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【発明の名称】 タンニン含量が低減された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用
【発明者】 【氏名】高木 優

【氏名】平津 圭一郎

【氏名】松井 恭子
【要約】 【課題】タンニン含量が低減された植物体の生産方法を提供する。

【解決手段】フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素の遺伝子発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質がタンニンの合成系に関与する遺伝子の発現を抑制し、タンニン含量が低減された植物体が生産される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体のタンニン含量を低減させるために、
フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、タンニンの生産を抑制することを特徴とするタンニン含量が低減された植物体の生産方法。
【請求項２】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の植物体の生産方法。
【請求項３】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の植物体の生産方法。
【請求項４】
上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
【請求項５】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項２または３に記載の植物体の生産方法。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【請求項６】
上記転写因子が、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ｅ）配列番号１４５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｆ）配列番号１４５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
【請求項７】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項２または３に記載の植物体の生産方法。
（ｇ）配列番号１４６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｈ）配列番号１４６に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｉ）又は（ｊ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ｉ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｊ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１３】
上記機能性ペプチドが、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、１３４、１３５又は１３６に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１４】
上記機能性ペプチドが、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、タンニン含量が低減された植物体。
【請求項１６】
植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１５に記載の植物体。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体のタンニン含量低減キット。
【請求項１８】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１７に記載の植物体のタンニン含量低減キット。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンニン含量が低減された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものであり、特にタンニンの合成系に関与する遺伝子の転写を抑制することによるタンニン含量が低減された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、植物において、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素の遺伝子発現を促進する転写因子としてシロイヌナズナのＰＡＰ１（Production of Anthocyanin Pigment１）タンパク質が知られている。ＰＡＰ１タンパク質が過剰発現されると、フェニルプロパノイドの合成系に関与するカルコン合成酵素（ＣＨＳ）、ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、フェニルアラニンアンモニア−リラーゼ（ＰＡＬ）等の発現を促進し、植物中のアントシアニン、ヒドロキシケイ皮酸、リグニンの濃度が増加することが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００３】
また、植物において、タンニンの合成系に関与する酵素の遺伝子発現を制御する転写因子としてシロイヌナズナのＴＴ２(TRANSPARENT TESTA2)タンパク質が知られている。ＴＴ２タンパク質が過剰発現されると、シロイヌナズナの発芽１０日目の植物の根においてフェニルプロパノイド合成系に関与するジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、アントシアニジン還元酵素、別名バンユラス（ＢＡＮ）の発現が促進されることが報告されている（非特許文献８）。バンユラス（ＢＡＮ）は、プロアントシアニジンの生合成において核となる酵素であり、ＴＴ２の遺伝子に変異が生じると、バンユラス（ＢＡＮ）のプロモーター活性が失われることが知られている（非特許文献９）。
【０００４】
ここで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献１、２参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【０００５】
さらに本発明者は、上記ＰＡＰ１タンパク質と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）を植物体内で発現させ、転写因子であるＰＡＰ１タンパク質を転写抑制因子に転換し、アントシアニンの蓄積を抑制することに成功している。具体的には、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＰＡＰ１タンパク質をコードする遺伝子に結合してキメラ遺伝子を構築し、このキメラ遺伝子をベクターに組み込んで植物体に導入した。該キメラ遺伝子を発現した植物体を、ストレスを与える条件である３％のショ糖存在下で生育させると、野生型では観察されるアントシアニンの特徴を示す赤紫色の色素の蓄積が起こらないことが確認された（例えば、特許文献７参照）。
【０００６】
ところで、植物ポリフェノールの一種としてタンニンが知られている。このタンニンは植物界において広く存在する物質であり、縮合型と加水分解型に区分される。このうち縮合型タンニンはフラボノイド重合体であるため、フェニルプロパノイド代謝産物であるが、正確な合成経路についてはよくわかっていない。
【０００７】
タンニンは古くから皮なめしに用いられる等の有用性が知られており、近年ではその抗酸化作用も注目されている。しかしながらタンニンを植物体に含まれる成分として見ると、食害防護機能を発揮する成分という一面を有している。具体的には、タンニンを含む植物を食べた動物は、タンニンの有する収斂性の不愉快な味である「渋味」を感じるが、それだけではなく、植物タンパク質がタンニンと結合して消化できなくなったり、胃腸内酵素とタンニンとが反応したりする可能性がある。それゆえ、例えば、タンニンを多く含む植物は飼料効果がよくないという報告がある（例えば、非特許文献４、５、６、７参照）。
【０００８】
同様の理由から、茶（特に緑茶）のタンニンは生体の細胞や組織あるいは酵素を変性するため体の弱い人にはよくないとされている。さらに、緑茶、果実酒などにおいては、渋みの原因となったり、酸化褐変により外観や風味を損なう原因となったりする。さらに、木材においても、タンニンは、変色やシミの原因となる。
【０００９】
このように、植物体そのものを利用する用途では、当該植物体におけるタンニンの含量は少ない方が好ましい。したがって、タンニンの合成を抑制することによって、植物体のタンニン含量を低減できれば、これらの問題を解消することができる。このようにタンニン含量を低減することが利点となる領域は多い。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】Ohta,M.,Matsui,K.,Hiratsu,K.,Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M.,The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001
【非特許文献２】Hiratsu,K.,Ohta,M.,Matsui,K.,Ohme-Takagi,M.,FEBS Letters 514(2002)351-354
【非特許文献３】J.O.Borevitz, Y.Xia, J.Blount, R.A.Dixon, C.Lamb, Activation Tagging Identifies a Conserved MYB Regulator of Phenylpropanoid Biosynthesis
【非特許文献４】Hassan IA,Elzubeir EA,El Tinay AH,Growth and apparent absorption of minerals in broiler chicks fed diets with low or high tannin contents,Trop Anim Health Prod.2003 Apr;35(2):189-96
【非特許文献５】Van der Poel AF,Dellaert LM,Van Norel A,Helsper JP,The digestibility in piglets of faba bean as affected by breeding towards the absence of condensed tannins,Br J Nutr.1992 Nov;68(3):793-800
【非特許文献６】Sarwar,G.et al.,1981,Nutritional evaluation of meals and meal fractions derived from rape and mustard seed,Canadian Journal of Animal Science 61,719-733
【非特許文献７】Simbaya,J.et al.,1995,Quality characteristics of yellow-seeded Brassica seed meals:protein, carbohydrates, and dietary fiber components,Journal of agricultural and Food Chemistry 43,2062-2066
【非特許文献８】Nathalie Nesi, Clarisse Jond, Isabelle Debeaujon, Michel Caboche, and Loic lepiniec.,The Plant Cell, 13, 2099-2114, 2001
【非特許文献９】Debeaujon I, Nesi N, Perez P, Devic M, Grandjean O, Caboche M, Lepiniec L, Plant Cell，15，2514-2531. 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように、タンニン含量が低減された植物体を得ることができれば非常に有用である。しかしながら、従来の技術では、タンニン含量が低減された植物体を生産することはできないという問題を生じる。
【００１１】
すなわち、上述のように、ＰＡＰ１タンパク質の過剰発現植物体においてＣＨＳ等の遺伝子の発現が促進されることや、ＴＴ２タンパク質の過剰発現植物体においてＤＦＲ等の遺伝子の発現が促進されることは報告されているが、タンニンの合成が促進されたとの報告はないため、タンニン合成経路のうちどの反応を抑制すればタンニンの合成を抑制することができるのかは明らかではない。また、従来、タンニンの合成系に関与する遺伝子の転写を抑制することによってタンニンの含量を低減する技術については知られていなかった。したがって、タンニン含量が低減された植物体を生産することは不可能であった。
【００１２】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、タンニンの合成系に関与する遺伝子の転写を抑制することによって、タンニン含量が低減された植物体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＰＡＰ１タンパク質を転写抑制因子に転換することによって、アントシアニン合成ばかりでなく、タンニン合成をも抑制することができ、ＰＡＰ１がタンニンの合成系にも関与する転写因子であることを初めて明らかにした。また、ＴＴ２タンパク質を転写抑制因子に転換することによって、タンニン合成を抑制することができることから、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明にかかるタンニン含量が低減された植物体の生産方法は、上記課題を解決すべく、植物体のタンニン含量を低減させるために、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、タンニンの生産を抑制することを特徴としている。
【００１５】
上記構成によれば、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、タンニン合成系に関与すると推定される標的遺伝子に結合することにより、上記転写因子を転写抑制因子に転換することができ、植物体内では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。したがって、タンニン合成系の最終物質であるタンニンの生成が減少し、その結果、得られる植物体のタンニン含量を低減することができる。
【００１６】
また、上記生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいてもよい。
【００１７】
また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００１８】
上記構成によれば、上記機能性ペプチドが付加されたカセットベクターに上記転写因子の遺伝子を組み込み、植物細胞に導入するだけで、上記キメラタンパク質を植物細胞内で発現させることができ、上記キメラタンパク質により転写因子の標的遺伝子の転写を容易に抑制することができる。したがって、得られる植物体のタンニン含量を低減することができる。
【００１９】
上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴としている。（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
【００２０】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【００２１】
また、上記転写因子は、以下の（ｅ）または（ｆ）記載のタンパク質であることを特徴としている。（ｅ）配列番号１４５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｆ）配列番号１４５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
【００２２】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｇ）又は（ｈ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｇ）配列番号１４６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｈ）配列番号１４６に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【００２３】
上記構成によれば、上記転写因子は、上記機能性ペプチドにより転写抑制因子に転換され、上記転写因子の標的遺伝子の転写が抑制される。したがって、効率よくタンニン含量が低減された植物体を得ることができる。
【００２４】
上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００２５】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることが好ましい。
【００２６】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｉ）又は（ｊ）記載のペプチドであってもよい。（ｉ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｊ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【００２７】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２８】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２９】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、１３４、１３５又は１３６に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００３０】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであってもよい。
【００３１】
上記機能性ペプチドは、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、上記転写因子の標的遺伝子であるタンニン合成に関与する遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。
【００３２】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、タンニン含量が低減されていることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００３３】
上記植物体には、上述のように、成育した植物個体や植物細胞、種子等、様々な形態のものが含まれ、いずれも野生型の植物体に比べてタンニン含量が低減されていると考えられる。したがって、農業や林業等の種々の分野において、タンニン含量が低減された植物体を所望の形態によって利用することが可能となる。
【００３４】
また、本発明にかかる植物体のタンニン含量低減キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記タンニン含量低減キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【００３５】
上記タンニン含量低減キットは、本発明に係る植物体の生産方法を実施するために必要な構成を予め備えているので、上記生産方法を容易に実施することができる。したがって、上記タンニン含量低減キットによれば、タンニン含量が低減された植物体を効率的に得ることができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明に係る植物体の生産方法は、以上のように、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させる構成を備えている。該キメラタンパク質は、タンニンの合成系に関与する遺伝子の転写を抑制することができる。それゆえ、本発明に係る植物体の生産方法は、得られる植物体のタンニン含量を低減することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
本発明は、植物体のタンニン含量を低減させる技術であって、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させる。これによって得られる植物体では、タンニンの生産が抑制されるため、タンニン含量が低減された植物体を生産することができる。
【００３９】
ここで、タンニンの生産は次のように抑制される。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、タンニン合成系に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。上記転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これによりタンニン合成系の最終物質であるタンニンの生成が減少し、その結果、得られる植物体のタンニン含量を低減することができる。
【００４０】
上述したように、ＰＡＰ１タンパク質の過剰発現植物体において、ＰＡＬ、ＣＨＳ、ＤＦＲの遺伝子の発現が促進されアントシアニン、ヒドロキシケイ皮酸、リグニンの濃度が増加することが報告されている。図４（ａ）は、フェニルプロパノイド代謝産物の概観図で、ＰＡＰ１転写因子がＰＡＬ、ＣＨＳ、ＤＦＲの遺伝子発現を促進し、これによりアントシアニンの合成が促進される経路を太線で示している。しかし、フェニルプロパノイド合成初期のステップにかかわる酵素発現の増強があるにもかかわらずその下流に位置するタンニン（縮合型タンニン、図中Condensed tanninsと記載）合成が促進されたという報告はない。このことから、タンニン合成経路においてＰＡＰ１タンパク質以外の特有の調節因子が存在することが示唆される。
【００４１】
また、上述したように、ＴＴ２タンパク質が過剰発現されると、シロイヌナズナ発芽１０日目の植物の根においてフェニルプロパノイド合成系に関与するジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、アントシアニジン還元酵素、別名バンユラス（ＢＡＮ）の発現が促進されることが報告されている。
【００４２】
しかし、アントシアニンおよびタンニン（縮合型タンニン、図中Condensed tanninsと記載）の合成が促進されたという報告はない（非特許文献８）。このことから、タンニン合成経路においてＴＴ２タンパク質以外の特有の調節因子が存在することが示唆される。
【００４３】
一般的に、植物の二次代謝物質を遺伝子操作を用いて増強または低減させようとする場合、期待どおりの効果を得ることが難しいことが知られている（PNAS 2001,vol.19,367-372）。その理由として遺伝子操作の対象となる酵素および制御因子にアイソザイムや重複因子が存在していることや、別の代謝経路（バイパスの存在）にて補足されてしまうことが挙げられる。
【００４４】
したがって、アントシアニン生合成、タンニン生合成にはそれぞれの経路に特異的な制御因子が存在し、かつ重複因子の存在が推定されるため、ＰＡＰ１タンパク質またはＴＴ２タンパク質が促進する転写を抑制するのみでは、タンニンの生産を抑制することは通常困難である。本発明にかかる方法では、上記機能性タンパク質をＰＡＰ１タンパク質またはＴＴ２タンパク質と融合させることにより、かかる困難性を克服することに成功した。
【００４５】
すなわち、ＰＡＰ１タンパク質と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質は、アントシアニンおよびタンニンの２つの生合成経路を同時に抑制することができた。また、ＴＴ２タンパク質と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質は、少なくともタンニンの生合成経路を抑制することができた。
【００４６】
以降の説明では、本発明にかかるタンニン含量が低減された植物体（説明の便宜上、タンニン低減植物体と称する）の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。
【００４７】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。そこで、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００４８】
（Ｉ−１）フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素の遺伝子発現を促進する転写因子であれば特に限定されるものではない。フェニルプロパノイドの合成系は植物界で広く保存されているため、かかる転写因子は多くの植物に保存されている。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有するタンパク質が含まれる。中でも上記転写因子は、アントシアニン合成を促進するＭＹＢ様構造を有する転写因子であることがより好ましい。
【００４９】
このような転写因子としては、例えば、ＰＡＰ１タンパク質、ＰＡＰ２タンパク質、ＴＴ２タンパク質、ＡＮ２タンパク質、Ｃ１タンパク質、Ｐ１タンパク質、Ｐタンパク質、ＧＬ１タンパク質、Ｍｉｘｔａタンパク質等を挙げることができるが特に限定されるものではない。
【００５０】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、ＰＡＰ１タンパク質やＴＴ２タンパク質を挙げることができる。ＰＡＰ１タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、上述したように、フェニルプロパノイドの合成系に関与するカルコン合成酵素（ＣＨＳ）、ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、フェニルアラニンアンモニア−リラーゼ（ＰＡＬ）等の発現を促進することが知られている。また、ＴＴ２タンパク質は、配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、ＴＴ２のヌル突然変異体では、ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ（ＬＤＯＸ）、アントシアニジン還元酵素（ＢＡＮ）およびＴＴ２の発現が抑制されることが知られている。
【００５１】
本発明では、例えば、このＰＡＰ１タンパク質やＴＴ２タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＰＡＰ１タンパク質やＴＴ２タンパク質を転写抑制因子に転換させる。
【００５２】
本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＰＡＰ１タンパク質や配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するＴＴ２タンパク質に限定されるものではなく、フェニルプロパノイドの合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を促進する機能を有する転写因子であればよい。具体的には、例えば配列番号１または１４５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。
【００５３】
なお、上記の「配列番号１または１４５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５４】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産させる際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００５５】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＰＡＰ１タンパク質を用いる場合には、このＰＡＰ１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＰＡＰ１遺伝子と称する）を挙げることができる。ＰＡＰ１遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５６】
また、他の具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＴＴ２タンパク質を用いる場合には、このＴＴ２タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＴＴ２遺伝子と称する）を挙げることができる。ＴＴ２遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号１４６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５７】
もちろん、本発明で用いられるＰＡＰ１遺伝子、ＴＴ２遺伝子、または、転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号２に示される塩基配列や配列番号１４６に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号２または配列番号１４６に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００５８】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００５９】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００６０】
（Ｉ−２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７、非特許文献１・２等参照）を挙げることができる。
【００６１】
本発明者は、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子およびこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献１〜４参照）。
【００６２】
また、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献６参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００６３】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００６４】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００６５】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６６】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６７】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６８】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４０、４１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列である。
【００６９】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７０】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００７１】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７２】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４２、４３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４４に示す。
【００７３】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００７４】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７５】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
【００７６】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００７７】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４５〜５３に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４５、４６または４７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４８、４９または５０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５１、５２または５３に示すアミノ酸配列である。
【００７８】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５４に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５４に示すアミノ酸配列である。
【００７９】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００８０】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するぺプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００８１】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｉ）又は（ｊ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｉ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｊ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００８２】
上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００８３】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて変異が導入される。
【００８４】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００８５】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００８６】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００８７】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００８８】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、１３４、１３５又は１３６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２９、３０、３２、３４、１３３、１３４、１３５又は１３６のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６又は３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１、又は３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３又は２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００８９】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３８または３９で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００９０】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００９１】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（２）の項で詳細に説明する。
【００９２】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００９３】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３７、１３９、１４１又は１４３に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３８、１４０、１４２、１４４に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜３９、１３３〜１３６に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００９４】
【表１】


【００９５】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００９６】
（ＩＩ）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、タンニンの生産を抑制させる過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００９７】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００９８】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００９９】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【０１００】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【０１０１】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【０１０２】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【０１０３】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【０１０４】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【０１０５】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【０１０６】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１０７】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１０８】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１０９】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１１０】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。
【０１１１】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１１２】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１１３】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１１４】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１１５】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの、または任意の器官や組織に含まれるタンニン含量から選抜してもよい。例えば、タンニン含量から選抜する例としては、形質転換体の種子の色を、形質転換していない植物体の種子の色と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。特に種子にはタンニンが多く含有されるため、単に種子の色を比較するだけでも選抜が可能になるとともに、タンニン含量の低減という本発明の効果そのものも確認することができる。
【０１１６】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖によりタンニン含量が低減された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１１７】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体とみなす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１１８】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記キメラタンパク質そのものを植物体に投与してもよい。この場合、最終的に利用する植物体の部位においてタンニン含量を低減できるように、若年期の植物体にキメラタンパク質を投与すればよい。またキメラタンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。
【０１１９】
（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、タンニン合成系に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これによりタンニン合成系の最終物質であるタンニンの生成が減少し、その結果、得られる植物体のタンニン含量を低減することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１２０】
（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかるタンニン含量が低減された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、タンニン含量の低減によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。裸子植物としては、例えば、スギ目のスギ科、マツ科、ヒノキ科の植物やマキ科の植物を挙げることができる。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科、マメ科、チャ等のツバキ科等の植物を挙げることができる。また、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ムギ等のイネ科、ホシクサ科等の植物を挙げることができる。
【０１２１】
（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明では、植物体のタンニン含量を低減することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、低タンニンにより効果がある分野であればよいが、例えば、家畜飼料への応用、食品への応用、木材への応用等を挙げることができる。
【０１２２】
まず、家畜飼料への応用例について説明すると、例えば、低タンニン、無タンニンソルガム（ソルガム、ホワイトソルガム）代用飼料がある。これらは高タンニンソルガムに比べて、飼料効果が非常によく、例えば、低タンニンソルガムを与えられたブロイラーは、高タンニンのものを与えられた場合と比べ、顕著に成長が速くＣａ、Ｐ等のミネラル分の吸収がよいという報告がある（非特許文献４参照）。ソルガムはモロコシ類の植物で、低タンニン、無タンニンのものはコーンとほぼ同等の飼料効果をもっているとされている。主要な生産国は米国、アルゼンチン、豪州等であるが、特に豪州産は低タンニン、高蛋白で評価が高い。本発明はソルガムの低タンニン、無タンニン化に利用できると考えられる。なお、ソルガムは、一般的には飼料用が圧倒的であるが、近年の製粉技術向上により、パン・ケーキ用粉の加工や、澱粉、シロップ、アルコールといった食品分への応用技術も考えられている。
【０１２３】
また、子豚に低タンニンのソラマメを与えた場合、高タンニンのものと比べ、消化性がよいことが報告されている（非特許文献５参照）。その他にも、反芻動物以外の家畜およびヒトが、種子食品を飼料や栄養学的サプリメントとして利用する場合、収斂性の味、食品の褪色、タンパク質と反応して消化できない物質を作ること等、タンニンの好ましくない有害作用が認められることが報告されている（非特許文献６、７参照）。多種にわたる種子食品のタンニンの含量を低減させることができれば、例えばアブラナのような種子食品が、反芻動物以外の家畜の飼料や、ヒトのグルテンを含まない栄養サプリメントに利用可能となり、大豆と市場での有用性を競う存在となると考えられる。
【０１２４】
さらに、草食動物の食餌としても、タンニン含量を低減した植物を使う利点は大きい。タンニンを含む植物は、草食動物の食餌としては好ましくない。すなわち、食餌の植物タンパク質はタンニンと結合するため消化できなくなり、栄養源として役立たなくなる。またタンニンは草食動物の胃腸内消化酵素と反応する可能性がある。本技術は、飼料として用いる植物のタンニン含量の低減に利用できる。
【０１２５】
次に、食品への応用例について説明すると、例えば、タンニン含量が低減された緑茶、煎茶、紅茶、コーヒー等を挙げることができる。胃の弱い人には、緑茶、煎茶をあまり勧められないのはよく知られているが、それは茶（とくに緑茶）のタンニンが生体の細胞や組織、あるいは酵素を変成するためと考えられている。ちなみに、ヒトや動物の細胞を試験管の中で培養しそれにお茶を加えると、その細胞は直ちに死滅するとの報告もある。したがって、虚弱体質並びに妊婦、子供等に対しての緑茶、煎茶および紅茶に本技術が利用できると考えられる。
【０１２６】
さらに、緑茶、果実酒などにおいては、タンニンは渋みの原因となったり、酸化褐変により外観や風味を損なったりする原因ともなる。特にペットボトル飲料や瓶詰めの果実酒等においては、これらの問題を解決するためにタンニンの含量を低減することが望まれている。本発明はかかる領域においても利用できると考えられる。
【０１２７】
次に、木材への応用例について説明すると、例えば、建築用として多用されているレッドウッドやレッドシダーへの応用を挙げることができる。これら木材は高い耐久性や美しい木目の仕上がりから需要が大きいが、短所としてタンニン質が強い為、変色（主に黒色）しやすく、タンニン成分がシミになりやすいと言われている。本発明を用いれば、これら木材の長所を保ちつつ短所を改善することが可能になり、木材の品質改良にも利用が可能となる。
【０１２８】
（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわちタンニン含量低減キットを挙げることができる。
【０１２９】
このタンニン含量低減キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１３０】
以下、本発明を実施例及び図１、２に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１３１】
以下の実施例においては、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドを、ＰＡＰ１遺伝子またはＴＴ２遺伝子と結合し、さらに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで、組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１３２】
（１）植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
クローンテック社製（Clontech 社、USA）のプラスミドｐ３５Ｓ−ＧＦＰを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨIで切断し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し回収した。
【０１３３】
米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ−ＨＹＧ（Becker, D. 1990 Nucleic Acid Research, 18:203）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳｓｔIとで切断し、アガロースゲル電気泳動によってＧＵＳ遺伝子を除いたＤＮＡ断片を得た。
【０１３４】
以下の配列を有するＤＮＡを合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。このＤＮＡ断片は、５’末端から、ＢａｍＨI制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、制限酵素部位ＳｍａI、および制限酵素部位ＳａｌIとＳｓｔＩとをこの順に有する。
5'-GATCCACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACAGATCCCGGGGGTACCGTCGACGAGCT-3'（配列番号５９）
5'-CGTCGACGGTACCCCCGGGATCTGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTG-3'（配列番号６０）
次に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター領域を含むＤＮＡ断片と、合成した２本鎖ＤＮＡとを、ＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ−ＨＹＧのＨｉｎｄIII、ＳｓｔI部位に挿入し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ２を得た。
【０１３５】
（２）組換え発現ベクターｐＰＡＰ１ＳＲＤＸまたはｐＴＴ２ＳＲＤＸの構築
＜ＰＡＰ１ｃＤＮＡの単離＞
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて終止コドンを除くＰＡＰ１のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅し、アガロース電気泳動により分離し回収した。ＰＣＲの条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして２５サイクル行った。
5’プライマー
5’-AAAATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGG-3’（配列番号５７）
3’プライマー
5’-ATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCGAAAAGACTC-3’（配列番号５８）
ＰＡＰ１遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および１に示す。
＜ＴＴ２ｃＤＮＡの単離＞
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて終止コドンを除くＴＴ２のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅し、アガロース電気泳動により分離し回収した。ＰＣＲの条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして２５サイクル行った。
5’プライマー
5’- GATGGGAAAGAGAGCAACTACTAGTGTGAG -3’（配列番号１４７）
3’プライマー
5’- ACAAGTGAAGTCTCGGAGCCAATCTTCATC -3’（配列番号１４８）
ＴＴ２遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４６および１４５に示す。
【０１３６】
＜転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードするポリヌクレオチドの合成＞
１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5’-CTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAAG-3’（配列番号５５）
5’-CTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAG-3’（配列場号５６）
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記で得たＰＡＰ１遺伝子またはＴＴ２遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むＤＮＡ断片と転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸのコード領域を含むＤＮＡ断片とを、制限酵素ＳｍａIで切断した上記ｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、組換え組換え発現ベクターであるプラスミドｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸを得た。図１（ａ）にｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸの構造を示し、図１（ｂ）にｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸの構造を示した。
【０１３７】
（３）組換え発現ベクターｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸまたはｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸにより形質転換した植物体の作成
ｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸまたはｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸによるシロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。ｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸまたはｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸを、土壌細菌Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58C1Rifr) pMP90 (Gmr)(koncz and Schell 1986)株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、下表２）に懸濁した。
【０１３８】
【表２】


【０１３９】
この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び生育させて結種させた。回収した種子を５０％ブリーチ、０．０２％Triton X-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
【０１４０】
【表３】


【０１４１】
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体を選抜し、土壌に植え替え次世代の種子を得た。ｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換された植物体の種子を図２（ｂ）、（ｃ）に、野生型の植物体の種子を図２（ａ）に示し、ｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸで形質転換された植物体の種子を図３（ｂ）に、野生型の植物体の種子を図３（ａ）に示した。
【０１４２】
図２（ａ）に示すように野生型の種子はタンニンの蓄積を示す濃い褐色であるが、図２（ｂ）および（ｃ）に示すようにｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換された植物体の種子は白色を示した。同様に、図３（ａ）に示すように野生型の種子はタンニンの蓄積を示す濃い褐色であるが、図３（ｂ）に示すように、ｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸで形質転換された植物体の種子は白色を示した。このことから、形質転換された植物体ではタンニン含量が著しく低減されていることが確認された。
【０１４３】
ＰＡＰ１転写因子およびＴＴ２転写因子は、フェニルプロパノイド合成系に関与する酵素の遺伝子発現を促進する転写因子である。ｐ３５Ｓ::ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナ植物体では、アントシアニン合成ばかりでなく、タンニンの合成も抑制されされたことから、ＰＡＰ１がタンニンの合成系にも関与する転写因子であることが初めて明らかになった。また、ｐ３５Ｓ::ＴＴ２ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナの植物体では、タンニンの合成を抑制することができた。
【０１４４】
このことは、ＰＡＰ１転写因子遺伝子またはＴＴ２転写因子遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を用いた遺伝子発現抑制システムが、タンニンの合成抑制にも利用できることを示している。
【０１４５】
すなわち、図４（ａ）に示すように、ＰＡＰ１転写因子はフェニルプロパノイド合成系に関与する酵素ＰＡＬ、ＣＨＳ、ＤＦＲの遺伝子発現を促進し、これによりアントシアニンの合成は促進される。これに対して、このＰＡＰ１転写因子を転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸと融合させたキメラタンパク質ＰＡＰ１ＳＲＤＸは、図４（ｂ）に示すように、ＰＡＬ、ＣＨＳ、ＤＦＲのみならず、フェニルプロパノイド合成に関与する遺伝子の発現を抑制し、これにより、アントシアニンばかりでなくタンニンの合成も抑制される。
【０１４６】
また、上述のように、ＴＴ２転写因子の過剰発現植物体ではＤＦＲおよびＢＡＮの遺伝子発現が促進されることが報告されている。しかしながら、上述のように、タンニン生合成には、それぞれの経路に特異的な制御因子が存在し、かつ重複因子の存在が推定されるため、ＴＴ２タンパク質が促進するＤＦＲおよびＢＡＮの遺伝子の転写を抑制するのみでは、タンニンの生産を抑制することは通常困難である。
【０１４７】
本発明にかかる方法においては、キメラタンパク質ＴＴ２ＳＲＤＸにより、ＤＦＲおよびＢＡＮの遺伝子のみならず、フェニルプロパノイド合成に関与する遺伝子の発現が抑制されると考えられ、これらの遺伝子発現の抑制により、タンニンの合成が抑制されると考えられる。
【０１４８】
（４）ｐ３５Ｓ:: ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナにおけるシアニジンおよびアントシアニンの定量分析
ｐ３５Ｓ:: ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナ（以下「形質転換シロイヌナズナ」という）のシアニジン含量は、De-Yu Xie, Shashi B. Sharma, Nancy L.Paiva, Daneel Ferreira, Richard A. Dixon., Science, 299, 396-399, 2003.に記載されている方法に準拠して算出した。シアニジンは、図４（ａ）および図４（ｂ）中に示したアントシアニジンに属する色素である（理化学辞典第５版、５５２頁、岩波書店）。まず、標品（市販）シアニジンの希釈系列と５５０ｎｍの吸光度から標準曲線を求めた。次に、野生型シロイヌナズナおよび上記形質転換シロイヌナズナの種子または葉の重量を測定後、上記種子または葉を５．２６ｍＭの異性重亜硫酸ナトリウムを含む７０％アセトン溶液で処理し、上記種子または葉の抽出液を調製した。さらに、上記抽出液を９５%ブタノール−５％塩酸溶液中で１００℃, １時間インキュベートした。続いて、上記インキュベートした抽出液の５５０ｎｍの吸光度を測定し、測定した吸光度のデータをもとに上記標準曲線よりシアニジン量を算出した。
【０１４９】
図５（ａ）は、上記形質転換シロイヌナズナの種子１ｇあたりのシアニジン含量（ｍｇ）を示すものであり、図５（ｂ）は、上記形質転換シロイヌナズナの葉新鮮重量１ｇあたりのシアニジン含量（μｇ）を示すものである。図５（ａ）、図５（ｂ）の横軸は、ＷＴが野生型のシロイヌナズナを示し、＃１２、＃１３、＃１７はそれぞれ上記形質転換シロイヌナズナの識別番号を示す。すなわち、３ラインの上記形質転換シロイヌナズナについてシアニジンの定量分析を行った。
【０１５０】
上記３ラインのいずれにおいても、種子、葉ともに野生型と比較して顕著にシアニジン含量が低減されていることが確認され、シアニジンの合成が抑制されていることが確認された。なお、一般的にシロイヌナズナでは、タンニン（シアニジン類）は種子には多く含まれるが、葉にはあまり含まれないため、単位表示が図５（ａ）ではｍｇとなっており、図５（ｂ）ではμｇとなっている。
【０１５１】
図５（ｃ）における灰色のカラムは、０．５％ショ糖を含むＭＳ培地（通常の条件）で生育させた野生型シロイヌナズナの５３０ｎｍにおけるアントシアニン由来の吸光度を１とした場合の、上記形質転換シロイヌナズナの５３０ｎｍにおけるアントシアニン由来の吸光度の相対値を表したものである。
【０１５２】
上記アントシアニン由来の吸光度の相対値は、Ron J.Laby, M.Sean Kincaid, Donggiun Kim and Susan I. Gibson., The Plant J, 23(5), 587-596, 2000に記載されている方法に準拠して算出した。まず、上記野生型シロイヌナズナ（２週齢）および上記形質転換シロイヌナズナ（２週齢）の葉の重量を測定後、上記葉を４５％メタノール−５％酢酸溶液で処理して上記葉の抽出液を調製した。さらに、上記抽出液の５３０ｎｍおよび６３７ｎｍの吸光度を測定し、これらの吸光度の値から、上記文献に記載の計算式を用いて算出した値を、上記形質転換シロイヌナズナの葉新鮮重量１ｇあたりのアントシアニン量（相対値）とした。
【０１５３】
なお、シロイヌナズナは６％ショ糖を含むＭＳ培地で生育させるとアントシアニンを蓄積することが知られている。そこで、アントシアニン含量の差をより見やすくするために、上記野生型シロイヌナズナ（２週齢）および上記形質転換シロイヌナズナ（２週齢）を５日間、６％ショ糖含有ＭＳ培地に移し、上記形質転換シロイヌナズナの葉新鮮重量１ｇあたりのアントシアニン量（相対値）の算出を行い、結果を図５（ｃ）において黒色のカラムで表した。
【０１５４】
上記形質転換シロイヌナズナにおいては、上記３ラインのいずれにおいても、野生型と比較して顕著にアントシアニン含量が低減されていることが確認され、アントシアニンの合成が抑制されていることが確認された。
【０１５５】
（５）ｐ３５Ｓ:: ＰＡＰ１ＳＲＤＸで形質転換したシロイヌナズナにおけるフェニルプロパノイド合成系酵素および転写因子の遺伝子発現解析
上記形質転換シロイヌナズナにおけるフェニルプロパノイド合成系酵素および転写因子の遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。
【０１５６】
まず、野生型シロイヌナズナの未熟さやと、上記形質転換シロイヌナズナの未熟さやとからそれぞれの全ＲＮＡを抽出精製し、上記野生型シロイヌナズナの全ＲＮＡ１．６５μｇと、上記形質転換シロイヌナズナの全ＲＮＡ１．６５μｇとを分取した後、混在するＤＮＡを除くためＤＮａｓｅ処理を行った。次にT-Primed First-Strand Kit (アマシャム社製)を用いてＲＮＡをfirst strand cDNAに変換した。これを鋳型にして、以下に示す各遺伝子のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃２分（１サイクル）の後、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとして２１〜３８サイクル行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物の一定量を電気泳動し、そのバンドから各遺伝子の発現量を考察した。比較対照としてβ-tubulinの発現量を同時に検出した。
【０１５７】
定量解析を行ったリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、LightCycler（ロッシュ製）を用いて９５℃１０分（１サイクル）、９５℃１０秒、６２℃１０秒、７２℃７秒を１サイクルとして４０サイクル行った。
【０１５８】
［ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列］
＜CHS 5’プライマー＞
5’-TGGTCTCCGTCCTTCCGTCAA-3’（配列番号１４９）
＜CHS 3’プライマー＞
5’-CCCTCAAATGTCCGTCTATGGAA-3’（配列番号１５０）
＜DFR 5’プライマー＞
5’-AAAAAGATGACAGGATGGGT-3’（配列番号１５１）
＜DFR 3’プライマー＞
5’-CCCCTGTTTCTGTCTTGTTA-3’ （配列番号１５２）
＜LDOX 5’プライマー＞
5’-ATGGTTGCGGTTGAAAGAGTTGAGAG-3’ （配列番号１５３）
＜LDOX 3’プライマー＞
5’-CCAACTTCTTTCTCTAGACGGTCAGGC-3’ （配列番号１５４）
＜BAN 5’プライマー＞
5’-ATGGACCAGACTCTTACACACACCGGA-3’ （配列番号１５５）
＜BAN 3’プライマー＞
5’-GTTTCCGGCTATAAGTGCCGGAATCACG-3’ （配列番号１５６）
＜TT2 5’プライマー＞
5’-GGGATGGGAAAGAGAGCAACTACTAGTGTGAGG-3’ （配列番号１５７）
＜TT2 3’プライマー＞
5’-ACAAGTGAAGTCTCGGAGCCAATCTTCATCG-3’ （配列番号１５８）
＜PAP2 5’プライマー＞
5’-GAAAAACATTATTTCCCCTCCTACAAC-3’（配列番号１５９）
＜PAP2 3’プライマー＞
5’-CAATCGCATTAGCTTCTTGGTTTTCCC-3’（配列番号１６０）
＜PAP1 5’プライマー＞
5’-GGGATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGG-3’（配列番号１６１）
＜PAP1 3’プライマー＞
5’-TACACAAACGCAAACAAATGTTCGAAAC-3’（配列番号１６２）
＜PAP1SRDX 5’プライマー＞
5’-GGGATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGAAAAGG-3’（配列番号１６３）
＜PAP1SRDX 3’プライマー＞
5’-AGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAG-3’（配列番号１６４）
＜TUB 5’プライマー＞
5’-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3’（配列番号１６５）
＜TUB 3’プライマー＞
5’-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3’（配列番号１６６）
［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列］
＜CHS 5’プライマー＞
5'-CGTGTTGAGCGAGTATGG-3’（配列番号１６７）
＜CHS 3’プライマー＞
5'-GCTGTGCAAGACGACTG-3’（配列番号１６８）
＜DFR 5’プライマー＞
5'-TGACAGGATGGATGTATTTC-3’（配列番号１６９）
＜DFR 3’プライマー＞
5'-GACCGACCACCAATGTT-3’（配列番号１７０）
＜LDOX 5’プライマー＞
5'-ACTGGAAAGATTCAAGGCTA-3’（配列番号１７１）
＜LDOX 3’プライマー＞
5'-GTACTCACTCGTTGCTTCTATG-3’（配列番号１７２）
＜BAN 5’プライマー＞
5'-ACGAAGAAAACTGGACTGAC-3’（配列番号１７３）
＜BAN 3’プライマー＞
5'-GCTATAAGTGCCGGAATCA-3’（配列番号１７４）
＜TT2 5’プライマー＞
5'-TTGATGGTTTGGACTGTG-3’（配列番号１７５）
＜TT2 3’プライマー＞
5'-GCAATATAGGCTCAACAAGT-3’（配列番号１７６）
＜PAP1 5’プライマー＞
5'-GAGGAAAGCCAAGAGGTA-3’（配列番号１７７）
＜PAP1 3’プライマー＞
5'-CAAACCTATACACAAACGCA-3’（配列番号１７８）
＜PAP2 5’プライマー＞
5'-AAACCAAGAAGCTGATGC-3’（配列番号１７９）
＜PAP2 3’プライマー＞
5'-AAAAGCCACCCACAATCT-3’（配列番号１８０）
図６は、上記ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真であり、併せて、上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すものである。図６に示すバンドにおいて、左側の列は野生型シロイヌナズナ（ＷＴ）の結果を示し、右側の列は上記形質転換シロイヌナズナ（ＰＡＰ１ＳＲＤＸ）の結果を示す。写真の左側に記載したＣＨＳ，ＤＦＲ，ＬＤＯＸ，ＢＡＮは、上述のようにフェニルプロパノイド合成系の酵素名の略称であり、ＴＴ２，ＰＡＰ２，ＰＡＰ１は、フェニルプロパノイド合成系に関与する酵素の遺伝子発現を促進する転写因子である。ＰＡＰ１ＳＲＤＸ、ＴＵＢは比較対照として用いたものである。
【０１５９】
写真の右側に示した数字は、上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すものであり、上記野生型シロイヌナズナにおける各酵素遺伝子または各転写因子遺伝子の発現量を１とした場合の、上記形質転換シロイヌナズナにおける各酵素遺伝子または各転写因子遺伝子の発現量の相対値である。上記相対値は、ＰＣＲ産物のコピー数から算出したものであり、測定は２回行い、その平均値を求めた。
【０１６０】
図６より、上記形質転換シロイヌナズナにおいて、ＣＨＳ，ＤＦＲ，ＬＤＯＸ，ＢＡＮの遺伝子はいずれも上記相対値が０．５未満となり、野生型に比べて発現が抑制されることが確認された。なお、上記形質転換シロイヌナズナにおけるＰＡＰ１遺伝子の発現は、内在性ＰＡＰ１遺伝子の発現によるものである。すなわち、上記形質転換シロイヌナズナにおいてco-suppressionは生じない。また、上記形質転換シロイヌナズナにおけるＴＴ２およびＰＡＰ２の遺伝子発現については、いずれの場合も上記相対値が０．５以上であるので、生物学的観点から、ＴＴ２およびＰＡＰ２の遺伝子発現が抑制されているとは判断されないと解釈される。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
このように、本発明では、タンニンの合成系に関与する遺伝子の転写を抑制することによってタンニンの含量を低減する植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や林業、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】（ａ）は実施例において用いる組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸの構造を示す模式図であり、（ｂ）は実施例において用いる組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＴＴ２ＳＲＤＸの構造を示す模式図である。
【図２】（ａ）は野生型のシロイヌナズナの次世代の種子を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は実施例で組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの次世代の種子を示す図である。
【図３】（ａ）は野生型のシロイヌナズナの次世代の種子を示す図であり、（ｂ）は実施例で組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＴＴ２ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの次世代の種子を示す図である。
【図４】（ａ）はＰＡＰ１がフェニルプロパノイド合成に関与する遺伝子の発現を促進することによりアントシアニン合成が促進されることを示す図であり、（ｂ）はＰＡＰ１とＳＲＤＸとを融合させたキメラタンパク質がフェニルプロパノイド合成に関与する遺伝子の発現を抑制することによりアントシアニンばかりでなくタンニンの合成も抑制されることを示す図である。
【図５】（ａ）は、実施例で組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの種子１ｇあたりのシアニジン含量を示すものであり、（ｂ）は、実施例で組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの葉新鮮重量１ｇあたりのシアニジン含量を示す図である。（ｃ）は、実施例で組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＰＡＰ１ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの５３０ｎｍにおけるアントシアニン由来の吸光度の相対値を表したものである。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真であり、併せて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すものである。
【出願人】 【識別番号】５０３３６０１１５
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】３０１０２１５３３
【氏名又は名称】独立行政法人産業技術総合研究所
【出願日】 平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【代理人】 【識別番号】１０００８００３４
【弁理士】
【氏名又は名称】原 謙三
【公開番号】 特開２００５−２０４６５７（Ｐ２００５−２０４６５７Ａ）
【公開日】 平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願番号】 特願２００４−３７４１５９（Ｐ２００４−３７４１５９）