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【発明の名称】 |
新規コレステロールエステル化酵素およびその使用 |
| 【発明者】 |
【氏名】飯田 年以
【住所又は居所】神奈川県横浜市都筑区早渕２−２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（新横浜）内
【氏名】吉田 誠一
【住所又は居所】神奈川県横浜市都筑区早渕２−２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（新横浜）内
【氏名】東條 洋介
【住所又は居所】神奈川県横浜市都筑区早渕２−２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（新横浜）内
【氏名】青木 宏文
【住所又は居所】神奈川県横浜市都筑区早渕２−２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（新横浜）内
【氏名】常長 誠
【住所又は居所】神奈川県横浜市都筑区早渕２−２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（新横浜）内
【氏名】猪股 慎二
【住所又は居所】神奈川県横浜市都筑区早渕２−２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（新横浜）内
【氏名】傳田 光洋
【住所又は居所】神奈川県横浜市金沢区福浦２−１２−１ 株式会社資生堂リサーチセンター（金沢八景）内 |
【課題】生体中の遊離脂肪酸とコレステロールの量を制御する技術を開発し、さらに該技術を用いて、皮膚の状態改善（肌荒れ防止・改善、しみ・しわの予防・防止等）や、高脂血症治療等に応用可能な技術を提供する。
【解決手段】補酵素の作用を介在させることなく、遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体とを基質として作用し、脂肪酸−ＣｏＡ複合体には作用せず、コレステロールエステル生成（アシル基転移）反応を触媒する、新規コレステロールエステル化酵素。該酵素は、分子量４０ｋＤａ〜４５ｋＤａ（ゲル濾過法）、作用ｐＨ３．０〜７．０、至適ｐＨ４．０〜５．０で、４〜６０℃の広い範囲で作用し、作用至適温度２０〜５０℃である。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質を有するコレステロールエステル化酵素。
（１）作用
補酵素の作用を介在させることなく、遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体とに直接作用して、コレステロールエステル生成（アシル基転移）反応を触媒する。
（２）基質特異性
遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体を基質として作用する。脂肪酸−ＣｏＡ複合体に対しては作用しない。
（３）分子量
ゲル濾過法による分子量が４０ｋＤａ〜４５ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が６０ｋＤａ〜７０ｋＤａである。
（４）作用ｐＨおよび至適作用ｐＨ
作用ｐＨは３．０〜７．０、至適ｐＨは４．０〜５．０に認められる。
（５）作用温度および至適温度
４〜６０℃の広い範囲で作用するが、作用至適温度は２０〜５０℃に認められる。
（６）熱安定性
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の下で、各温度で１０分間加熱処理した場合、３７℃以下でほとんど失活せず、８０℃でほぼ完全に失活する。
（７）活性影響
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のいずれによっても活性に影響を受けない。
（８）精製方法
下記（i）、（ii）のいずれかの方法により精製される。
（i）動物またはヒト由来の組織から常法により粗酵素液を得、硫安分画後透析した酵素液を、（ａ）コレステロールセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液で溶出して画分を集める工程、（ｂ）前記画分をヘパリンセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液（ＮａＣｌを含む）で溶出して画分を集める工程、により精製する（ただし（ａ）工程、（ｂ）工程はいずれを先に行ってもよい）。
（ii）動物またはヒト由来の組織から常法により粗酵素液を得、硫安分画後透析した酵素液を、（ａ）コレステロールセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液で溶出して画分を集める工程、（ｂ）前記画分をヘパリンセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液（ＮａＣｌを含む）で溶出して画分を集める工程、（ｃ）前記画分をキレーティングセファロースカラム（Ｃｕをリガンド）に吸着させ、酢酸緩衝液（イミダゾール含む）で溶出して画分を集める工程、（ｄ）前記画分をホスホリルコリン修飾シリカカラムに吸着（燐酸ナトリウム緩衝液を移動相とする）させ、分取する工程、により精製する（ただし（ａ）〜（ｄ）工程はいずれを先に行ってもよい）。
（９）ペプチド配列
上記（ii）の精製方法により得た画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、５０〜７０ｋＤａ領域で現出したバンドから得られたペプチド断片が、配列表の配列番号１のアミノ酸配列中、６５〜７８位、１０６〜１１１位、２３８〜２４２位、２８７〜２９９位、２８９〜２９９位、３１９〜３２７位、３２８〜３４０位、３６０〜３７０位、４２６〜４３７位、４３８〜４４６位、４７０〜４８１位、４８６〜４９２位における配列と同一のペプチド配列を少なくとも有する。
【請求項２】
マウスあるいはヒト由来である、請求項１記載の酵素。
【請求項３】
遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体とを含む系に、請求項１または２記載の酵素を添加して、ＣｏＡ、ＡＴＰ等の補酵素を用いることなくコレステロールエステルを生成する、コレステロールエステルの製造方法。
【請求項４】
請求項１または２記載の酵素を、生体中の遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させるために用いる、コレステロールエステル化酵素の使用。
【請求項５】
請求項１または２記載の酵素を用いて、生体中の遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させ、皮膚のしみ、しわを予防・防止する、および／または肌荒れを防止・改善する、皮膚改善方法。
【請求項６】
請求項１または２記載の酵素を用いて、生体中の遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させるための高脂血症治療薬の探索方法。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規コレステロールエステル化酵素およびその使用に関する。本発明は、おもに化粧料や試薬、診断薬、医薬品開発の技術分野で利用される。
【背景技術】
【０００２】
生体（臓器、血液、皮膚など）中に存在する脂肪酸やコレステロールは、生物が活動する上でのエネルギー源や生体膜などの構成成分として非常に重要な物質である。これらの代謝に関しては、従来から数多くの研究が行われており、コレステロールの貯蔵型として脂肪酸とのエステル（コレステロールエステル）の存在も知られている。
【０００３】
中でも皮膚に関する研究として、表皮中のコレステロールエステルの存在量が、特に角層において高いことを、Unna と Golodetz が報告している（1910年頃）。また、皮膚中でのコレステロールおよび遊離脂肪酸からコレステロールエステルへの変換活性に関する報告が、アイソトープラベルしたオレイン酸やコレステロールを用いた実験によりなされている（非特許文献１参照）。この遊離脂肪酸とコレステロールとからコレステロールエステルへの変換反応は、補酵素Ａ（ＣｏＡ）とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）により活性化を受けることが明らかになり（非特許文献２参照）、ラット肝臓での実験でも示唆されていたアシルＣｏＡを経由した転移反応であろうと結論している。同じくウシ乳房抽出液でも、同様にＣｏＡとＡＴＰ、Ｍｇ2+などの添加による効果が示されている（Askewら、"Lipids", 6, 326-331, 1971）。
【０００４】
実際、転移酵素としてＬＣＡＴ（レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ）とＡＣＡＴ（アシルＣｏＡ−コレステロールアシルトランスフェラーゼ）の２つのアシル基転移酵素が見出され、それぞれのｃＤＮＡクローニングが１９８６年（非特許文献３参照）と１９９３年（非特許文献４参照）になされた。ＬＣＡＴはおもに血中に存在して作用するのに対し、ＡＣＡＴは包皮はじめ小腸、肝臓など種々の組織に存在し、生体内のコレステロール量の調節に関与するとともに、血中からのコレステロールの吸収にも働くことから、高脂血症の治療薬のターゲットとしてその阻害剤の開発が進められている（非特許文献５参照）。
【０００５】
一方、ＡＣＡＴノックアウトマウスを用いた実験で、コレステロールエステル量の減少がそれほどでもなく、まだかなりの量のエステルが合成されていることが示され、ＡＣＡＴ以外の他のエステル化酵素の存在が示唆された（非特許文献６参照）。その後もＡＣＡＴのアイソザイムの報告（非特許文献７参照）もあるものの、さらなる別の酵素の存在も否定できない状況であった。
【０００６】
ところで皮膚での過度の遊離脂肪酸の存在は、にきびや肌荒れの原因となることが知られており、遊離脂肪酸を速やかに減少させる方法も必要である。遊離脂肪酸やコレステロールを含む皮脂全体量を抑制する薬剤の使用が有効な場合もあるが、それが過度になると乾燥肌の原因となり、特に皮脂の分泌量が低下している中高年にとっては必ずしも好ましくない。皮脂吸着性の粉体やパウダー等を使用する方法もあるが、必ずしも満足し得るものではなく、遊離脂肪酸を無害なコレステロールエステルに変換することが有効である。
【０００７】
また、高脂血症治療薬としては、現在コレステロール合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（＝ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ）に対する阻害剤の使用が主流を占めているが、これだけでは未だ十分に満足できる状況ではなく、新たに鍵となる代謝酵素の存在を発見し、新たな治療薬の開発が望まれている。
【０００８】
【非特許文献１】Freinkel and Aso, "J. Invert. Dermatol.", 52, 148-154, 1969
【非特許文献２】Freinkel and Aso, "Biochim. Biophys. Acta", 239, 98-102, 1971
【非特許文献３】McLeanら、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 83, 2335-2339
【非特許文献４】Changら、"J. Biol. Chem.", 268, 20747-20755
【非特許文献５】平川洋次、下川宏明著、「高脂血症治療薬」、日薬理誌、第１１８巻、３８９−３９５頁（２００１年）
【非特許文献６】Meinerら、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 93, 14041-14046, 1996
【非特許文献７】Andersonら、"J. Biol. Chem.", 273, 26747-26754, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記従来の技術のもつ問題点を解決するためになされたもので、生体中の遊離脂肪酸とコレステロールの量を制御する技術を開発することを目的とする。本技術を用いて肌荒れ防止・改善、しみ・しわの予防・防止、高脂血症治療薬への適用が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、従来知られていたＬＣＡＴ、ＡＣＡＴとは異なる酵素であって、遊離脂肪酸をアシルＣｏＡに変換することなくコレステロールと直接反応し、コレステロールエステルを生成する新規酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は次の性質を有する新規コレステロールエステル化酵素に関する。
（１）作用
補酵素の作用を介在させることなく、遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体とに直接作用して、コレステロールエステル生成（アシル基転移）反応を触媒する。
（２）基質特異性
遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体を基質として作用する。脂肪酸−ＣｏＡ複合体に対しては作用しない。
（３）分子量
ゲル濾過法による分子量が４０ｋＤａ〜４５ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が６０ｋＤａ〜７０ｋＤａである。
（４）作用ｐＨおよび至適作用ｐＨ
作用ｐＨは３．０〜７．０、至適ｐＨは４．０〜５．０に認められる。
（５）作用温度および至適温度
４〜６０℃の広い範囲で作用するが、作用至適温度は２０〜５０℃に認められる。
（６）熱安定性
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の下で、各温度で１０分間加熱処理した場合、３７℃以下でほとんど失活せず、８０℃でほぼ完全に失活する。
（７）活性影響
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のいずれによっても活性に影響を受けない。
（８）精製方法
下記（i）、（ii）のいずれかの方法により精製される。
【００１２】
（i）動物またはヒト由来の組織から常法により粗酵素液を得、硫安分画後透析した酵素液を、（ａ）コレステロールセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液で溶出して画分を集める工程、（ｂ）前記画分をヘパリンセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液（ＮａＣｌを含む）で溶出して画分を集める工程、により精製する（ただし（ａ）工程、（ｂ）工程はいずれを先に行ってもよい）。
【００１３】
（ii）動物またはヒト由来の組織から常法により粗酵素液を得、硫安分画後透析した酵素液を、（ａ）コレステロールセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液で溶出して画分を集める工程、（ｂ）前記画分をヘパリンセファロースカラムに吸着させ、酢酸緩衝液（ＮａＣｌを含む）で溶出して画分を集める工程、（ｃ）前記画分をキレーティングセファロースカラム（Ｃｕをリガンド）に吸着させ、酢酸緩衝液（イミダゾール含む）で溶出して画分を集める工程、（ｄ）前記画分をホスホリルコリン修飾シリカカラムに吸着（燐酸ナトリウム緩衝液を移動相とする）させ、分取する工程、により精製する（ただし（ａ）〜（ｄ）工程はいずれを先に行ってもよい）。
（９）ペプチド配列
上記（ii）の精製方法により得た画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、５０〜７０ｋＤａ領域で現出したバンドから得られたペプチド断片が、配列表の配列番号１のアミノ酸配列中、６５〜７８位、１０６〜１１１位、２３８〜２４２位、２８７〜２９９位、２８９〜２９９位、３１９〜３２７位、３２８〜３４０位、３６０〜３７０位、４２６〜４３７位、４３８〜４４６位、４７０〜４８１位、４８６〜４９２位における配列と同一のペプチド配列を少なくとも有する。
【００１４】
また本発明は、マウスあるいはヒト由来である、上記酵素に関する。
【００１５】
また本発明は、遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体とを含む系に、上記酵素を添加して、補酵素を用いることなくコレステロールエステルを生成する、コレステロールエステルの製造方法に関する。
【００１６】
また本発明は、上記酵素を、生体中の遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させるために用いる、コレステロールエステル化酵素の使用に関する。
【００１７】
また本発明は、上記酵素を用いて遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させるための薬剤の探索方法に関する。
【００１８】
また本発明は、上記酵素を用いて、生体中の遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させ、しみ、しわを予防・防止する、および／または肌荒れを防止・改善する、皮膚改善方法に関する。
【００１９】
また本発明は、上記酵素を用いて、生体中の遊離脂肪酸および／またはコレステロールを低減させるための高脂血症治療薬の探索方法に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により新規コレステロールエステル化（アシル基転移）酵素が提供される。本酵素を用いて、コレステロールエステルを安価に製造することができ、また体内の遊離脂肪酸やコレステロールの減少を図ることができる。さらには本酵素を用いて、肌のしみ・しわの予防・防止、肌荒れ抑制を図ったり、高脂血症などの治療薬の開発にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について詳述する。
【００２２】
本発明に係る酵素は、ＣｏＡ、ＡＴＰ等の補酵素の作用を介することなく、遊離脂肪酸とコレステロールまたはその誘導体とを基質として、コレステロールエステルの生成を触媒する活性を有する。本酵素は脂肪酸−ＣｏＡ複合体を基質としない。
【００２３】
本酵素の起源は、上記活性を有すれば特に限定されるものでないが、動物、特に哺乳類由来のものが好ましい。例えばヒト、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、モルモット、ハムスター、マウスなどが好適なものとして挙げられる。中でも、マウスとヒトがより好ましい。また、用いる器官も、上記活性を有する酵素が得られれば特に制限されるものではない。動物由来の培養細胞から得てもよく、これは初代培養でもよく、あるいは市販の細胞を用いてもよい。また、本酵素の使用に際しては、生体から抽出した状態でも、あるいは適当なカラムクロマトグラフィーなどで精製したものでもよい。あるいは本酵素をコードする遺伝子を取得し、それを適当な宿主、例えば酵母や動物細胞などに組み込んで発現させて得てもよい。
【００２４】
本酵素の基質として用いられる遊離脂肪酸としては、飽和および不飽和脂肪酸が挙げられ、例えばミリスチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、パルミトレン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などが挙げられる。中でも炭素数１６または１８で二重結合が０または１個の脂肪酸であるステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレン酸が好ましい。
【００２５】
本酵素の基質として用いられるコレステロールまたはその誘導体としては、コレステロールのほか、２４（Ｒ）−ＯＨ−コレステロール、７α−ＯＨ−コレステロール、２５−ＯＨ−コレステロール、２７−ＯＨ−コレステロール、７−ケトコレステロールなどが挙げられる。
【００２６】
内在性の脂肪酸またはコレステロールが多い等の理由で、反応の追跡が困難な場合には、アイソトープや蛍光物質などでラベルした基質を用いるのが好ましい。例えば14Ｃでラベルした脂肪酸や3Ｈでラベルしたコレステロールなどが市販されており、好適に使用できる。
【００２７】
本酵素による触媒反応はｐＨ３．０〜７．０の範囲で作用し、より好ましくはｐＨ３．０〜６．０であるが、至適作用ｐＨは４．０〜５．０に認められる。また反応温度は４〜６０℃であるが、至適温度は２０〜５０℃に認められる。触媒反応は、適当な緩衝液中に、遊離脂肪酸とコレステロールをエタノール溶液として添加し、５〜１０分間程度振盪または静置後、本発明酵素溶液を添加して行う。反応時間は通常１〜６０分間程度である。
【００２８】
反応生成物の検出については、コレステロールエステルが検出できる方法であれば特に限定されるものでないが、通常、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等が用いられる。この場合、反応液を有機溶媒、例えばクロロホルム：メタノール（２：１）溶液で抽出し、クロマトグラフィー処理を行えばよい。抽出に用いる溶媒量は、反応液の４〜１０倍程度が好ましい。
【００２９】
薄層クラマトグラフィーのゲルおよび展開溶媒は、脂肪酸、コレステロールまたはその誘導体、およびコレステロールエステルがそれぞれ分離され得るものであれば特に限定されるものでない。ゲルとしては通常、シリカゲル系が用いられ、例えば「シリカゲル６０」（メルク社）や「シリカゲル７０」（和光純薬社）等の市販品を用いることができる。展開溶媒としてはヘキサン：エーテル：酢酸＝８：２：０．１（質量比）、ヘキサン：エーテル：酢酸＝８：３：０．１（質量比）の混合溶媒などが好適に用いられる。発色は、ヨウ素などを用いればよい。
【００３０】
なお、本酵素のゲル化法により測定した分子量は４０ｋＤａ〜４５ｋＤａである。測定の具体例については後述の実施例７に示す。またＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した分子量は６０ｋＤａ〜７０ｋＤａである。測定の具体例については後述の実施例９以降に示す。
【００３１】
また、本酵素はｐＨ３〜８で保存することが好ましい。
【００３２】
また本酵素はＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、のいずれによっても活性に影響を受けない。また金属イオンにより活性は影響を受けない。これら活性影響についての具体例については後述の実施例５に示す。
【００３３】
また本酵素の精製方法の具体例については、後述の実施例４に示す。
【００３４】
本酵素はコレステロールエステルの製造にも応用可能なほか、皮膚に刺激がある遊離脂肪酸の除去にも有用と考えられる。例えば本酵素の活性促進剤を皮膚に塗布することで、肌荒れを防止・改善することが期待できる。また、生体中のコレステロール濃度低下や高脂血症などにも応用可能である。特に既知のＡＣＡＴとは異なる酵素であるため、従来効き目が弱かった患者に対しても、有用な素材が提供できる可能性が期待できる。さらに本酵素の遺伝子を取得することでその発現を高める薬剤を得ることができれば、同様の効果が期待できる。
【００３５】
すなわち本酵素を使用することで、ＣｏＡやＡＴＰなど高価で不安定な補酵素類を必要とせずに生体内の遊離脂肪酸とコレステロール量を制御することが可能となり、本酵素を用いて薬剤の探索（スクリーニング）を行い、遊離脂肪酸やコレステロールに起因するにきびや肌荒れの防止剤の開発が可能となる。例えば、本酵素溶液に種々の植物エキスや化学合成化合物の溶液を加えて反応を行い、コレステロールエステルへの変換反応を高める薬剤をスクリーニングする。これで得たエキスまたは化合物を皮膚外用剤として配合することができる。
【００３６】
さらには、コレステロールエステルの安価な製造にも用いることが可能であろう。コレステロールエステルには保湿作用があることが知られており（例えば、服部信明、"Fragrance Journal"、臨時増刊、185-190、2000）、これを配合した外用剤の開発にも適用できる。また、本酵素を用いた薬剤の探索（スクリーニング）による高脂血症治療薬など医薬品への展開も可能であろう。
【００３７】
［実施例］
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。なお、これらの実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
［マウス皮膚抽出液中の遊離脂肪酸―コレステロールエステル化酵素（Fatty acid:cholesterol acyltransferase；以下「ＦＣＡＴ」と記す）の検出］
ヘアレスマウス（ＨＲ−１、星野動物）の背中部位から、皮膚をはさみにて切除した。０．５ｇの皮膚に対し２ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を用いて、ガラスホモジナイザーで１分間破砕した。次いでこれを１５ｍｌ容チューブに移し、超音波破砕（Astrason sonifier）を行った。遠心（９，０００ｒｐｍ、１０分間）後、上清を回収し、この上清に８０％飽和になるよう硫安を添加した。４℃で３時間放置後、遠心し、沈澱物を回収した。
【００３９】
この沈殿物を２ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解後、２００ｍｌの同緩衝液に対し透析を行った（スペクトラ／ポア メンブラン、分画分子量１２，０００〜１４，０００）。４℃で一晩放置後、中の溶液を回収し、粗酵素液とした。
【００４０】
この粗酵素液を反応液として用いて、下記の実験を行った。
【００４１】
まず、反応液量と反応時間を変えて反応させ、酵素反応であるかどうかを調べた。反応は次のように行った。
【００４２】
すなわち、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μｇコレステロール（２μｌエタノール溶液）、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン。脂肪酸フリーのもの使用。ナカライテスク社）および２００，０００ｃｐｍ（１０μＭ）の［１−14Ｃ］オレイン酸（１．２μｌエタノール溶液。パーキンエルマー社）を混合して溶液（０．２ｍｌ）を調製し、３７℃で５分間プレインキュベーションした。
【００４３】
この溶液に上記粗酵素液（反応液）を添加して反応させた（３７℃、ｐＨ４．５）。反応時間、粗酵素液量（反応液量）を種々変えて反応を行った。反応時間を変える場合には、粗酵素液を２０μｌ添加後、５〜３０分間の間で変えて反応を行った。また反応液量を変える場合には、粗酵素液量を１０〜６０μｌの間で変え、１０分間反応を行った。反応には１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブを用いた。
【００４４】
反応後、０．５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液を添加し、よく混和して、基質と生成物を抽出した。これを遠心後、上清を別の容器にあけ、さらに０．５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液で抽出した。クロロホルム：メタノール（２：１）溶液を含む有機層をガラスチューブに回収し、一晩放置して溶媒を除去した。これを１０μｌのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液でよく混和した後、薄層クロマトグラフィー法にてアルミ板シリカプレート（アルドリッチ社）上にスポットした。展開溶媒は、ヘキサン：エーテル：酢酸（８：２：０．１）（質量比）の混合溶媒を用いた。
【００４５】
対照として、ラベルしていないオレイン酸コレステロールとオレイン酸を同時にスポットした。
【００４６】
展開後、ヨウ素噴霧によりスポットを発色させて同定を行い、それぞれスポット部分をはさみで切り取りガラス容器に入れ、液体シンチレータ５ｍｌを添加してシンチレーションカウンター（ベックマン社「ＬＳ６０００ＴＡ」）にて５分間カウントして、下記式によりコレステロールエステル変換率を算出した。
【００４７】
【００４８】
酵素無添加の試料の変換率（％）を差し引き、真の変換値を求めた。結果を図１ａ、１ｂに示す。
【００４９】
図１ａは、マウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）の反応液量とコレステロールエステル変換率の関係（ｐＨ４．５、３７℃、１０分間）を示すグラフである。横軸は反応液量（μｌ）を、縦軸はコレステロールエステル変換率（％）を、それぞれ示す。図１ｂは、マウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）の反応時間とコレステロールエステル変換率の関係（ｐＨ４．５、３７℃）を示すグラフである。横軸は反応時間（分）を、縦軸はコレステロールエステル変換率（％）を、それぞれ示す。図１ａの結果から明らかなように、粗酵素液量（反応液量）がふえるにつれ、コレステロールエステル変換率が上昇した。また図１ｂの結果から明らかなように、反応時間がふえるにつれ、コレステロールエステル変換率が上昇した。
【００５０】
なお、別途上記粗酵素液を８０℃、１０分間処理して熱変性させた後、３７℃で１０分間反応させたが、コレステロールエステル変換率は上昇しなかった（＜０．０２％）ことから、活性本体はタンパク質であろうと推定できた。
【００５１】
また、上記マウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）を用いて、反応時間を１０分間、ｐＨ４．５として、反応の温度依存性を調べたところ、図２に示すように、３７℃で高いコレステロールエステル変換率が得られることが明らかになった。このことから、本反応は酵素によることがより確実となった。
【実施例２】
【００５２】
［ヒト角層抽出液中のＦＣＡＴの検出］
ヒト背部および上腕より、日焼け角層を採取した。この角層０．３ｇに１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）１．０ｍｌを加え、実施例１と同様に、ガラスホモジナイザーおよび超音波破砕を行った。遠心分離後、その上清をとり粗酵素液とした。該粗酵素液２０μｌを用いて、実施例１と同様にして、ただしｐＨを変えて、３７℃、１０分間反応し、コレステロールエステル変換率を求めた。そのときのｐＨ依存性を示すグラフを図３に示す。図３から明らかなようにｐＨ４〜５で活性が最大となった。
【実施例３】
【００５３】
［ＦＣＡＴ精製用コレステロールセファロースゲルの調製］
福山と三宅らの方法（"J. Biochem.", 85, 1183-1193, 1979）に従い、コレステロールセファロースゲルを調製した。ＥＡＨセファロース４Ｂゲル（アマシャムバイオサイエンス社）５ｍｌを、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液４００ｍｌでガラス濾過器を用いて洗浄した。一方、コレステロールヘミスクシネート（シグマ社）２５ｍｇを１２．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、ＨＣｌでｐＨを４．７に調整した。ここに０．７５ｍｌの MilliQ水に溶解したＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）２５０ｍｇと上述のゲルを添加し（５０ｍｌ容チューブ内）、一晩振盪反応した。反応後、５０％ジメチルホルムアミド溶液１２０ｍｌで洗浄しゲルを回収した。
【実施例４】
【００５４】
［マウス皮膚抽出液中のＦＣＡＴの部分精製］
マウス皮膚２．０ｇから、実施例１記載の方法に従いガラスホモジナイザーおよび超音波破砕を行い、粗抽出液７．８ｍｌを得た。
【００５５】
これに３０％飽和になるよう硫安を添加し、４℃で２時間放置した。次いで遠心により上清（８．１ｍｌ）を回収した。この上清に８０％飽和になるよう硫安を添加し、４℃で３時間放置した。遠心により沈澱を回収後、４ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。これを５００ｍｌの同緩衝液に一晩透析（スペクトラ／ポア メンブラン）した。
【００５６】
透析チューブから酵素液を回収後、実施例３にて調製したコレステロールセファロースカラム（あらかじめ２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０で平衡化、ゲル２ｍｌ）に吸着させた。４０ｍｌの同緩衝液で洗浄後、１２ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出した。
【００５７】
画分を集め、「セントリプラス−１０」（分画分子量１００００、ミリポア）で３ｍｌまで濃縮した。これを４００ｍｌの５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に一晩透析し、脱塩した。
【００５８】
上記処理後の液を、すでに透析緩衝液で平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（ゲル２ｍｌ、アマシャムバイオサイエンス社）に添加した。２４ｍｌの平衡化用緩衝液で洗浄し、ＦＣＡＴ画分を回収し、「セントリプラス−１０」で濃縮した（１．３ｍｌ）。精製ステップを表１に示す。なおタンパク質量はＢｉｏ Ｒａｄ社のキットにより、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いた検量線で換算した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１に示す結果から明らかなように、３つの工程により約２０倍にＦＣＡＴを精製した。
【実施例５】
【００６１】
［マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴの性質］
実施例４に従って部分精製したＦＣＡＴの性質を調べた。１回の反応には０．８３（ｐｍｏｌ／分）の活性分の酵素（１０μｌ）を用い、ｎ＝２の平均値で示した。
【００６２】
まず、ｐＨ依存性を調べた。結果を図４に示す。同図中、縦軸は相対活性（％）を、横軸はｐＨを、それぞれ示す。酢酸緩衝液およびヘペス緩衝液で行った。ヒト角層由来ＦＣＡＴと同様に、至適ｐＨは４〜５付近であった。また熱（８０℃、１０分間処理）で失活した。
【００６３】
続いて、ＣｏＡとＡＴＰ添加効果を調べた（ｐＨ４．５、３７℃、２０分間）。結果を図５に示す。ＡＴＰの添加量は２．５ｍＭ、ＣｏＡの添加量は０．２５ｍＭとし、同時に４ｍＭ ＭｇＣｌ2を加えたが、いずれの添加でもコレステロールエステル変換率はほとんど変わらなかった。ＣｏＡ、ＡＴＰおよびＭｇはアシルＣｏＡシンセターゼの補因子であることから、本酵素試料中にはアシルＣｏＡを経由してコレステロールエステルを生成する活性は存在しないと考えられた。
【００６４】
また、ＡＣＡＴ阻害剤として報告のあるグリベンクラミド（Ohgamiら、"Biochem. Biophys. Res. Commun.", 277, 417-422, 2000）を添加して、阻害の有無を調べた（ｐＨ４．５、３７℃、２０分間）。結果を図６に示す。同図から明らかなように、マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴはグリベンクラミドの添加により残存活性が減少することが判明した。
【００６５】
さらに、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）および金属イオン添加の影響を調べた（ｐＨ４．５、３７℃、２０分間）。結果を図７に示す。同図から明らかなように、ＥＤＴＡ、ＤＴＴによる阻害はみられず、金属イオン添加効果もほとんどないことから、活性に金属イオンは関与しないことが推察された。ＡＣＡＴはＤＴＴにより活性が高まるとの報告がある（生物薬科学実験講座３「脂質 III」、井上圭三、中川靖一編、ｐ１６２、廣川書店、２００２年）ので、ＦＣＡＴはＡＣＡＴとは異なる酵素であることが示された。
【００６６】
また、オレイン酸の代わりに［１−14Ｃ］パルミチン酸と［１−14Ｃ］リノレン酸（いずれもパーキンエルマー社）を用いて、基質特異性を調べた（ｐＨ４．５、３７℃、２０分間）。結果を図８に示す。マウスＡＣＡＴ−１ではオレオイル−ＣｏＡ＞パルミトイル−ＣｏＡ＞リノレオイル−ＣｏＡであると報告されている（Casesら、"J. Biol. Chem."，273，26755−26764，1998）が、図８から明らかなように、脂肪酸部分で考えると、ＦＣＡＴではオレイン酸＞パルミチン酸＞リノレン酸（多価二重結合）であり、同様の傾向であると考えられる。
【実施例６】
【００６７】
［マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴ画分を用いてのＡＣＡＴ活性測定］
部分精製ＦＣＡＴ画分にはＡＣＡＴが含まれないことを直接確認するために、ＡＣＡＴ活性の測定を行った。
【００６８】
試料として、実施例１で得たマウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）、実施例４で得たマウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴ画分を用いた。またＡＣＡＴの試料（ポジコン）としては、マウス肝臓からの抽出液（マウス肝臓８０％硫安・透析試料）を用いた。測定は常法（例えば、Uelmenら、"J. Biol. Chem.", 270, 26192-26201, 1995）に従った。
【００６９】
すなわち、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中、［１−14Ｃ］オレオイル−ＣｏＡ（８０，０００ｃｐｍ、８μＭ、アマシャムバイオサイエンス社）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μｇコレステロール、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（脂肪酸フリー）を添加し、３７℃で５分間放置した。
【００７０】
次いで試験溶液（酵素溶液）を添加し、３７℃で２０分間反応させた後、有機溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）０．５ｍｌを添加し、反応停止と同時に、生成物であるコレステロールエステルの抽出を行った。抽出後の水層にさらに０．５ｍｌの溶媒を添加し、再度抽出した。水層のカウントを未反応の基質量（ｃｐｍ）とした。一方、有機層を回収し、乾固後、１０μｌのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解し、薄層シリカゲルにスポットした。乾燥後、ヘキサン：エーテル：酢酸＝８：２：０．１混合溶液で展開した後、コレステロールエステル相当のスポットを回収してカウントを測定し、それぞれのコレステロールエステル変換率を調べた。結果を表２に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
表２の結果から明らかなように、マウス肝臓８０％硫安・透析試料（ＡＣＡＴの試料）ではＡＣＡＴ活性（コレステロールエステル変換）がみられるのに対し、マウス皮膚硫安・透析試料および部分精製品ではＡＣＡＴ活性（コレステロールエステル変換）は非常に低いことが明らかになった。これより、ＡＣＡＴとＦＣＡＴは異なる酵素であると判断できる。
【実施例７】
【００７３】
［マウス皮膚由来ＦＣＡＴの分子量の測定］
「スーパーロース１２カラム」（１．０×３０ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社）を用いたゲル（アガロース担体ゲル）濾過法により、マウスＦＣＡＴの分子量を測定した。緩衝液は、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、流速０．５ｍｌ／分で行った。分子量マーカーおよびＦＣＡＴ活性の溶出位置から、分子量は４０ｋＤａ〜４５ｋＤａと推定された。これはマウスＡＣＡＴの分子量である６４ｋＤａ（Uelmenら、"J. Biol. Chem.", 270, 26192-26201, 1995―ただしｃＤＮＡからの推定値）よりも小さい値である。
【実施例８】
【００７４】
［ヒト成人乳房由来角化細胞およびヒト成人皮膚由来線維芽細胞から調製した抽出液中のＦＣＡＴ活性の検出］
標記培養細胞はクラボウ社から購入した。角化細胞については凍結細胞（５×１０5個）を１０ｍｌのＨｕＭｅｄｉａ ＫＧ２培地（クラボウ社）に懸濁し、７５ｃｍ2のフラスコ１本に植えた。１、３、５日後に培地交換し、７日後にトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理後、遠心により細胞を回収した（１．９×１０6個）。１０ｍｌのＰＢＳ（phosphate-buffered saline）で２回洗浄後、７ｍｌのＰＢＳに懸濁した。
【００７５】
また、線維芽細胞については凍結細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭ［１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含む］培地（インビトロジェン社）に懸濁し、７５ｃｍ2のフラスコ１本に植えた。１、３、５日後に培地交換し、７日後にトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理後、遠心により細胞を回収した（３．６×１０6個）。これもＰＢＳで２回洗浄後８ｍｌのＰＢＳに懸濁した。
【００７６】
両者ともに超音波破砕し、そのままこの液を抽出液とした。活性およびタンパク質濃度の測定法は、それぞれ実施例１、実施例４に記載の方法で行った。またＡＣＡＴ活性についても、実施例６に従って測定した。結果を表３に示す。比較として、マウス皮膚抽出液の活性も示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
表３の結果から明らかなように、ＡＣＡＴは両者で確認されたのに対し、ＦＣＡＴ活性は角化細胞抽出液のみで確認された。このように、ＡＣＡＴとは組織による活性の様式が異なることが示された。
【実施例９】
【００７９】
［マウス皮膚由来ＦＣＡＴの同定］
実施例４記載の方法に準じて、マウス皮膚４．０ｇから、酵素粗抽出液、硫安・透析（３０％飽和、８０％飽和）、コレステロールセファロースカラム、ヘパリンファロースカラムのステップを経て、ＦＣＡＴを部分精製した。この部分精製画分からＦＣＡＴのさらなる精製・同定を行うこととした。
【００８０】
まず、０．１Ｍ ＣｕＳＯ4溶液を添加しＣｕをリガンドとしたキレーティングセファロースＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社）を調製した。次いで部分精製酵素に、０．５Ｍ 濃度になるよう２Ｍ ＮａＣｌを添加し、これを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したキレーティングセファロースＦＦカラム（３ｍｌゲル）に添加した。５ｍＭのイミダゾールを含む酢酸緩衝液で洗浄後、１０ｍＭイミダゾールを含む酢酸緩衝液でＦＣＡＴの溶出を行った。
【００８１】
この画分を集め、「セントリプラス−３０」および「セントリカットミニ−３０」（ともにアミコン）で２１０μｌにまで濃縮した。ここまでの各精製ステップでの試料を、１０％アクリルアミド濃度のゲル（テスコ）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて解析した。結果を図９に示す。染色は銀染色キット（和光純薬）を用いた。
【００８２】
図９のレーン５に示すように、まだバンドが何本か存在するため、さらに精製を行うこととした。種々のカラムを検討した結果、ホスホリルコリン修飾シリカカラム（４．６×２５０ｍｍ、資生堂）で分画することにより、溶出ピークが数本に分けられることが判明した（図１０参照）ため、このカラムを用いることとした。
【００８３】
このホスホリルコリン修飾シリカカラムは、ホスホリルコリン基が担体（球状多孔質シリカゲル等）表面に直接的に化学結合しているクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣ用カラムに使用したもので、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少ない上に高い分離能力を発揮する。なお上記クロマトグラフィー用充填剤は本出願人により従前に出願されている（特願２００３−０５２３０５号明細書）。
【００８４】
このホスホリルコリン修飾シリカカラム（以下、「ＰＣカラム」とも記す）には、上記キレーティングセファロースカラムにより得た酵素画分２１０μｌのうち、７６μｌを用いた。０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を移動相とし、上記した７６μｌ分を１３回に分けて試料を添加して、ピーク部分を分取した。
【００８５】
それぞれの画分を集め、再びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った結果（銀染色）を示す（図１１）。同図において、ＦＣＡＴ活性は画分１（レーン３）に存在しており、画分２（レーン４）の６５ｋＤａの主要なタンパク質にはＦＣＡＴ活性は存在しないことが判明した。そこで、この画分１（レーン３）を集めて「セントリカットミニ−３０」で濃縮および脱塩を行った。
【００８６】
【表４】
【００８７】
表４に示すように、ＰＣシリカカラム処理によって比活性はかなり高まったが、図１１のレーン３に示すとおり、まだ７０ｋＤａ〜５０ｋＤａまでバンドが少なくとも４本あることが判明した。ＦＣＡＴのタンパク質がどのバンドに相当するのか、さらに精製を進めるため種々のカラムを検討したが、イオン交換カラムやゲル濾過カラムではこれ以上の分離は非常に困難であった。そこで、タンパク質の同定は、試料を電気泳動の後、タンパク質のバンドを切り取り、ゲル内でトリプシン消化後、抽出し、ＬＣ−ＭＳで断片を分析し、それをデータベース上で検索して、同定することとした。
【００８８】
まず試料［７０ｋＤａ、６２ｋＤａ、５５ｋＤａ、５０ｋＤａの４本のバンド（図１１のレーン３）、およびＰＣカラムでＦＣＡＴとは異なる画分に含まれる６５ｋＤａの計５本］をヨード酢酸でカルボキシメチル化した後、ＳＤＳアクリルアミドゲル（１０％アクリルアミド）にのせた。ゲルおよびマーカーは上記と同じものを用いた。電気泳動後 MilliQ水で３回洗浄し、シンプリーブルーステイン（invitrogen）による染色を行った。切り取ったバンドをアセトニトリルで洗浄後、炭酸水素アンモニウム中、３７℃で一晩トリプシン（アマシャムバイオサイエンス社）消化を行った。ギ酸溶液を添加して反応停止後、充分混合し、遠心した後、上清を回収した。残りのゲルにアセトニトリルを３０％含む０．１％ギ酸溶液、次いで、アセトニトリルを６０％含む０．１％ギ酸液を添加・混和してペプチドを抽出し、遠心後、上清を回収して、ＬＣ−ＭＳによる分析を行った。
【００８９】
検出されたペプチド断片の配列を、ＮＣＢＩのマウスタンパク質データベースで検索し、一致する配列の多い順番に並べて、可能性の高いものを調べた。
【００９０】
その結果、７０ｋＤａのバンドはエステラーゼ１という酵素に最も相同性が高いという結果が得られ、検索結果の２位、３位はケラチンであった。６２ｋＤａのバンドは検出されたペプチドが少なくて同定できず、５５ｋＤａと５０ｋＤａのバンドはともにセリンプロテアーゼインヒビターであった。また、６５ｋＤａのバンドはアルブミンが第一候補となった。酵素が候補になったのは７０ｋＤａのバンドのみであり、しかも一致する配列が２０％を超えており、７０ｋＤａのバンドはエステラーゼ１である可能性が極めて高いと考えられた。
【００９１】
エステラーゼ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される配列である。上記７０ｋＤａのバンドの分析で得られたペプチド断片の配列の中で、エステラーゼ１のアミノ酸配列（配列表の配列番号１のアミノ酸配列）と一致する配列をもつペプチド断片は以下のとおりである。
【００９２】
断片１： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号６５位（Phe）〜７８位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９３】
断片２： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号１０６位（Glu）〜１１１位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９４】
断片３： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号２３８位（Asp）〜２４２位（Arg）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９５】
断片４： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号２８７位（Gln）〜２９９位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９６】
断片５： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号２８９位（Thr）〜２９９位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９７】
断片６： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号３１９位（Ala）〜３２７位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９８】
断片７： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号３２８位（Ser）〜３４０位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【００９９】
断片８： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号３６０位（Met）〜３７０位（Arg）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【０１００】
断片９： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号４２６位（Asp）〜４３７位（Arg）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【０１０１】
断片１０： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号４３８位（Tyr）〜４４６位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【０１０２】
断片１１： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号４７０位（Glu）〜４８１位（Lys）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【０１０３】
断片１２： 配列表の配列番号１のアミノ酸番号４８６位（Phe）〜４９２位（Arg）までのアミノ酸配列を示すペプチド断片。
【０１０４】
上記断片１〜１２のＭＨ+（陽イオン化した時の分子量）、分子量全体に占める当該ペプチド断片の質量％、ＡＡ％（タンパク質全体のアミノ酸数に占める当該ペプチド断片のアミノ酸数）は、下記表５に示すとおりである。なお７０ｋＤａのバンドとの対比（相同性）において、エステラーゼ１以外の候補はケラチンであり、酵素はＡＣＡＴやＬＣＡＴを含め、全く出てこなかった。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
エステラーゼ１はマウスの主要なエステラーゼ（EC.3.1.1.1）として知られ、５５４アミノ酸からなる糖タンパク質（６５ｋＤａ）である（例えばT.H.Finlay et al., J. Biol. Chem., 257, 10914-10919, 1982; S.S. Kadner, et al., J. Biol. Chem., 260, 15604-15609, 1985; T.L. Genetta et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 1364-1370, 1988など）。血中および肝臓などでの存在が知られており、基質特異性も広くエストロゲンの代謝にも関わっていることが判明している。しかしながら、皮膚での存在は知られておらず、今回我々が見出した、コレステロールと遊離脂肪酸のエステル形成に関わることは知られていない。
【０１０７】
一方、マウスでのコレステロールエステルの分解は、コレステロールエステラーゼ（EC.3.1.1.13）によって触媒されることが明らかにされている。このコレステロールエステラーゼは、エステラーゼ１とは異なり、５９３アミノ酸からなり（K. Mackay et al., Gene, 165, 255-259 1995）、おもに膵臓で働くこと、胆汁で活性化されるいわゆるbile salt-stimulated lipaseといわれる酵素（リパーゼ）と同一であることも判明している（J. Nilsson et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550, 1990）。当該リパーゼは、in vitroでコレステロールと遊離脂肪酸からコレステロールエステルの合成を触媒することが知られている（E.M. Kyger et al., Biochemistry, 29, 3853-3858, 1990）。
【０１０８】
今回、皮膚からの粗酵素抽出液精製過程で活性画分が分離されることはなかったので、皮膚でのコレステロールエステル生成には、コレステロールエステラーゼではなく、ＦＣＡＴと極めて相同性が高いエステラーゼ１が主要な働きをしていると考えられる。
【実施例１０】
【０１０９】
［精製画分を用いた合成基質分解活性の確認］
エステラーゼ１に関しては、合成ペプチド基質の分解活性を有することが報告されている（S.S. Kandner et al., J. Bio. Chem., 260, 15604-15609, 1985）ことから、同様の活性を有するかどうかを調べた。上記文献に記載されているβ−アラニン−ニトロフェニルエステルは市販品が製造中止となっていたため、類似のBoc−アラニン−ニトロフェニルエステル（シグマアルドリッチ）を用いた。
【０１１０】
すなわち、２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）存在下、３０ｍＭになるよう５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した基質溶液を１／１００量（終濃度０．３ｍＭ）添加した後、２５℃で５分間保温した。その後、本酵素溶液２０μｌを添加し（計３．０ｍｌ）、２５℃で活性を測定した。測定装置はＪＡＳＣＯ Ｖ−５６０分光光度計を用いた。ニトロフェニル基の遊離に伴う吸光度の増加を経時で観察した（測定波長４０５ｎｍ）。結果を図１２に示す。同図において、縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を、横軸は時間（秒）を示す。その結果、上記精製酵素（ＰＣカラムの画分１。図１１の「レーン３」）添加により、吸光度の増加が確認された（図１２中、「ＰＣ−１」で示すグラフ）。一方、ＦＣＡＴ活性の少ない画分２（ＰＣカラム。図１１の「レーン４」）では吸光度の増加は少なかった（図１２中、「ＰＣ−２」で示すグラフ）。
【実施例１１】
【０１１１】
［マウス背部への紫外線照射によるＦＣＡＴ活性、並びにコレステロールエステル化比率への影響］
紫外線（ＵＶＢ）照射によりシワ形成を誘導したマウスのＦＣＡＴ活性を測定し、ＵＶ未照射のものとの比較を行った。すなわち、ＳＫＨ−１ヘアレスマウス（日本チャールス・リバー）背部に１０週間紫外線を１日あたり２〜８分間照射し（紫外線照射装置： ＤＥＲＭＡＲＡＹ Ｍ−ＤＭＲ−１００、ランプ型番：ＦＬ２０Ｓ−Ｅ−３０／ＤＭＲ ７本並列）、シワを形成させた。８週間経過後、マウス（５個体）背部の皮膚を切除し、冷凍保存した。コントロール（対照群）としては、ＵＶ未照射で同じ生育条件のもの（４個体）を用いた。
【０１１２】
保存した皮膚０．５ｇをはさみで切除・細断後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２．０ｍｌを添加し、ガラスホモジナイザーで破砕した。１５ｍｌ容チューブに移し、さらに超音波破砕をした後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を回収して、活性測定を行った。反応条件は実施例１と同様に行った。その結果、紫外線未照射群のＦＣＡＴ比活性の平均値は３８．５（ｐｍｏｌｅ／ｍｉｎ・ｍｇ）、照射群のＦＣＡＴ比活性の平均値は３２．４（ｐｍｏｌｅ／ｍｉｎ・ｍｇ）であった。この結果から、紫外線照射によりＦＣＡＴ活性は低下すると考えられる。
【０１１３】
さらに、皮膚中の遊離コレステロールとエステル化されたコレステロールの比率を調べ、定量した。まず、皮膚０．２５ｇを切除し、細断後、２ｍｌのヘキサンに一晩浸漬してコレステロール類を抽出した。皮膚残渣を除去後、１０ｍｌ容ガラスチューブ内で風乾によりヘキサンを除いた。１００μｌのエタノールに溶解後、遊離コレステロールおよび総コレステロールを、それぞれデタミナーＬ ＦＣキットおよびデタミナーＴＣ−５５５キット（以上、いずれも協和メデックス社製）を用いて定量した。総コレステロールから遊離コレステロールを除いた値をコレステロールエステルとした。
【０１１４】
その結果、紫外線未照射群のコレステロールエステル化比率は５６％、照射群の比率は５３％であり、ＵＶ照射によりＦＣＡＴ活性とともに、エステル化の比率も低下していることが明らかになった。ヒト背部への紫外線照射により、皮膚中のコレステロールのエステル化比率が低下するという報告がある（M. Gloor et al., Dermatologia, 154, 5-13, １９７７）が、それと一致するデータである。このことから、肌状態が悪化するとＦＣＡＴ活性並びに皮膚でのコレステロールのエステル化比率が低下することが関連付けられた。
【実施例１２】
【０１１５】
［加齢および紫外線照射によるエステラーゼ１発現量への影響］
生育８週、２０週、４０週、６０週、８７週齢のＨＲ−１マウス（２０週齢のみ２個体、他は３個体）の皮膚を切除し、ＲＮＡを調製した。これを用いてマイクロアレイ（アジレント社）でエステラーゼ１の発現量を解析した。結果を表６に示す。なお表６では８週齢のものを１．０として表した。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
表６に示す結果から明らかなように、週齢を重ねるごとにエステラーゼ１の発現量は減少する傾向がみられた。
【０１１８】
一方、肝臓や膵臓等でコレステロールの代謝に関わっているとされる酵素であるコレステロールエステラーゼは、皮膚ではほとんど発現がみられなかった。
【０１１９】
また、同様の実験をしみモデル［Ｆ１マウス、ＨＲ−１（雌）×Ｈｒ／Ｄｅ（雄）、星野動物］において行った。３個体について、背部の半分に紫外線を照射、残りの半分は未照射という条件にし、それぞれの背部の皮膚を切除してＲＮＡを調製後、エステラーゼ１の発現量をマイクロアレイで解析した。その結果、エステラーゼ１の発現量は未照射部分を１．０とすると照射部分では０．８２と低下していることが判明した。このことは、ＦＣＡＴとエステラーゼ１が同一と仮定すると、実施例１１で示した、紫外線照射により皮膚中のＦＣＡＴ活性が低下することと一致していた。
【実施例１３】
【０１２０】
［コレステロールエステルの塗布効果］
コレステロールエステルによる肌バリアー機能による向上を、水分蒸散量（ＴＥＷＬ値）と水分保持量を指標として観察した。１質量％オレイン酸、１質量％コレステロール、および１質量％オレイン酸コレステロール（和光純薬、いずれもエタノール溶液）を、それぞれ１００μｌずつを丸型布片に染み込ませたパッチテスト用絆創膏（鳥居薬品）を、男性パネル前腕部１名に貼布し、２時間閉塞を行った。６日間継続後、その翌日に「ＴＥＷＡ ｍｅｔｅｒ ＴＭ２１０」にて測定を行った。結果を表７に示す。
【０１２１】
【表７】
【０１２２】
表７に示す結果から明らかなように、オレイン酸やコレステロールに比較して、オレイン酸コレステロールではＴＥＷＬ値の上昇が抑制されていた。
【０１２３】
コレステロールエステルは、その材料であるコレステロールと脂肪酸に比較して疎水性が高く、皮膚のバリアーを高め水分蒸散量を抑える効果をもつ。このことから、コレステロールエステル自体を化粧品に配合することにより、そのバリアー機能を発揮させることも可能と想定される一方、その疎水性の高さゆえ、配合に非常な制限がかかる。特に化粧水など水分含量の高いものには配合がかなり難しい。そのことからも、皮膚中のコレステロールエステルの合成に関わるＦＣＡＴの活性を高めることによって、コレステロールエステル量を上げることは、非常に意義深いことである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１ａ】マウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）の反応液量とコレステロールエステル変換率との関係を示すグラフである。
【図１ｂ】マウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）の反応時間とコレステロールエステル変換率との関係を示すグラフである。
【図２】マウス皮膚由来ＦＣＡＴ（硫安・透析試料）の反応温度とコレステロールエステル変換率との関係を示すグラフである。
【図３】ヒト角層由来ＦＣＡＴのｐＨ依存性を示すグラフである。
【図４】マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴのｐＨ依存性を示すグラフである。
【図５】マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴへのＣｏＡ、ＡＴＰの添加の影響を示すグラフである。
【図６】マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴへのグリベンクラミド添加の影響を示すグラフである。
【図７】マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴに対するＥＤＴＡ、ＤＴＴおよび金属イオン添加の影響を示すグラフである。
【図８】マウス皮膚由来部分精製ＦＣＡＴの遊離脂肪酸の基質特異性を示すグラフである。
【図９】マウス皮膚由来粗酵素液を用いて、キレーティングセファロースカラムによる分画までの各精製段階における試料の電気泳動図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す写真（図面代用写真）である。
【図１０】ホスホリルコリン修飾シリカカラム（ＰＣカラム）での溶出パターン（２１０ｎｍ波長で測定）を示すグラフである。
【図１１】マウス皮膚由来粗酵素液を用いてホスホリルコリン（ＰＣ）シリカカラムによる分画までの各精製段階における試料の電気泳動図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す写真（図面代用写真）である。
【図１２】ホスホリルコリン修飾シリカカラム（ＰＣカラム）精製試料によるＢｏｃ−アラニン−ニトロフェニルエステル分解活性を示すグラフである。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００００１９５９
【氏名又は名称】株式会社資生堂
【住所又は居所】東京都中央区銀座７丁目５番５号
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| 【出願日】 |
平成１６年４月２２日（２００４．４．２２） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００９８８００
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 洋子
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| 【公開番号】 |
特開２００４−３３７１６５（Ｐ２００４−３３７１６５Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１６年１２月２日（２００４．１２．２） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−１２７４３７（Ｐ２００４−１２７４３７） |
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