾の付いたポット植えのシロイヌナズナの地上部を前記懸濁液に３０秒間浸漬し、その後、各ポットをビニール袋で３日間覆った。覆いを取った後、さらに栽培を続け、種子を得た。栽培はグロースチャンバーー（１６ｈ明/８ｈ暗、温度２２℃、湿度５０％、照度１．６x１０4ｌｘ）内で行った。
【００２９】
得られた種子を殺菌し、５０ｐｐｍのカナマイシン、２００ｐｐｍのセフォタキシム及び０．８％の寒天を含む１／２濃度のMurashige & Skoogの培地（Physiol.Plant Vol.15 P473-497 (1962)）に播種し、形質転換体を得た（ＫＡ系）。この形質転換体を土に移植し、グロースチャンバー内で栽培し、２世代目の種子を得た。さらに前記培地で２世代目の種子から選抜した個体を粉砕し、５０ｍＭのリン酸バッファー(ｐＨ７．５)で抽出した総タンパクを試料とし、マウス抗ＣａｒＡａポリクローナル抗体を用いたウエスタン・ブロッティングを行った結果、酵素の生成が確認された。
【００３０】
さらに、ｐＳＭＡＢ ｃａｒＡｃを保持したAgrobacterium tumefaciens ＬＢＡ４４０４株を、先と同様な方法でｃａｒＡａを発現するシロイヌナズナに感染させ、栽培後、種子を得た。殺菌した種子を２．５ｐｐｍのグルホシネート、２００ｐｐｍのセフォタキシム及び０．８％の寒天を含む１／２濃度のMurashige & Skoogの培地に播種し、２つ目の遺伝子であるｃａｒＡｃが導入された形質転換体（ＫＧＡＣ系）を得、２世代目の種子を採種した。２世代目の種子からグルホシネートを含む上記培地で選抜した個体の一部を取り、RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)でＲＮＡを抽出し、ＤＩＧ標識したｃａｒＡｃ ＤＮＡ断片を用いてノーザン・ハイブリダイゼーションを行った結果、ｃａｒＡｃが発現していることを確認した。
【実施例２】
【００３１】
［形質転換シロイヌナズナによるカルバゾール代謝］
グロースチャンバー内で花芽形成期まで生育させた形質転換シロイヌナズナＫＡ系及びＫＧＡＣ系の葉に１００ｐｐｍのカルバゾール水溶液（１％の Dash及び１％の界面活性剤を含む）をマイクロシリンジで1株あたり１００μｌ滴下し、２日間栽培した。それぞれの地上部を切り取り、１５ｍｌ／ｇ ｆ.ｗ.の９０％メタノールを加えホモジェネートした。ろ過後、ろ液に等量のクロロホルムを加え、３回液−液分配し、クロロホルム層を濃縮乾固した。さらに４ｍｌのメタノールで固形物を溶かしてから６ｍｌの水を加え、Sep Packで分離し、ＨＰＬＣでカルバゾールを定量した。野生型シロイヌナズナを対照とし、カルバゾール滴下量に対する残存率を表1に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
上記の結果から、Pseudomonas resinovorans ＣＡ１０由来のターミナルオキシゲナーゼ（ｃａｒＡａ）及びフェレドキシン（ｃａｒＡｃ）の２遺伝子を導入したＫＧＡＣ系はカルバゾールを代謝分解したが、ｃａｒＡａのみを導入したＫＡ系では、野生型と同様にカルバゾールの分解が見られなかった。従って、カルバゾール１，９ａ−ジオキシゲナーゼを構成する1成分のフェレドキシンレダクターゼを、植物のもので代用することにより、その機能が植物体中で発現することが判明した。こうした形質転換植物をダイオキシン類等の有害な多環芳香族化合物で汚染された土壌に植栽する事により有害化学物質を分解除去できると考えられる。
【実施例３】
【００３４】
［ベクターの構築とヒマワリへの導入］
（１）ｃａｒＡａ−ＴNOSを挿入したプラスミドｐＵＣＣＡＴＮの作製
２遺伝子をｐＳＭＡＢ７０４に導入するため、初めにｃａｒＡａ−ＴNOS−ＰEF1A−ｃａｒＡｃインサートを構築し、次いでｐＳＭＡＢ７０４のＧＵＳ遺伝子を除去し、構築したインサートを挿入する方法を採用した。ＰEF1Aはシロイヌナズナの翻訳伸長因子ＥＦ１Ａ Ａ１遺伝子のプロモーター（Nucleic Acids Res. 19:1305, 1991）で、３５Ｓプロモーターとのサイレンシングを回避するために使用した。
【００３５】
まずｃａｒＡａ−ＴNOSインサートを調製するために、プラスミドｐＵＣＡ１からｃａｒＡａを得るためのプライマーを合成した。各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＰＣＡＡ−ＸＢ：５'−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＡ−３'（配列番号９）
ＰＣＡＴＮ−Ｒ：５'−ＴＴＧＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＧＧＣＣＣＡＴＡＧＧＣＧＴＣＴ−３'（配列番号１０）
【００３６】
また、ｐＢＩ１２１を鋳型としてＴNOSを得るためのプライマー合成を行った。各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＰＣＡＴＮ−Ｆ：５'−ＡＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡ−３'（配列番号１１）
ＰＴＮＯＳ−ＢＡ：５'−ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣ−３'（配列番号１２）
【００３７】
実施例１（１）と同様の方法でＰＣＲを行い、XbaI-carAa及びTNOS-BamHI断片を得た。さらに両断片を連結するために、アガロースゲル電気泳動で精製した各断片とプライマーであるＰＣＡＡ−ＸＢ（配列番号９）及びＰＴＮＯＳ−ＢＡ（配列番号１２）を混ぜ、ＰＣＲを行った。反応は初期変性として９４℃で２分、増幅反応は９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を３０サイクル、最終伸長処理として６８℃で５分行った。得られたXbaI-carAa-TNOS-BamHI断片をXbaIとBamHIで消化し、ｃａｒＡａ−ＴNOSインサート断片を得た。次いで、大腸菌のクローニング用ベクターであるｐＵＣ１９をXbaIとBamHIで消化し、上記インサート断片を挿入した。得られたプラスミドベクターをｐＵＣＣＡＴＮと命名した（図３）。
【００３８】
（２）ｃａｒＡａ−ＴNOS−ＰEF1A−ｃａｒＡｃを挿入したプラスミドｐＵＣＣＡＣの作製
初めにＰEF1A−ｃａｒＡｃインサートを調製した。まず、ＰEF1A遺伝子を含む領域断片を得るために、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記と同様の方法でＰＣＲを行った。用いたプライマー以下の通りである。
ＥＦ−Ｆ００５４：５'−ＣＧＣＣＣＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣ−３'（配列番号１３）
ＥＦ−Ｒ１９５７：５'−ＡＡＧＣＡＡＧＴＡＧＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣ−３'（配列番号１４）
【００３９】
次いで、得られたＰEF1A遺伝子を含む領域断片を鋳型として、ＢａｍＨＩ−ＰEF1A断片を得るために、上記（１）と同様の方法でＰＣＲを行った。用いたプライマーは以下の通りである。
ＰＥＦ１Ａ−ＢＡ：５'−ＡＴＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣ−３'（配列番号１５）
ＰＥＦＣＣ−Ｒ：５'−ＴＴＣＡＡＣＣＡＡＡＴＴＴＧＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡ−３'（配列番号１６）
【００４０】
さらに、ｃａｒＡｃ−ＳａｃＩ断片を得るためにｐＵＣＡ１を鋳型としてＰＣＲを行った。用いたプライマーは以下の通りである。
ＰＥＦＣＣ−Ｆ：５'−ＴＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡ−３'（配列番号１７）
ＰＣＡＣ−ＳＡ：５'−ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴ−３'（配列番号１８）
【００４１】
上記で得られたBamHI-PEF1A断片及びcarAc-SacI断片を連結した。アガロースゲル電気泳動で精製したBamHI-PEF1A断片及びcarAc-SacI断片とプライマーであるＰＥＦ１Ａ−ＳＡ（配列番号８）及びＰＣＡＣ−ＳＡ（配列番号１８）を混ぜ、上記（１）と同様な方法でＰＣＲを行い、BamHI-PEF1A-carAc-SacI断片を得た。
【００４２】
次ぎに、BamHI-PEF1A-carAc-SacI断片を先に得たプラスミドｐＵＣＣＡＴＮに挿入した。すなわちまずBamHI-PEF1A-carAc-SacI断片をBamHIとSacIで消化し、ＰEF1A−ｃａｒＡｃインサートを得た。次いで、ｐＵＣＣＡＴＮをBamHIとSacIで消化し、アルカリフォスファターゼで５'末端を脱リン酸化した後に、上記のＰEF1A−ｃａｒＡｃインサートを挿入した。得られたプラスミドをｐＵＣＣＡＣと命名した（図４）。
【００４３】
（３）ｃａｒＡａ−ＴNOS−ＰEF1A−ｃａｒＡｃを挿入した植物発現用プラスミドの作製
プラスミドｐＵＣＣＡＣを制限酵素PshBIで３７℃、３時間消化した後、QIAquick gel extractionキット(QIAGEN)で制限酵素を除去し、ＤＮＡ断片混合物を得た。このＤＮＡ断片混合物をさらにXbarIとSacIで処理し、アガロースゲル電気泳動で精製することによりｃａｒＡａ−ＴNOS−ＰEF1A−ｃａｒＡｃインサート断片を得た。次いで、植物用発現ベクターであるｐＳＭＡＢ７０４をXbarIとSacIで消化してＧＵＳ遺伝子を除去し、アルカリフォスファターゼで５｀末端を脱リン酸化した後に、上記ｃａｒＡａ−ＴNOS−ＰEF1A−ｃａｒＡｃインサート断片を挿入した。得られたプラスミドベクターをｐＳＭＡＢＣＡＣと命名した（図５）。
【００４４】
（４）ヒマワリへの導入
凍結法にてｐＳＭＡＢＣＡＣを導入したAgrobacterium tumefaciens ＬＢＡ４４０４株を用いて、子葉の共存培養法にてヒマワリを形質転換した。まず、ｐＳＭＡＢＣＡＣを保持したAgrobacterium tumefaciens ＬＢＡ４４０４株の菌体濃度が１０8個／ｍＬになるように２０ｍＬの懸濁培地（Murashige & Skoog培地、50mM KNO3, 1mM m-イノシトール, 4.44μM BAP, 0.5g/Lカザミノ酸, 17.66μM AgNO3, 101,9μM アセトシリンゴン、3% ショ糖, pH5.8）に懸濁した。次ぎに、種子を滅菌し、発芽２日目のヒマワリの葉柄部を切り取り、子葉を得、さらに基部と末端部に分けた。基部を前記懸濁培地に３０分間浸漬し、その後、ろ紙で余分な培地を拭き取り、前培養培地（Murashige & Skoog培地、50mM KNO3, 1mM m-イノシトール, 4.44μM BAP, 2.69μM NAA, 0.5g/Lカザミノ酸, 17.66μM AgNO3, 101,9μM アセトシリンゴン、3% ショ糖, 0.8% 寒天、pH5.8）に葉柄部を挿しこみ、ペーパータオルで容器を覆って共存培養した。３〜４日後、子葉を取りだし、１錠／Ｌ オーグメンチンＳ錠（グラクソ・スミスクライン）を含む１００ｍｌの洗浄培地（Murashige & Skoog培地、1mM m-イノシトール, 4.44μM BAP, 0.5g/Lカザミノ酸, 3% ショ糖, pH5.8）に入れ、25℃暗条件下で1時間振とうした。この操作を3回繰り返した後、子葉をろ紙で拭き取り、向軸側を上にして分化培地（Murashige & Skoog培地、1mM m-イノシトール, 4.44μM BAP, 0.27μM NAA, 0.5g/Lカザミノ酸, 17.66μM AgNO3, 1錠/L オーグメンチンS錠、3% ショ糖, 0.8% 寒天, pH5.8）に置床し、シュートの分化を促した(Plant Cell Tiss. Org. Cult. 58:39, 1999)。子葉から分化したシュートを切り取り、３ｐｐｍのグルホシネートを含む発根培地(1/2 Murashige & Skoog培地, 2.85μM IAA, 3% ショ糖, 0.8% 寒天, pH5.8）に挿し込み、形質転換体を選抜した。培養はグロースチャンバー（１４ｈ明／１０ｈ暗、温度２３℃、湿度５０％、照度１．６ｘ１０4ｌｘ）内で行った。
【００４５】
(5)カルス誘導
選抜個体からカルスを誘導した。まず、5mm角に切った形質転換体の葉をカルス誘導培地（Murashige & Skoog培地、2.22μM BAP, 1.14μM NAA, 1錠/L オーグメンチンS錠、3% ショ糖, 0.8% 寒天, pH5.8）に置床し、カルスを誘導した。誘導したカルスを２ｐｐｍのグルホシネートを含む上記培地に移植し、さらに選抜を行った。野生型より誘導したカルスを比較対照とした。カルスを粉砕し、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で抽出した総タンパクを試料とし、マウス抗ＣａｒＡａポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブロッティングを行った結果、ターミナルオキシゲナーゼの生成が確認された。また、カルスの一部を取り、RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)でRNAを抽出し、ＤＩＧ標識したｃａｒＡｃ ＤＮＡ断片を用いてノーザン・ハイブリダイゼーションを行った結果、フェレドキシンが発現していることを確認した。
【実施例４】
【００４６】
［形質転換ヒマワリカルスによるフェナントレンの代謝］
グルホシネートで選抜したカルスを液体培地（Murashige & Skoog培地、2.22μM BAP,1.14μM NAA,3% ショ糖,pH5.8）に移し、振とう速度８０ｒｐｍで２５℃暗条件にて６週間培養した。その間、１０日ごとに新しい培地に交換した。
【００４７】
液体培養したカルスを漏斗でろ過し、新鮮重として２ｇを取り、１．８ｐｐｍのフェナントレンを含む２５ｍｌの液体培地（０．０５％ ＤＭＳＯ，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８５を含む）に入れ、５日間振とう培養した。培地から一定量を取り、遠心後同量のアセトニトリルを加えてＨＰＬＣにてフェナントレンを定量した。また、カルスは漏斗でろ過し、十分洗浄した後２０ｍｌのメタノールを加えてワーレンブレンダーでホモジェネートし、さらに遠心して上澄み液中のフェナントレンをＨＰＬＣで定量した。野生型を対照とし、野生型カルス及び培地中に残存するフェナントレンに対する形質転換体のカルス及び培地に残存する割合を表２に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
上記の結果から、Pseudomonas resinovorans CA10由来のターミナルオキシゲナーゼ(carAa)及びフェレドキシン(carAc)の２遺伝子を同時に導入したヒマワリにおいて、カルバゾール1,9a-ジオキシゲナーゼが機能することを明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】プラスミッドｐＢＩｃａｒＡａの構造を示す図である。
【図２】プラスミッドｐＳＭＡＢｃａｒＡｃの構造を示す図である。
【図３】プラスミドpUCCATNの構造を示す図である。
【図４】プラスミドpUCCACの構造を示す図である。
【図５】プラスミドpSMABCACの構造を示す図である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００００４３０７
【氏名又は名称】日本曹達株式会社
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| 【出願日】 |
平成１６年３月１１日（２００４．３．１１） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１００１０７９８４
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
【識別番号】１００１０２２５５
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
【識別番号】１００１１８９５７
【弁理士】
【氏名又は名称】岡 晴子
【識別番号】１００１２３１６８
【弁理士】
【氏名又は名称】大▲高▼ とし子
【識別番号】１００１２００８６
【弁理士】
【氏名又は名称】▲高▼津 一也
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| 【公開番号】 |
特開２００５−２５３３６６（Ｐ２００５−２５３３６６Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１７年９月２２日（２００５．９．２２） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−６９５９９（Ｐ２００４−６９５９９） |
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