| 【発明の名称】 |
種子重量の増加したトランスジェニック植物とその利用 |
| 【発明者】 |
【氏名】倉田 のり
【氏名】三好 一丸
【氏名】安 炳玉
【氏名】伊藤 幸博
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| 【要約】 |
【課題】イネ等の植物において、種子重量の増加をもたらすトランスジェニック植物を作出すると共に、その利用方法を提供すること。
【解決手段】本発明のトランスジェニック植物は、PLASTOCHRON1（ＰＬＡ１）遺伝子が導入されることによって、大きさや重量の増加した種子が得られる。実際に複数のイネ品種にＰＬＡ１ゲノム遺伝子を導入することによって作出した形質転換イネでは、いずれの品種の場合にも野生型と比較して重量の増加したイネ種子が得られた。本発明は、穀物などに用いられる種子の生産性向上に利用することができ、とりわけ、コメの生産性向上への利用が期待できる。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PLASTOCHRON1（ＰＬＡ１）遺伝子が導入され、種子重量が増加したトランスジェニック植物。
【請求項２】
請求項１記載のトランスジェニック植物によって生産された種子。
【請求項３】
イネ科植物である、請求項１記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
イネ由来のＰＬＡ１遺伝子が導入された請求項３記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が導入された請求項４記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
配列番号１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子が導入された請求項５記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物によって生産されたコメ。
【請求項８】
PLASTOCHRON1（ＰＬＡ１）遺伝子が導入され、種子重量が増加したトランスジェニック植物の作出方法であって、上記ＰＬＡ１遺伝子を挿入した遺伝子導入ベクターを構築し、当該遺伝子導入ベクターでアグロバクテリウムを形質転換し、このアグロバクテリウムを植物細胞に感染させ、その後、植物体に再分化させる工程を含む作出方法。
【請求項９】
アグロバクテリウムをイネ科植物のカルスに感染させ、イネ科植物を作出することを特徴とする請求項８記載のトランスジェニック植物の作出方法。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子重量の増加したトランスジェニック植物（遺伝子組換え植物）とその利用に関するものである。本発明は、種子の生産性向上に利用することができ、とりわけイネ種子の重量増加によるコメの生産性向上に利用し得るものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の種子は、もとより穀物などとして重要であり、種子の大きさや重量を品種改良などによって改変しようとする試みは、従前においても行われてきた。特に近年は遺伝子組換え技術が発達し、この技術を利用して植物の形質を人為的に改変し、有用品種を作出しようとする試みも盛んに行われている。しかしながら、イネ等の作物において、種子の大きさや重量を遺伝子組換え技術によって大型化したという成功例は未だ報告されていない。
【０００３】
例えばイネの場合、種子の大型化はコメの生産量増加に直結するものであり、特にコメを主食とするわが国において、種子の大きさ等の改良は食糧の自給を図る観点からも重要である。また、吟醸酒の酒米のように粒を削って用いることが必須の場合には、種子の大きいことが非常に重要であり、イネ種子の大型化は良質の酒米などへの利用も期待できる。
【０００４】
ところで最近、本発明者は、イネ由来のPLASTOCHRON1遺伝子（以下、「ＰＬＡ１遺伝子」という。）を同定した。このＰＬＡ１遺伝子のｃＤＮＡ配列および同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列については、下記の非特許文献１に記載されている。これらの配列情報は、本発明者の提出によるものである。
【０００５】
上記ＰＬＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、チトクロームＰ４５０ファミリーのメンバーの１つであり、モノオキシゲナーゼ活性を持つと推測される。このタンパク質の構造の特徴および、ＰＬＡ１遺伝子を欠失した突然変異体の形質等については、下記の非特許文献２に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】DDBJ/EMBL/GenBank databases：アクセッション番号AB096259
【非特許文献２】Kazumaru Miyoshi, Byung-Ohg Ahn, Taiji Kawakatsu, Yukihiro Ito, Jun-Ichi Itoh, Yasuo Nagato, and Nori Kurata, PLASTOCHRON1, a timekeeper of leaf initiation in rice, encodes cytochrome P450. Proceedings of the National Academy of Science, 101: 875-880 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、イネ等の植物において、種子重量の増加をもたらすトランスジェニック植物を作出すると共に、その利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）上記ＰＬＡ１遺伝子を遺伝子導入することにより、イネ種子が肥大・大型化し、種子重量が増加すること、（２）ＰＬＡ１遺伝子導入による種子重量の増加は、単一品種に限らず、他のイネ品種においても種子重量の増加が認められること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｉ）の発明を包含するものである。
Ａ） PLASTOCHRON1（ＰＬＡ１）遺伝子が導入され、種子重量が増加したトランスジェニック植物。
Ｂ） 上記Ａ）記載のトランスジェニック植物によって生産された種子。
Ｃ） イネ科植物である、上記Ａ）記載のトランスジェニック植物。
Ｄ） イネ由来のＰＬＡ１遺伝子が導入された上記Ｃ）記載のトランスジェニック植物。
Ｅ） 配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が導入された上記Ｄ）記載のトランスジェニック植物。
Ｆ） 配列番号１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子が導入された上記Ｅ）記載のトランスジェニック植物。
Ｇ） 上記Ｃ）〜Ｆ）のいずれかに記載のトランスジェニック植物によって生産されたコメ。
Ｈ） PLASTOCHRON1（ＰＬＡ１）遺伝子が導入され、種子重量が増加したトランスジェニック植物の作出方法であって、上記ＰＬＡ１遺伝子を挿入した遺伝子導入ベクターを構築し、当該遺伝子導入ベクターでアグロバクテリウムを形質転換し、このアグロバクテリウムを植物細胞に感染させ、その後、植物体に再分化させる工程を含む作出方法。
Ｉ） アグロバクテリウムをイネ科植物のカルスに感染させ、イネ科植物を作出することを特徴とする上記Ｈ）記載のトランスジェニック植物の作出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のトランスジェニック植物（遺伝子組換え植物）は、ＰＬＡ１遺伝子が導入されることによって、大きさや重量の増加した種子が得られるので、穀物などに用いられる種子の生産性向上に利用することができる。
【００１１】
例えば本発明のトランスジェニック植物をイネに適用することによって、粒の大型化したコメが得られ、コメの生産性向上に利用することができる。特に酒米のように粒を削って用いる場合に、粒の大型化したコメは有用である。また、本発明を複数のイネ品種に適用することによって、いずれも大型化したイネ種子が得られたので、多くのイネ品種に本発明を適用することによって、各品種米の生産性向上への利用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
本発明のトランスジェニック植物には、前記PLASTOCHRON1（ＰＬＡ１）遺伝子が導入される。後述の実施例において詳述するように、本発明者は、イネゲノムより単離したＰＬＡ１遺伝子を使用して、これを複数のイネ品種に導入し、形質転換イネの作出に成功した。
【００１３】
配列表の配列番号１には、本発明者がＰＬＡ１遺伝子導入イネの作出に使用したイネ（Oryza sativa）由来のＰＬＡ１ゲノム遺伝子の塩基配列が示される。この塩基配列には、２つのエクソンと１つのイントロンが含まれており、配列中３１０７〜４１４１番目が第１エクソン、４２２８〜４８６０番目が第２エクソン、両エクソン間の４１４２〜４２２７番目がイントロンの領域に相当する。
【００１４】
上記ＰＬＡ１遺伝子によってコードされるＰＬＡ１蛋白は、５５５アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列より、チトクロームＰ４５０（Cytochrome P450）ファミリーのメンバーの１つであり、モノオキシゲナーゼ（monooxygenase）活性を持つと推測される。本発明者の単離したメンバーは、Ｐ４５０登録委員会によりＰ４５０ファミリー中にＣＹＰ７８Ａ１１として位置付けられた。
【００１５】
上記ＰＬＡ１遺伝子のｃＤＮＡ配列、および、ＰＬＡ１蛋白のアミノ酸配列については、配列番号２および３にそれぞれ示される。これらの配列は、データベース（DDBJ/EMBL/GenBank databases）においてアクセッション番号ＡＢ０９６２５９として登録されている。
【００１６】
ＰＬＡ１遺伝子の植物への導入方法としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法など既存の確立された遺伝子導入方法のいずれを使用してもよいが、本発明者はアグロバクテリウム法を用いてＰＬＡ１遺伝子導入植物を作出した。詳細は後述の実施例において説明するが、（１）まず、ＰＬＡ１遺伝子をバイナリベクターへ挿入し、（２）得られたＰＬＡ１遺伝子導入ベクターによってアグロバクテリウムを形質転換し、（３）このアグロバクテリウムをイネのカルスへ感染させ、培養、選抜、再分化を経て、ＰＬＡ１遺伝子が導入された形質転換イネを作出した。
【００１７】
図１は、この形質転換イネの作出に使用したバイナリベクターｐＢＧＨ１の構造を示す図であり、図２は、このバイナリベクターｐＢＧＨ１にＰＬＡ１遺伝子を挿入することによって構築されたＰＬＡ１遺伝子導入ベクターｐＢＧＰＬＡ１の構造を示す図である。後述の実施例記載の作出方法（以下、「本作出方法」という。）では、このベクターｐＢＧＰＬＡ１を、エレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）へ導入した。そして、当該ベクターの導入が確認されたアグロバクテリウムをイネのカルスへ感染させ、その後、培養、選抜、再分化を経て、形質転換イネを作出した。尚、本作出方法の各ステップは、通常のアグロバクテリウム法に従って行うことができる。
【００１８】
解析の結果、本作出方法により作出した形質転換イネにおいては、ＰＬＡ１遺伝子が導入されていることが確認された。この形質転換イネ第１世代より自殖種子を得て、風乾後、重量を測定したところ、イネ８系統中６系統で種子重量の増加が見られた（後述の表１２）。また、これら形質転換イネから採れた種子の外形については、主に長さの増加が見られた（図３参照。図中、＃５から＃８は形質転換イネ、ｃｏｎｔは形質転換していないイネ種子である）。さらに、上記形質転換イネはイネ品種「日本晴」を形質転換したものであったが、他のイネ品種「金南風」由来の突然変異体にＰＬＡ１遺伝子を導入した場合にも、同様に種子重量の増加が見られた（図４参照。図中、pla1-2+PLA1はＰＬＡ１遺伝子を導入した系統から得られた種子、Kimmazeは野生型イネ品種「金南風」から得られた種子である）。
【００１９】
このように、本発明のトランスジェニック植物（形質転換イネ）は、ＰＬＡ１遺伝子が導入されることによって、大きさや重量の増加したイネ種子が得られるので、粒の大型化したコメが得られ、コメの生産性向上に利用することができる。特に酒米のように粒を削って用いる場合に、粒の大型化したコメは有利である。また、本発明を複数のイネ品種に適用することによって、いずれも大型化したイネ種子が得られたので、多くのイネ品種に本発明を適用することによって、各品種米の生産性向上への利用が期待できる。
【００２０】
ところで、本作出方法ではＰＬＡ１遺伝子導入用の植物にイネを用いたが、本発明のトランスジェニック植物は特にイネに限定されるものではない。例えば、他のイネ科植物（コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシなど）に上記ＰＬＡ１遺伝子を導入することによって本発明のトランスジェニック植物を作出してもよいし、他の単子葉植物に上記ＰＬＡ１遺伝子を導入することによって本発明のトランスジェニック植物を作出してもよい。この場合にも、ＰＬＡ１遺伝子の導入によって重量の増加した種子が得られる可能性がある。
【００２１】
尚、本発明における「植物」の範疇には、植物個体のほか、根、茎、葉、生殖器官（花器官および種子を含む）などの各種器官、各種組織、植物細胞などが含まれ、さらにはプロトプラスト、スフェロプラスト、誘導カルス、再生個体およびその子孫、なども含まれるものとする。
【００２２】
勿論、上記の作出方法に種々の変更を加えて、本発明のトランスジェニック植物を作出することが可能である。例えば、上記の方法では、ＰＬＡ１遺伝子のゲノムＤＮＡを植物に導入したが、これに限らず、例えば配列番号２に示されるＰＬＡ１遺伝子のｃＤＮＡを植物に導入してもよい。
【００２３】
また、ゲノムＤＮＡを導入する場合にも、ＰＬＡ１蛋白をコードする遺伝子領域を含んでいればよいので、配列番号１に示される配列よりも短い塩基配列を植物に導入することにしてもよい。
【００２４】
さらに、ゲノムＤＮＡ・ｃＤＮＡのいずれを導入する場合にも、ＰＬＡ１遺伝子の元の塩基配列中の１個または数個の塩基を常法に従って置換、欠失、挿入、及び／又は付加させ、このように人為的に改変したＰＬＡ１遺伝子を植物に導入することにしてもよい。
【００２５】
ＰＬＡ１遺伝子を挿入した組換えベクターには、バイナリベクター以外のベクターを使用してもよい。また、ＰＬＡ１遺伝子と共に植物ゲノムに導入するＤＮＡ配列は任意に設計すればよく、例えば、選抜のための選択マーカーとして、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を植物に付与するＨＰＴ遺伝子（図２参照）を使用したが、これ以外の選択マーカーを使用しても勿論よい。
【００２６】
もっとも、ＰＬＡ１遺伝子の発現が多すぎると植物体自体の生育が幾分異常になる（葉が波打ち生育に障害が見られる）ので、導入に際しては遺伝子本来のプロモーター、あるいは比較的弱いプロモーターを用いることが好ましい。
【００２７】
前述のように、ＰＬＡ１遺伝子の植物への導入方法としては、アグロバクテリウム法以外の方法を使用してもよい。また、上記の方法は、イネ（Oryza sativa）由来のＰＬＡ１遺伝子をイネ品種に導入するものであったが、前述のように、この遺伝子を他のイネ科植物に導入することによって本発明のトランスジェニック植物を作出してもよいし、他の単子葉植物にイネ由来のＰＬＡ１遺伝子を導入してもよい。
【００２８】
さらに、上記イネ由来のＰＬＡ１遺伝子と相同性の高い、他のイネ品種のＰＬＡ１遺伝子、あるいは他の植物種由来のＰＬＡ１ホモログを得て、これを同種または異種の植物に導入してもよい。このようなＰＬＡ１ホモログとしては、その遺伝子産物がイネのＰＬＡ１蛋白と同様の機能を有する限りにおいて特に限定されない。
【００２９】
以上のように、本作出方法によるＰＬＡ１遺伝子の導入によって、複数の日本型イネ品種（「日本晴」と「金南風」）で種子形と種子重の増加をもたらした。このことから、多くの品種で種子の大型化と、それに伴う生産の増収が期待できる。また、米を用いる製品への利用や資料用イネとしての利用、良質の酒米などへの利用が期待できる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３１】
本発明者は、以下の方法によりＰＬＡ１遺伝子を導入した形質転換イネを作出し、その種子形や種子重の増加について検討した。
【００３２】
〔１〕遺伝子導入に使用したイネＰＬＡ１遺伝子の構造
遺伝子導入には、イネゲノムより単離したＰＬＡ１遺伝子を使用した。このイネＰＬＡ１遺伝子は、第１０染色体の２６．４ｃＭの位置に座乗する。ＰＬＡ１遺伝子には、配列番号１の配列に示すように、２つのエクソンと１つのイントロン（８６ｂｐ）があり、５５５アミノ酸残基からなる５９．１ｋＤａのタンパク質をコードする。この遺伝子のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、前述のように、アクセッション番号ＡＢ０９６２５９として登録されている。
【００３３】
ＰＬＡ１遺伝子産物、即ちＰＬＡ１蛋白は、そのアミノ酸配列より、チトクロームＰ４５０（Cytochrome P450）ファミリーのメンバーの１つであり、モノオキシゲナーゼ（monooxygenase）活性を持つと推測される。本発明者の単離したメンバーは、Ｐ４５０登録委員会によりＰ４５０ファミリー中にＣＹＰ７８Ａ１１として位置付けられた。
【００３４】
上記ＰＬＡ１遺伝子は、イネ品種「日本晴」由来であり、この遺伝子を含む長さ約６．０ｋｂのＳｐｅＩ断片が下記のベクターｐＢＧＨ１に挿入された。即ち、ベクターに挿入された配列は、配列番号１に示される、ＰＬＡ１遺伝子の上流約３，０００ｂｐから下流約１，０００ｂｐを含む長さ５，９６５ｂｐのゲノム配列である。この配列中、両端の６塩基（ＡＣＴＡＧＴ）は、ＰＬＡ１遺伝子導入ベクター構築に用いたＳｐｅＩ切断部位である。
【００３５】
〔２〕ＰＬＡ１遺伝子導入ベクターの作製とアグロバクテリウムへの導入
まず、上記ＰＬＡ１遺伝子を含む長さ約６．０ｋｂのＳｐｅＩ断片をバイナリベクターｐＢＧＨ１のＸｂａＩ切断部位に挿入した。
【００３６】
図１は、上記バイナリベクターｐＢＧＨ１の構造を示す図である。図中、ＲＢはＴ−ＤＮＡのライトボーダーを、Ｐｎはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーターを、ＮＰＴIIはカナマイシン耐性遺伝子のコード領域を、Ｔｎはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを、ｉｎｔＧＵＳはイントロンを含むＧＵＳ遺伝子のコード領域を、３５Ｓはカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターを、ＨＰＴはハイグロマイシン耐性遺伝子のコード領域を、ＬＢはＴ−ＤＮＡのレフトボーダーを、それぞれ示す。ベクターにおける主な制限酵素切断部位についても、その位置とともに示される。
【００３７】
図１に示すように、ｐＢＧＨ１には、Ｔ−ＤＮＡ領域にライトボーダー側より順に、カナマイシン耐性遺伝子、制限酵素ＸｂａＩ切断部位を含むマルチクローニングサイト、ＧＵＳ遺伝子のコード領域およびハイグロマイシン耐性遺伝子が存在する。ＰＬＡ１遺伝子を挿入するため、このｐＢＧＨ１を制限酵素ＸｂａＩで切断した後、アルカリフォスファターゼにより脱リン酸化処理した。その後、ＰＬＡ１遺伝子を含む長さ約６．０ｋｂのＳｐｅＩ断片とＸｂａＩで切断し脱リン酸化したｐＢＧＨ１とをＴ４ ＤＮＡリガーゼにより結合し、次いで、エレクトロポレーション法により大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を形質転換した。
【００３８】
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株のエレクトロポレーション用コンピテントセルは、以下のように作製した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を１ｍｌのＳＯＢ液体培地（培地組成は下記表１参照）に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。翌日、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株の終夜培養液０．５ｍｌをＳＯＢ液体培地５００ｍｌに植え、３７℃で３時間振盪培養した。３時間後、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を氷冷し、遠心分離により回収した。その後、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を氷冷した１０％グリセロール溶液で２度洗浄し、２ｍｌの氷冷した１０％グリセロール溶液に懸濁後、４０μｌずつ分注し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。（なお、以下の表１〜表１１に掲げる培地組成、培養条件などは、あくまでも本実施例において使用したものであって、形質転換に通常使用される他の方法で本発明の形質転換イネを作出しても勿論よい。）
【００３９】
【表１】
【００４０】
エレクトロポレーションは、以下のように行った。コンピテントセルを氷上で溶かした後、ＤＮＡ溶液１μｌを加え、バイオラッド社製ジーンパルサーIIを用いて、１８ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωの条件で通電した。
【００４１】
エレクトロポレーションを行った大腸菌ＤＨ１０Ｂ株は、ＳＯＣ液体培地（培地組成は下記表２参照）に懸濁し、３７℃で３０分間振盪培養後、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬ固形培地（培地組成は下記表３参照）に広げ、３７℃１晩培養した。得られた形質転換体のコロニーを、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（培地組成は下記表４参照）に植菌し、３７℃で１晩振盪培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。
【００４２】
【表２】
【表３】
【表４】
【００４３】
上記方法により作製されたＰＬＡ１遺伝子導入ベクターｐＢＧＰＬＡ１は、図２に示すように、Ｔ−ＤＮＡ領域にライトボーダー（ＲＢ）側より順に、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII）、ＰＬＡ１遺伝子（ＰＬＡ１）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）を持つ。
【００４４】
次に、上記ベクターｐＢＧＰＬＡ１をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens EHA101株）にエレクトロポレーション法により導入した。このAgrobacterium tumefaciens EHA101株のコンピテントセルの作製およびエレクトロポレーションの方法は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株の場合と同様に行った。ただし、培養はすべて３０℃で行い、ＳＯＣ液体培地での培養後は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含むＬ固形培地で２晩培養した。得られた形質転換体のコロニーは５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含むＹＥＢ液体培地（培地組成は下記表５参照）に植菌し、３０℃で１晩振盪培養した。この培養液に等量のグリセロールを加え、混和後、−８０℃で保存した。
【００４５】
【表５】
【００４６】
〔３〕ＰＬＡ１遺伝子導入ベクターのイネへの導入法と用いたイネの特徴
イネ品種「日本晴」の完熟種子をもみ殻を取り除いた後、次亜塩素酸ソーダ（有効塩素濃度２．５％）により３０分間表面殺菌した。殺菌した種子は、滅菌水で５回洗浄後、Ｎ６ＣＩ培地（培地組成は下記表６参照）に置床し、２５℃、連続光下で３週間培養し、カルスを誘導した。得られたカルスを以下の形質転換実験に用いた。
【００４７】
【表６】
【００４８】
尚、上記Ｎ６ビタミン（×１００）の組成は、１Ｌ当たり、グリシン２００ｍｇ、ニコチン酸５０ｍｇ、ピリドキシン塩酸５０ｍｇ、チアミン塩酸１００ｍｇである（以下同じ）。
【００４９】
イネの形質転換は、以下に示すようにアグロバクテリウム法により行った。上記ベクターｐＢＧＰＬＡ１を持つAgrobacterium tumefaciens EHA101株を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンと５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含むＬ固形培地に植菌し、３０℃で２日間培養した。２日後、増殖した菌を滅菌した爪楊枝でかきとり、１０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを含むＡＡ液体培地（培地組成は下記表７参照）３０ｍｌに懸濁した。この培地に誘導３週間後のカルスを懸濁し、２分間室温で静置した。２分後、カルスを培地から取り出し、Ｎ６ＣＯ培地（培地組成は下記表８参照）に置床し、暗黒下２５℃で３日間共存培養した。
【００５０】
【表７】
【表８】
【００５１】
３日後、カルスを２００ｍｇ／Ｌのクラフォラン溶液で３回洗浄し、その後Ｎ６ＳＥ培地（培地組成は下記表９参照）に置床し、２５℃、連続光下で３週間培養した。３週間後、カルスをＭＳＲＥ培地（培地組成は下記表１０参照）に移した。カルスはシュートが再分化するまで３週間毎に新しいＭＳＲＥ培地に移しかえた。再分化したシュートは直径９ｃｍのペトリ皿いっぱいに生長するまで、さらに３週間毎に新しいＭＳＲＥ培地に移しかえた。十分生長したシュートはＭＳＨＦ培地（培地組成は下記表１１参照）に移し、２５℃、連続光下で３週間培養し、発根を誘導した。発根した形質転換イネを土を入れたバケツに移植し、人工気象機内で自然光下、昼温３０℃、夜温２５℃で栽培し、自殖種子を得た。
【００５２】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【００５３】
〔４〕ＰＬＡ１遺伝子を導入した形質転換イネの確認と形態的特徴
形質転換イネは、３つの方法でＰＬＡ１遺伝子の導入を確認した。１つはハイグロマイシン耐性である。ＰＬＡ１遺伝子導入ベクターには選抜マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を使用しており、ＰＬＡ１遺伝子導入イネはハイグロマイシン耐性を示す。実際、ＰＬＡ１遺伝子導入イネはハイグロマイシン含有培地上で正常な生長を示し、葉の白色化や根の伸長阻害等のハイグロマイシンの影響は見られなかった。従って、ＰＬＡ１遺伝子導入イネはハイグロマイシン耐性であり、ＰＬＡ１遺伝子が導入されている。
【００５４】
２つ目は、ＰＬＡ１遺伝子導入イネからのＰＬＡ１遺伝子ベクターの検出である。ＰＬＡ１遺伝子導入個体よりＤＮＡを抽出し、ＰＬＡ１遺伝子ベクター特異的プライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、予想される長さのＤＮＡが増幅された。一方、形質転換していないイネ品種日本晴のＤＮＡからはそのようなバンドは見られなかった。従って、ＰＬＡ１遺伝子導入イネにはＰＬＡ１遺伝子ベクターが組み込まれていると結論した。
【００５５】
３つ目は、ＰＬＡ１遺伝子導入イネでのＰＬＡ１遺伝子の発現パターンである。形質転換していないイネ品種日本晴の外頴ではＰＬＡ１遺伝子の発現が見られないが、ＰＬＡ１遺伝子導入イネの外頴ではＰＬＡ１遺伝子の発現が見られた。従って、ＰＬＡ１遺伝子導入イネではＰＬＡ１遺伝子の異所的発現が見られ、ＰＬＡ１遺伝子が導入された結果と考えられる。
【００５６】
以上、表現型レベル、ＤＮＡレベル、遺伝子発現レベルの３つの解析から、ＰＬＡ１遺伝子導入イネにはＰＬＡ１遺伝子が導入されていることが確認された。
【００５７】
ＰＬＡ１遺伝子導入イネの中には葉の形態異常が見られる個体があった。それらの葉は小さく、湾曲していた。このような個体は生長が悪く、採種に至らなかった。他の個体に関しては、種子の大きさの増大以外、形態の変異は認められなかった。
【００５８】
〔５〕ＰＬＡ１遺伝子を導入した形質転換イネにおける種子重量の増加
ＰＬＡ１遺伝子を導入した形質転換イネ第１世代より自殖種子を得て、風乾後、重量を測定した。その結果、下記表１２に示すように、イネ８系統中６系統で種子重量の増加が見られた。
【００５９】
【表１２】
【００６０】
表１２中、ｐＢＧＰＬＡ１Ｓｐ−１からｐＢＧＰＬＡ１Ｓｐ−８は独立の形質転換系統を示す。Nipponbareは非形質転換体である。各系統共に、１０粒前後の玄米の測定値により算出した。＊印は、いずれも植物体全体の生育が悪かった系統である（人工育成条件によると考えられる）。
【００６１】
表１２に示すように、種子重量の増大の度合いは形質転換系統により異なっていた。最も増大の度合いが大きい系統（ｐＢＧＰＬＡ１Ｓｐ−７）では、１粒あたりの重量が２９．０ｍｇ（標準偏差０．９ｍｇ）に増大しており、増加率は３４％だった。次に大きかったのはｐＢＧＰＬＡ１Ｓｐ−５系統で、１粒あたり２８．０ｍｇ（標準偏差１．２ｍｇ）で、増加率２９％だった。形質転換していない日本晴は２１．７ｍｇ（標準偏差２．６ｍｇ）であった。
【００６２】
形質転換イネから採れた種子の外形については、図３に示すように、主に長さの増加が見られた。図中、＃５から＃８はｐＢＧＰＬＡ１Ｓｐ−５からｐＢＧＰＬＡ１Ｓｐ−８のＰＬＡ１形質転換系統から得られた種子をそれぞれ示す。ｃｏｎｔは形質転換していない日本晴の種子である。
【００６３】
ＰＬＡ１遺伝子を導入した形質転換イネにおける種子重量の増加は、イネ品種「金南風」（キンマゼ）由来のｐｌａ１突然変異体に導入した場合にも見られた。ｐｌａ１突然変異体は矮化、葉間期の短縮、穂のシュートへの転換等が見られる。このｐｌａ１突然変異体に野生型ＰＬＡ１遺伝子を導入したところ、図４に示すように、これらの表現型が野生型の表現型に回復したのに加え、種子重量の増加も見られた。図中、Kimmazeは野生型イネ品種「金南風」から得られた種子を、pla1-2+PLA1は金南風由来ｐｌａ１突然変異体に野生型ＰＬＡ１遺伝子を導入した系統の種子をそれぞれ示す。
【００６４】
このように、ＰＬＡ１遺伝子導入による種子重量の増加は日本晴に限定されず、他のイネ品種でも可能であることが分かった。また、ＰＬＡ１遺伝子の導入による影響は、用いたプロモーターの強さにより異なり、強力なプロモーターでは、植物体自体にダメージがでて育たない。適切な強さで発現させると、実験した２品種では種子重が平均で約２０〜２５％増加した。
【００６５】
玄米の外側を３〜４割削って使う酒米は、品質とともに大きさが重要視され、シェアーの多い酒米である「亀の尾」で、１０粒重が（籾付き）０．３１ｇ（日本晴の＋１８％）、「山田錦」で０．３３ｇ（＋２７％）であるが、本発明者が作出した上記形質転換イネの種子は、これら酒米に匹敵するほどの種子重の増加があった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のように、本発明のトランスジェニック植物は、ＰＬＡ１遺伝子が導入されることによって、大きさや重量の増加した種子が得られるので、前述したとおり、穀物などに用いられる種子の生産性向上に利用することができ、例えば、種々のイネ品種に本発明を適用することによって、各品種米の生産性向上への利用が期待できるなど産業上幅広く利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のトランスジェニック植物の作出に用いたバイナリベクターｐＢＧＨ１の構造を概略的に示す図である。
【図２】上記バイナリベクターｐＢＧＨ１にＰＬＡ１遺伝子を挿入することによって構築された遺伝子導入ベクターｐＢＧＰＬＡ１の構造を概略的に示す図である。
【図３】イネ品種「日本晴」を用いて作出した本発明の形質転換イネから得られた種子の大きさを野生型品種と比較して示す図である。
【図４】イネ品種「金南風」を用いて作出した本発明の形質転換イネから得られた種子の大きさを野生型品種と比較して示す図である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５０４２０２４７２
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
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| 【出願日】 |
平成１６年１月２６日（２００４．１．２６） |
| 【代理人】 |
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| 【公開番号】 |
特開２００５−２０４６２１（Ｐ２００５−２０４６２１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１７年８月４日（２００５．８．４） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−１７２４６（Ｐ２００４−１７２４６） |
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