| 【発明の名称】 |
黒麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子 |
| 【発明者】 |
【氏名】石田 博樹
【住所又は居所】京都市伏見区片原町３００ 月桂冠株式会社総合研究所内
【氏名】秦 洋二
【住所又は居所】京都市伏見区片原町３００ 月桂冠株式会社総合研究所内
【氏名】川戸 章嗣
【住所又は居所】京都市伏見区下鳥羽小柳町２４ 月桂冠株式会社総合研究所内
【氏名】杉並 孝二
【住所又は居所】京都市伏見区片原町３００ 月桂冠株式会社内
【氏名】安部 康久
【住所又は居所】京都市伏見区片原町３００ 月桂冠株式会社内
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| 【要約】 |
【課題】
【解決手段】黒麹菌のフェリクローム生合成クラスターを形成する、オルニチンモノオキシゲナーゼ、ペプチドシンテターゼ蛋白質が明らかにされ、これをコードする遺伝子、すなわち、ｎｓｂ１、ｎｓｂ２のクローニングが行われ、そのその塩基配列も決定された。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つフェリクローム生合成クラスターを形成するオルニチンモノオキシゲナーゼ蛋白質。
【請求項２】 以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質：（ｃ）配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つフェリクローム生合成クラスターを形成するペプチドシンテターゼ蛋白質。
【請求項３】 請求項１又は２に記載の蛋白質をコードする遺伝子、あるいは、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフェリクローム生合成クラスターを形成するオルニチンモノオキシゲナーゼ遺伝子（配列番号２）、ペプチドシンテターゼ蛋白質遺伝子（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子のＤＮＡ。
【請求項４】 請求項３に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項５】 組換えベクターｐＥＮＳ１。
【請求項６】 請求項４又は５に記載の組換えベクターを挿入してなる形質転換体。
【請求項７】 形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＮＳＩＤ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８６７９）。
【請求項８】 請求項４又は５に記載の組換えベクターを含む組換え麹菌。
【請求項９】 請求項６又は８に記載の形質転換体において、フェリクローム生合成クラスターを形成するオルニチンモノオキシゲナーゼまたはペプチドシンテターゼ蛋白質の少なくともひとつを生成させることによってフェリクローム高生産麹菌を育種すること、を特徴とする育種方法。
【請求項１０】 黒麹菌フェリクローム生合成に関与する遺伝子クラスターを、麹菌以外の生物に導入してフェリクロームを生成させる方法。
【請求項１１】 黒麹菌ペプチドシンテターゼ蛋白質の各ドメインの少なくともひとつを蛋白質工学的に組換えることにより所望するペプチドを合成する方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、黒麹菌のフェリクローム生合成に必要なオルニチンモノオキシゲナーゼとペプチドシンテターゼ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるオルニチンモノオキシゲナーゼ、ペプチドシンテターゼ蛋白質を生成させることによってフェリクローム高生産麹菌を育種する方法、両フェリクローム生合成遺伝子を麹菌以外の生物に導入して生産させる方法、及び黒麹菌ペプチドシンテターゼ蛋白質を用いて任意のペプチドを合成する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。特に好気性を示す生物群では、多大なエネルギーを生産する電子伝達系の反応に鉄イオンは欠くことができない。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００３】現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates familyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００４】一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた。
【０００５】このように、黄麹菌（Aspergillus oryzae）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、黄麹菌と類縁で焼酎、泡盛製造に関わる黒麹菌もまた、麹などの固体培養においてフェリクローム化合物を生産することが知られている。実際の焼酎、泡盛の蒸留酒では商品中でのフェリクロームについては問題視されていないが、黒麹菌もまた黄麹菌と同様にフェリクローム生産が可能な微生物と考えられる。また黒麹菌も長年食品微生物として使用されており、その安全性が高く評価されている。これらの点から、黒麹菌が生産するフェリクロームは貧血症の医薬または機能性食品の利用が期待される。しかしながら黒麹菌のフェリクローム生合成についてはその生合成に関与する遺伝子が未解明のため、生産量を上げるなどの有効利用ができず、いまだに効率的な活用がなされていない。
【０００６】もし、フェリクローム類の生合成遺伝子が同定されれば、黒麹菌によるフェリクローム類の生産を自由に調節できる可能性がある。例えば、医薬品製造においては、フェリクローム生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクローム生産が可能となる。さらに黒麹菌が生産するフェリクロームは清酒や泡盛その他飲食品として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。黒麹菌によりフェリクロームが大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる。このように、黒麹菌のフェリクローム生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解明なため、いまだに効率的な活用がなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Aspergillus niger等の黒麹菌のフェリクローム生産を自由に制御するために、黒麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子群を提供することにある。本発明の他の目的は本遺伝子群を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供することにある。
【０００８】黄麹菌（Aspergillus oryzae）におけるフェリクロームの生合成経路については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は、既にその生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定するのに成功するとともに、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子がフェリクローム生合成遺伝子クラスターを形成していることも確認している。
【０００９】一方、黒麹菌（例えば、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii、Aspergillus usamii、Aspergillus shirousamii、Aspergillus saitoiなど）もまた、黄麹菌と同様に、長年焼酎、泡盛製造に利用されており、安全性の高い有望なフェリクローム生産菌である。そして各方面から検討の結果、これら黒麹菌の真のフェリクローム高生産を実現するために、フェリクローム生合成遺伝子クラスターを形成する遺伝子の取得が必要である点に本発明者らははじめて着目した。これら黒麹菌のフェリクローム生合成遺伝子クラスターが取得できれば、安全性の高いフェリクロームを工業的に食品、医薬品へ供給することが可能となる。
【００１０】したがって本発明の目的は、黒麹菌のフェリクローム生合成を形成するクラスター遺伝子を開発することである。また、本発明の他の目的は、フェリクローム生合成クラスター遺伝子群の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクロームを高生産する麹菌を提供することにある。またこうして生産されたフェリクロームを鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供するのが可能となる。またさらなる目的はこれらの麹菌のフェリクローム生合成に関わる遺伝子クラスターを麹菌以外の生物に導入してフェリクローム類を生産させることにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、先ずはじめに黒麹菌（アスペルギルス・ニガー：Aspergillus niger等）について検討を行った。
【００１２】黒麹菌（例えば、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii、Aspergillus usamii、Aspergillus shirousamii、Aspergillus saitoiなど）は、焼酎、泡盛などの我が国の伝統的醗酵産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株は、上記醗酵産業で有用な蛋白質や低分子を非常に大量に生産することが知られている。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている。（Biotechnology、６、１４１９（１９８８）、特開昭６２−２７２９８８）発明者らの研究から、Ａ．ｎｉｇｅｒを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。またＡ．ｎｉｇｅｒは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、クエン酸などの有機酸発酵のように産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。黒麹菌が生産する低分子化合物の中でフェリクロームは、近年貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１３】この黒麹菌のフェリクロームを医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、フェリクローム生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクロームの大量生産が可能であると考えた。アスペルギルス属菌におけるフェリクロームの生合成遺伝子群については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は既に黄麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅよりフェリクローム生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定している。
【００１４】本発明者らは、この取得方法に着目し、この取得方法を黒麹菌に適用すれば黒麹菌のａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子も取得できるという可能性について、新規着想を得た。そして、黒麹菌においてもこれらのクラスター遺伝子が取得できれば、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え黒麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になるとの着想を得、そこで我々は、黒麹菌が生産する鉄イオンキレート低分子フェリクロームを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、そのフェリクローム生合成クラスターの遺伝子クローニングを行い、フェリクロームの工業生産に適した遺伝子組み換え黒麹菌を育種することを、新規技術課題として新たに設定した。
【００１５】一方、本発明者らの研究の結果、黄麹菌Aspergillus oryzaeにおいては、フェリクロームの生合成経路に属するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードするａｓｂ１（特願２００１−８３６４０）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）について、他の関連生合成遺伝子群と約３６−ｋｂのクラスターを形成していた（特願２００１−３２４１８１）。他に、Aureobasidiumpullulansのフェリクローム生合成遺伝子においても、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子、フェリクロームのＡＢＣトランスポーター遺伝子、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼ遺伝子が約３０−ｋｂのクラスターを形成することが報告された。また、Ustilago maydisにおいても、オルニチンＮ５オキシゲナーゼ遺伝子とペプチドシンテターゼ遺伝子が４．３−ｋｂの塩基を介してクラスターを形成していることが報告された(Walter MY, et al., J. Bacteriol., 183, pp4040-4051, 2001)。
【００１６】これらを検討した結果、本発明者らは、黒麹菌においても、フェリクローム生合成は、他の糸状菌のフェリクローム生合成遺伝子群と同様に、染色体上でクラスターを形成する可能性について、はじめて、その着想を得た。そして、鋭意研究を行い、黒麹菌において、フェリクローム生合成クラスターを形成する遺伝子を単離、確認し、遂に本発明の完成に至ったものである。以下、黒麹菌フェリクローム生合成遺伝子群の単離方法を具体的に述べる。
【００１７】フェリクローム生合成の第一段階であるＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis、Pseudomonas sp. B10、Pseudomonasaeruginosa、Burkholderia cepacia由来のものがクローニングされている。そこで、これらのシデロフォア生合成に関与するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の相同性から、非常に保存性の高い２つの領域を見いだし、この領域それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約１６０ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのL-オルニチンN5-オキシゲナーゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００１８】得られた遺伝子断片の塩基配列をプローブとしてＡ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、陽性クローンを得た。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は、４９９アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでいた。得られた遺伝子をｎｓｂ１と命名した。さらに、本遺伝子のｃＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して、得られた形質転換体は、菌体内に著量のＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼを生産することを確認した。よって、得られたｎｓｂ１遺伝子には黒麹菌のフェリクリシン生合成の律速となるＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００１９】次に、ヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須な糸状菌のペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis、Aureobasidium pullulans、Trichoderma harzianum由来のものがクローニングされている。そこで、これらのシデロフォア生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質の相同性から、非常に保存性の高い２つの領域を見いだし、それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの部分遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Alternaria alternataのペプチドシンテターゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００２０】得られた遺伝子断片をプローブとしてＡ．ｎｉｇｅｒのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、陽性クローンが得られた。その結果、得られた部分遺伝子の全長ＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は７０６４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを２つ含んでいた。得られた遺伝子をnsb2と命名した。ｎｓｂ２遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体上でｎｓｂ１の上流約２−ｋｂに位置しており、他の生物と同様にクラスターを形成することが明らかとなった。
【００２１】単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯやｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクロームの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する（E.S.Unkleら、Mol. Gen. Genet.,218, p. 99-104、1989）。この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株(硝酸を資化できない麹菌変異株:Nitrate Reductase欠損株)としては、例えば、Aspergillus oryzae 1013-niaD (FERM P-17707)を使用することができる。以下に、本発明の詳細について述べる。
【００２２】まず、鉄制限下でヒドロキシオルニチン類を基本構成アミノ酸とするシデロフォア生産が報告されている微生物の中で、Ｌ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子がクローニングされているものを選択した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10、Pseudomonas aeruginosa、Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Ala-Val-Ile-Gly-(Ala or Ser)-Gly-Gln-Ser-(Ser or Ala)-(Thr or Ala)-Glu-(Met or Ile)-Phe-Met-Asn-Leu-(His or Pro)-Ser-(Arg or Gln)-Phe-Pro（配列番号５：図４８）、もう１つはAla-Leu-(Val or Arg)-Pro-Ser-Asp-Asp-(Ser or Thr)-(Gly or Pro)-Phe-Val-Asn-(Ser or Glu)-Ala-(Ala orVal)-Phe-Asp-Pro-Glu-Arg-Thr-Asp（配列番号６：図４９）である。これら２種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約１６０ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ遺伝子と高い相同性を示した。
【００２３】得られた遺伝子断片の塩基配列をプローブとして、Ａ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長クローンが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は、４９９アミノ酸残基（配列番号１：図４、５）からなる蛋白質をコードしていた。プロモーター領域は配列番号２の１から１３７９ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の１３８０から２９３６ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の２９３７から３４８２ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の２２４６から２３０２ｂｐまでである。得られた遺伝子をｎｓｂ１（配列番号２：図６、７）と命名した。ｎｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ｎｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
【００２４】得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたｎｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクリシン生合成の律速となるＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。本菌株をEscherichia coli NSID1と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６７９として寄託した。本寄託菌株を用いることによって、１ｍＭ ＩＰＴＧ誘導培養条件下でＴ７プロモーター支配下でｎｓｂ１蛋白質を大腸菌で生産提供することが出来る。
【００２５】一方、ペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、既にクローニングされているUstilago maydis、Aureobasidium pullulans、Trichoderma harzianum由来のペプチドシンテターゼ蛋白質の相同性から、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Tyr-(Val or Leu)-Phe-Thr-Ser-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Pro-Lys-(Gly or Ala)-Val（配列番号９：図５２）、もう１つはAsp-(Thr orArg)-Gln-Val-Lys-Val-(Arg or Asn)-Gly-Gln-Arg-(Ile or Met)-Glu-Leu-(Glyor Asp)-Glu（配列番号１０：図５３）である。これら２種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｎｉｇｅｒの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Alternaria alternataのペプチドシンテターゼ遺伝子と高い相同性を示した。
【００２６】得られた遺伝子断片をプローブとして、Ａ．ｎｉｇｅｒのラムダＥＭＢＬ３ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、得られた部分遺伝子の全長遺伝子をコードするクローンが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は、７０６４アミノ酸残基（配列番号３：図８〜図３５）からなる蛋白質をコードしており、イントロンを２つ含んでいた。プロモーター領域は配列番号４の１から１７２５ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の１７２６から２３０２４ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の２３０２５から２３１１４ｂｐまでである。イントロンは、配列番号４の１１１９１から１１２４０ｂｐと１９１７０から１９２２３ｂｐであった。得られた遺伝子をｎｓｂ２（配列番号６：図３６〜図４７）と命名した。ｎｓｂ２遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体上でｎｓｂ１の上流約２−ｋｂに位置しており、他の生物と同様にクラスターを形成することが明らかとなった。
【００２７】以上の結果よりクローニングした遺伝子断片ｎｓｂ１、ｎｓｂ２は、黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのフェリクローム生合成遺伝子であることが明らかとなり、両遺伝子はクラスターを形成していた。この遺伝子を用いて、黒麹菌のフェリクロームを高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能である。
【００２８】
【実施例１】ｎｓｂ１遺伝子のクローニングと塩基配列の決定黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのフェリクローム生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の微生物由来Ｌ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10、Pseudomonas aeruginosa、Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。
【００２９】一方のアミノ酸配列保存領域（１）は、配列番号５（図４８）に示されるアミノ酸配列を有し（配列中、左から１番目のＸａａはＡｌａ又はＳｅｒ、２番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、３番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｌａ、４番目のＸａａはＭｅｔ又はＩｌｅ、５番目のＸａａはＨｉｓ又はＰｒｏ、６番目のＸａａはＡｒｇ又はＧｌｎをそれぞれ、示す。）、他のアミノ酸配列保存領域（２）は、配列番号６（図４９）に示されるアミノ酸配列を有した（配列中、左から１番目のＸａａはＶａｌ又はＡｒｇ、２番目のＸａａはＳｅｒ又はＴｈｒ、３番目のＸａａはＧｌｙ又はＰｒｏ、４番目のＸａａはＳｅｒ又はＧｌｕ、５番目のＸａａはＡｌａ又はＶａｌを、それぞれ、示す。）。
【００３０】これら保存配列（１）、（２）をもとに、２本の縮重オリゴヌクレオチドＤＮＡ合成プライマーＰ１、Ｐ２をそれぞれ合成した。プライマーＰ１の塩基配列を配列番号７（図５０）に示し、プライマーＰ２の塩基配列を配列番号８（図５１）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ｓはＧ又はＣ、ｗはＡ又はＴ、ｒはＡ又はＧ、ｙはＴ又はＣ、ｍはＡ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を示す。
【００３１】上記した縮重プライマーＰ１、Ｐ２を用いて、Aspergillus niger IFO 4067株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応条件の一例は次のとおりである。
【００３２】（ＰＣＲ条件）
・ ９６℃（５分）、１サイクル・ ９６℃（２０秒）、４５℃（１分）、７２℃（３分）、３０サイクル・ ７２℃（７分）、１サイクル【００３３】反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、約１６０ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼと相同性を示した。得られた部分遺伝子１６０−ｂｐをプローブとして黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒ ＩＦＯ４０６７株のラムダＥＭＢＬ３ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅラベリングキットを用いてプローブのフルオレッセンラベルを行い、約５０００個のファージクローンをスクリーニングした。得られた陽性クローンに含まれる全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。
【００３４】その結果、本遺伝子は、４９９アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。プロモーター領域は配列番号２の１から１３７９ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の１３８０から２９３６ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の２９３７から３４８２ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の２２４６から２３０２ｂｐまでである。得られた遺伝子をｎｓｂ１と命名した。その塩基配列を配列番号２（図６、図７）に示し、それに対応するアミノ酸配列を配列番号１（図４、図５）に示す。
【００３５】
【実施例２】ｎｓｂ２遺伝子のクローニングと塩基配列の決定黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の糸状菌由来シデロフォア生合成に関与するペプチドシンテターゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須な糸状菌のペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis、Aureobasidium pullulans、Trichoderma harzianum由来のものがクローニングされている。そこでこれらのシデロフォア生合成に関与するペプチドシンテターゼ蛋白質の相同性から、麹菌におけるペプチドシンテターゼ活性を担う遺伝子が取得できると考えた。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも２つのアミノ酸配列保存領域を見出した。
【００３６】一方のアミノ酸配列保存領域（３）は、配列番号９（図５２）に示されるアミノ酸配列を有し（配列中、左から１番目のＸａａはＶａｌ又はＬｅｕ、２番目のＸａａはＧｌｙ又はＡｌａを、それぞれ、示す。）、他のアミノ酸配列保存領域（４）は、配列番号１０（図５３）に示されるアミノ酸配列を有した（配列中、左から１番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｒｇ、２番目のＸａａはＡｒｇ又はＡｓｎ、３番目のＸａａはＩｌｅ又はＭｅｔ、４番目のＸａａはＧｌｙ又はＡｓｐを、それぞれ、示す。）。
【００３７】これら保存配列（３）、（４）をもとに、２本の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰ３、Ｐ４をそれぞれ合成した。プライマーＰ３の塩基配列を配列番号１１（図５４）に示し、プライマーＰ４の塩基配列を配列番号１２（図５５）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ｒはＡ又はＧ、ｙはＴ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を示す。
【００３８】上記した縮重プライマーＰ３、Ｐ４を用いて、Aspergillus niger IFO 4067株より調製した染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。反応条件はｎｓｂ１と同様に行った。
【００３９】反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、約８００ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、確かに上記Ｐ３、Ｐ４配列を含んでおり、相同性を検索した結果、Alternaria alternataのペプチドシンテターゼをコードする遺伝子と相同性を示した。得られた部分遺伝子８００−ｂｐをプローブとして黒麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒのラムダＥＭＢＬ３ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅラベリングキットを用いてプローブのフルオレッセンラベルを行い、約５０００個のファージクローンをスクリーニングした。その結果、１つの陽性クローンが得られた。得られたクローンに含まれる全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。
【００４０】その結果、本遺伝子は、７０６４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを２つ含んでいた。プロモーター領域は配列番号４の１から１７２５ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の１７２６から２３０２４ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の２３０２５から２３１１４ｂｐまでである。イントロンは、配列番号４の１１１９１から１１２４０ｂｐと１９１７０から１９２２３ｂｐであった。得られた遺伝子をｎｓｂ２と命名した。またｎｓｂ２遺伝子は、図１に示すようにＡ．ｎｉｇｅｒ染色体上でｎｓｂ１の上流約２−ｋｂに位置しており、他の生物と同様にクラスターを形成することが明らかとなった。
【００４１】ｎｓｂ２遺伝子の塩基配列を配列番号４（図３６〜図４７）に示し、それに対応するアミノ酸配列を配列番号３（図８〜図３５）に示す。本遺伝子は、プローブとしてフルオレッセンラベル化した後、アスペルス・ニガー ＩＦＯ ４０６７株のラムダＥＭＢＬ３ファージを用いたゲノム遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができた。また、本遺伝子については、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体上の位置を特定されているし、その塩基配列及びそれがコードする蛋白質のアミノ酸配列も本発明者らによって明らかにされているので、Ａ．ｎｉｇｅｒ染色体から分離することにより、本遺伝子を取得ることができ、本発明の実施は容易である。
【００４２】
【実施例３】ｎｓｂ１遺伝子の大腸菌での大量発現と酵素アッセイｎｓｂ１遺伝子の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を行った。ｎｓｂ１のｃＤＮＡの取得をまず試みた。具体的には３０℃、４日間鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌Ａ．ｎｉｇｅｒからニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Oligotex-dT30<Super>mRNA purification kitを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ ０．５μｇをもとに全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２の１３８０から２９３３ ｂｐ）をＲＴ−ＰＣＲで増幅後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端断片を調製した。本断片をノバジェン社ｐＥＴ−２３ｂベクターのＨｉｎｃII部位へＴ７プロモーターと正方向にサブクローニングした。
【００４３】本プラスミドをｎｓｂ１大腸菌高発現プラスミドｐＥＮＳ１（図２）とした。本プラスミドをノバジェン社大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体を３７℃でＯＤ０．６までＬＢ培地で培養後、最終１ｍＭ ＩＰＴＧを加えてさらに３０℃で３時間培養した。得られた大腸菌の菌体内蛋白質から東洋紡のMag ExtractorHis-Tag kitを用いて精製した（図３）。得られた精製蛋白質を１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）で抽出後、上清に最終１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−オルニチンを加え、３７℃で好気的に約２時間インキュベートした。１０％トリクロロ酢酸で反応停止後、遠心上清中のヒドロキシアミンをヨード酸化法（ＧｉｌｌａｍらAnal. Chem. 5:841-844、１９８１）に従って定量した。比活性は１分当たりに１ｎｍｏｌのヒドロキシアミンを産生する酵素量を１ ｕｎｉｔとして、菌体蛋白質ｍｇあたりの生産量を算出し、下記表１に示した。
【００４４】
（表１）
ｎｓｂ１遺伝子形質転換体のオルニチンＮ５−モノオキシゲナーゼ活性────────────────────────────────── プラスミド オルニチンＮ５−モノオキシゲナーゼ活性 （Ｕ／ｍｇ）
────────────────────────────────── 対照 ＮＤ ｐＥＮＳ１無細胞抽出液 ５．３２ ｐＥＮＳ１精製蛋白質 １０２．１──────────────────────────────────【００４５】表１に示したようにＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が認められた。よって、ｎｓｂ１がフェリクローム生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードすることが明らかとなった。本菌株をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＮＳＩＤ１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６７９として寄託した。本寄託菌株を用いることによって、１ｍＭ ＩＰＴＧ誘導培養条件下でＴ７プロモーター支配下でｎｓｂ１蛋白質を大腸菌で生産提供することが出来る。
【００４６】
【発明の効果】本発明により、クローニングした遺伝子断片ｎｓｂ１には、フェリクローム類生合成の第１段階を触媒するＬ−オルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。またクローニングした遺伝子断片ｎｓｂ２には、フェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼがコードされていた。ｎｓｂ１とｎｓｂ２はクラスターを形成していた。またこの遺伝子を用いて、フェリクローム類を高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム類生産が可能となった。本発明により大量生産可能となったフェリクローム類は非常に安全性が高く、食品、医薬、研究用試薬など様々な産業分野に利用が可能である。またｎｓｂ２にコードされるペプチドシンテターゼ蛋白質の各ドメインを、蛋白質工学的に組み換えることにより任意のペプチドを設計することも可能となる。
【００４７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Gekkeikan Inc., Ltd.<120> Ferrichrome Biosynthetic Gene Cluster of Black Koji-mold<130> 6553<141> 2002-2-6<160> 12<210> 1<211> 499<212> PRT<213> Aspergillus niger<400> 1Met Glu Pro Ala Val Arg Lys Pro Glu Val Ser Phe His Ser Gln Arg 1 5 10 15Asn Met Pro Ser Lys Gln Gln Arg Val Pro Ser Lys Leu Lys Ala Thr 20 25 30Pro Lys Asp Glu Leu His Asp Leu Leu Cys Val Gly Phe Gly Pro Ala 35 40 45Ser Leu Ala Ile Ala Ile Ala Leu His Asp Ala Leu Asp Pro Cys Leu 50 55 60Asn Lys Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Gln Pro Lys Val Cys Phe Val65 70 75 80Glu Arg Gln Lys Gln Phe Ala Trp His Ser Gly Met Leu Val Pro Gly 85 90 95Ser Arg Met Gln Ile Ser Phe Ile Lys Asp Leu Ala Thr Leu Arg Asp 100 105 110Pro Arg Ser Ser Phe Thr Phe Leu Asn Tyr Leu His Gln Lys Asp Arg 115 120 125Leu Ile His Phe Thr Asn Leu Gly Thr Phe Leu Pro Ala Arg Leu Glu 130 135 140Phe Glu Asp Tyr Met Arg Trp Cys Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Val145 150 155 160Ser Tyr Gly Glu Glu Val Val Asp Val Met Pro Gly Lys Thr Asp Pro 165 170 175Thr Ser Ser Val Val Asp Phe Phe Thr Val Arg Ser Arg Asn Val Glu 180 185 190Thr Gly Glu Ile Thr Ala Arg Arg Ala Arg Lys Val Val Thr Ala Leu 195 200 205Gly Gly Ser Ala Lys Met Pro Pro Gly Leu Pro Gln Asp Pro Arg Ile 210 215 220Met His Ser Ser Lys Tyr Cys Thr Asn Leu Pro His Leu Leu Lys Asn225 230 235 240Pro Asn Glu Pro Tyr Asn Ile Ala Val Leu Gly Ser Gly Gln Ser Ala 245 250 255Ala Glu Ile Phe His Asp Leu Gln Lys Arg Tyr Pro Asn Ser Lys Thr 260 265 270Thr Leu Ile Met Arg Asp Ser Ala Met Arg Pro Ser Asp Asp Ser Pro 275 280 285Phe Val Asn Glu Val Phe Asn Pro Glu Arg Val Asp Lys Phe Tyr Asn 290 295 300Leu Ser Ala Glu Glu Arg Gln Arg Ser Leu Lys Ala Asp Lys Ala Thr305 310 315 320Asn Tyr Ser Val Val Arg Leu Glu Leu Ile Glu Glu Ile Tyr His Asp 325 330 335Met Tyr Val Gln Arg Val Lys Asn Pro Asp Glu Lys Gln Trp Gln His 340 345 350Arg Ile Leu Pro Gly Arg Lys Ile Thr Arg Val Glu His His Gly Pro 355 360 365Gln Ser Arg Met Arg Ile His Val Arg Ala Thr Lys Asp Gly Ser Asp 370 375 380Ser Leu Val Gly Asp Gly Lys Glu Ile Leu Glu Val Asp Ala Leu Met385 390 395 400Val Ala Thr Gly Tyr Tyr Arg Asn Ala His Glu Gln Leu Leu Ser Asn 405 410 415Val Gln His Leu Arg Pro Ala Gly Gln Glu Glu Trp Lys Pro Ser Arg 420 425 430Asp Tyr Arg Val Glu Met Asp Ala Ser Lys Val Ser Pro Tyr Ala Gly 435 440 445Ile Trp Leu Gln Gly Cys Asn Glu Lys Thr His Gly Leu Ser Asp Ser 450 455 460Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Arg Gly Gly Glu Met Val Glu Ser Ile465 470 475 480Phe Gly Glu Gln Leu Ala Gly Ala Thr Val Pro Val Thr Lys Leu Arg 485 490 495Ala Met Leu 499<210> 2<211> 3482<212> DNA<213> Aspergillus niger<400> 2ctgtattgat ttcatttgag tgagggaaag cttatcaaga ttggtacctg aacaatccaa 60ccggttacag gaggtaatgt aagttgggcg tcaatacgat acggataccg ccattcagcc 120cagtcttgga aacgttgtga aatttcccga catcgggcga ctgcggatct aatctaagcg 180tccatcatcc cacttttcct ggattaattt gcattgcaca ccggatcatg ctgcggggct 240cctggtcggc tcttcgggct cggagactga gtaggcagct tggcttattg tttgctttct 300ttgctatttt gggttcaatt tttatgaagc aaattgaagt gttcgtgggt acaactggtt 360gatatgcctc gatgaatttt cactggtgct aatggtgatg ggggtggtgg ttgttgtggc 420gtgatcctca acttcccagg atgtgaacgg atctggggcg agcaaaggga agaagggagg 480ggctatggtt agcacttcgt ttacaagttc ataccacaag tgggctcttc tggacctgat 540aaaacatcat cttatctccg aggaaacagc catctatgct tggaatttcg acatatggcg 600ttgggtttcc tcagtcacac aactactaat atgtgaacac ttccctctcc ttcaagccca 660acgttaacgc ggagacgata caaatcctcg cgaaatcgcc tgctagatca agcttcagta 720ttgttaatac ctattctaca taccttgcca accaccaaga gcctcggtgc cccagcatta 780aaccagtacg taaaaaaaga ggagcagcaa ccacgtttct catgggcagg tggtggaacc 840gaggagtgcc tatcaagtag gccattgccg gcccgctgtc agaagaacta cggccggcta 900ctgcttttgc tcggtggcct ggaaaaaaac ccgtccttaa cggatccgct gcttcagaaa 960aaaaaaaaaa aaagaagaag ggttcggcgc tgataccctt ttctttttta tgttacactc 1020gtcataaatt ctgaattttt ttttattatt aatattttag tcgaatttac ctttttggta 1080cctagttttt attttaacat atttttattt ttctctccct cttacggcgc aaaggtctcc 1140agtgtgtact aaagttggaa gaaatggtcc ttccccccat ctgtttatcc accaggggat 1200ataactacga ccatcgctcc caccatttgc cgcggttctc tcccaccttc gttcagaatc 1260ccatcatcat tgcgtcttcc ttccatcttc ctgctcccca aactctgagc acggaatctc 1320tgcctcttct ttcattcaca cactttctac tccttatatt cttctcctag tctgtatcaa 1380tggaacctgc ggtacggaag cccgaagtga gcttccacag ccagcgcaac atgccctcca 1440agcagcagcg ggtgccttcg aagctcaagg ccacccccaa ggatgagctt cacgatttac 1500tttgcgtggg tttcggtcct gcctctttgg cgatcgcaat tgccttgcac gatgctctgg 1560acccttgtct gaacaagtcg gcacctgcgc ctggatcgca gcccaaggtc tgctttgtcg 1620agcgtcagaa gcagtttgct tggcattcgg gcatgttggt ccccggttca aggatgcaga 1680tctccttcat caaggatttg gcgactctcc gggatcctcg cagcagcttc accttcctca 1740actatttgca ccagaaggat cgtttgatcc atttcacaaa cctgggaaca ttccttccgg 1800ctcgcttgga gttcgaggac tatatgcggt ggtgtgcgca acaattctct gatgtcgtgt 1860cttatggaga ggaagtggtc gatgtgatgc ccggaaagac ggatcctacc agctcggtgg 1920tcgacttctt caccgtccgc tcccgcaacg ttgagacggg tgagattact gcgagaagag 1980cgcgcaaggt ggtgactgca ctcggtggct ctgcgaagat gcccccaggc ctgccccagg 2040acccccgcat tatgcactcg tcgaagtact gcaccaatct gcctcacctg ctgaagaacc 2100cgaacgaacc ctacaacatc gccgtgcttg gaagtggcca gagtgctgct gagatcttcc 2160acgacctgca aaagagatac cccaactcaa agacgacact gatcatgaga gattcggcta 2220tgcggcctag tgatgactct cctttgtgag tataataccc cttgcacgcc cgacaggtcg 2280caactaacag caaacaatat agtgttaacg aggtcttcaa ccccgaacgt gtcgacaaat 2340tctataacct ctctgccgaa gagcgccaac gttccctcaa ggctgacaag gccaccaact 2400acagtgtggt ccgtcttgaa ctcattgagg agatttacca cgacatgtac gtccagcggg 2460tcaagaaccc cgacgagaag caatggcagc accgcatcct ccccggacgc aagatcacgc 2520gagtcgaaca ccatggacct cagagtcgga tgcggattca cgtgagggcg accaaggatg 2580gatcggacag ccttgtcggc gacggcaagg agatattgga ggtggatgca ctcatggtgg 2640cgaccggcta ctaccgcaac gcacatgaac agctcttgag caacgtgcag catctgcgac 2700cggcaggcca ggaggaatgg aagccgagtc gggattaccg ggtcgaaatg gatgccagca 2760aggtcagccc ctatgctgga atctggctgc agggctgtaa cgagaagaca cacgggctaa 2820gcgacagtct tctgtcggtg ctggcagcac gcggtggaga gatggtggag tcgatctttg 2880gcgagcagct tgcgggtgca acggtgccgg tcacgaagtt gcgcgctatg ctgtaaaggc 2940ttttcgccgg atcggagacc caggaggggt tccgctttct agacgcgtga aatgatggcg 3000ctagggcgga cattttaatt tccttgggac aaaagaatgc cccggaaaaa tgcatgcata 3060tccccaaaca aattggtagg gggtgatatc ttcttttgcg atcatctact ctactgtatc 3120tgtgttcatt tctgtctcac caccttatac tttgttacta ttgttattac cccatcatct 3180gattccccaa gtacccccat cgcgagttat atagccagcc acattggaat tttataacga 3240atagagatcg gaatgcatcg agtctgtcct tgttgatttt aattccaccg ctcattgtgt 3300taggaagaag gccatgctaa tggcgcacgt ttcttttttt cattcgctgc agatgtaatt 3360cattctcctt aaacttatcc ggcccctgac acgtgcctgt agccgacagg aggacgaaaa 3420taagtgccta ggaaagaaaa agcgagtggc tggtcgcaca accgcagtct agcacggacc 3480cg 3482<210> 3<211> 7064<212> PRT<213> Aspergillus niger<400> 3Met Arg Ser Pro Asn Asp Leu Thr Thr Ser Ala Thr Met Glu Asp Ile 1 5 10 15His Gln Ile Trp Ser Trp Asn Ala Asn Val Pro Glu Ala Gly Glu Thr 20 25 30Cys Val His Thr Leu Ile Thr Asp Lys Ala Leu Gln Gln Pro Asp Ala 35 40 45Leu Ala Val Asp Ala Trp Asp Gly Arg Trp Thr Tyr Gly Glu Leu Glu 50 55 60Thr Thr Ser Thr Lys Leu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Leu Gly Val Gly 65 70 75 80Pro Gly Thr Asn Val Val Ile Cys Phe Glu Lys Ser Lys Tyr Thr Pro 85 90 95Leu Ala Met Leu Ala Val Met Lys Ala Gly Gly Ala Ser Ile Ala Leu 100 105 110Asp Thr Ser Gln Pro Gln Thr Arg Leu Gln Ser Ile Ile Asn Gln Val 115 120 125Asp Pro Val Val Ile Leu Cys Ser Ala Ser Lys Ser Gln Leu Ala Lys 130 135 140Ser Ile Ile Thr Glu Ser Ala Val Ala Leu Thr Ile Asp Glu Asn Ser145 150 155 160Leu Ser Glu Met Asn Phe Glu Pro Asp Ser Val Ala Arg Leu Pro Asp 165 170 175Val Ser Leu Asp Asn Asn Leu Tyr Val Val Phe Thr Ser Gly Ser Thr 180 185 190Gly Thr Pro Lys Gly Val Val Val Thr His Leu Asn Tyr Ser Thr Ala 195 200 205Ile Leu His Gln Gln Glu Ala His Gly Phe Lys Ser Thr Ser Arg Val 210 215 220Tyr Asp Phe Ala Ser Tyr Ala Phe Asp Val Ser Trp Ser Asn Leu Ile225 230 235 240His Thr Leu Thr Ile Gly Ala Cys Leu Cys Ile Pro Ser Glu Gln Asp 245 250 255Arg Lys Asp Asn Leu Ile Glu Ser Ile Arg Ser Leu Cys Ala Thr His 260 265 270Ile Asp Val Thr Pro Ser Val Ala Arg Leu Ile Pro Asp Ser Leu Leu 275 280 285Cys Lys Ile Glu Thr Leu Val Leu Gly Gly Glu Lys Leu Pro Ala Glu 290 295 300Leu Ala Arg His Leu Ser Ser Leu Val Thr Leu Lys Asn Pro Tyr Gly305 310 315 320Pro Ser Glu Cys Thr Pro Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ile Arg Pro Asp 325 330 335Asp Asp Asp Ser Lys Ile Ser Ser Ile Gly Arg Gly Leu Gly Val Asn 340 345 350Thr Trp Val Val Asp Ser Glu Asn Glu Glu Ile Leu Val Pro Ile Gly 355 360 365Gln Val Gly Glu Leu Leu Leu Glu Gly His Leu Leu Gly Asn Gly Tyr 370 375 380Leu Asn Asp Gln Thr Lys Thr Thr Ala Ala Phe Val Asn Asn Pro Leu385 390 395 400Phe Leu Leu Asn Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gln Pro Gly Arg Arg Gly 405 410 415Arg Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Arg Tyr Glu Lys Asp Gly Ser 420 425 430Leu Thr Ile Ile Gly Arg Lys Asp Thr Gln Ser Arg Leu Arg Pro Arg 435 440 445Val Glu Leu Gly Asp Ile Glu His His Ile Tyr Arg His Ile Pro His 450 455 460Gly Thr Val Ser Val Arg Gln Ile Ala Ala Glu Ile Ile Ser Pro Lys465 470 475 480Thr Gly Ser Asn Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Val Asp Leu Gly 485 490 495Val Glu Asp Thr Gly Ile Ala Glu Gln Leu Phe Ser Lys Thr Glu Lys 500 505 510Met Met Ser Asn Leu Arg Ser Asn Leu Ala Arg Asp Val Pro Ser Tyr 515 520 525Met Val Pro Ala Val Phe Ile Pro Leu Arg Asn Phe Pro Leu Ser Pro 530 535 540Thr Gly Lys Thr Asp Arg Arg Gln Leu Arg Ala Ile Gly Glu Ser Met545 550 555 560Asp Leu Thr Val Leu Ala Gly Phe Gly Ala Ala Pro Asn Glu Ala Arg 565 570 575Ile Pro Leu Thr Leu Arg Glu Lys Gln Leu Arg Arg Leu Trp Gly Ser 580 585 590Ile Leu Arg Ile Asp Glu Asn Leu Ile Ala Leu Asp Asp Asn Phe Leu 595 600 605Gln Arg Ala Gly Asn Pro Asn Ala Ala Met Lys Leu Val Thr Ala Ala 610 615 620Arg Arg Glu Gly Phe Ser Leu Ser Val Ala Asn Val Leu Lys Tyr Pro625 630 635 640Arg Leu Gln Asp Met Ala Gln Val Val Gly Thr Val Glu Gln Glu Gln 645 650 655Ala His Glu Ile Met Pro Phe Glu Leu Leu Ser Asp Asp Ile Asn Leu 660 665 670Asp Leu Ala Leu Arg Glu Ala Ala Ala Ser Cys Asn Val Gln Gly Asn 675 680 685Gln Ile Gln Asp Ile Tyr Pro Cys Thr Pro Leu Gln Glu Gly Met Met 690 695 700Ser Leu Ser Ala Lys Arg Glu Gly Asp Tyr Ile Met Gln Tyr Thr Leu705 710 715 720Glu Leu His His Arg Cys Asp Ile Glu Arg Leu Gly Lys Ala Trp Ala 725 730 735Thr Val Val Ala Thr Thr Pro Ile Leu Arg Thr Arg Ile Val Asp Ile 740 745 750Thr Ser Gln Gly Leu Val Gln Ala Val Leu Asp Glu Gln Trp Ser Ser 755 760 765Ser Ser Ile Gln Arg Arg Thr Leu Ser Gln Ala Arg Asp His Lys His 770 775 780Gln Phe Gly Leu Gly Met Pro Leu Gly Arg Phe Glu Ile Val Thr Gly785 790 795 800Asp Ser Ser Asp Phe Lys His Tyr Phe Val Trp Thr Leu His His Ala 805 810 815Leu Tyr Asp Gly Trp Ser Leu Gln Leu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Asn 820 825 830Glu Tyr Ala Gly Lys Ala Asp Ala Gln Ser Asn Ser Pro Asp Phe Lys 835 840 845Arg Phe Ile Lys Tyr Ile Ser Thr Arg Asp Gly Glu Lys Thr His Ser 850 855 860Phe Trp Thr Glu Gln Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ile Phe Pro Ser865 870 875 880Leu Pro Ser Val Asp Tyr Gln Pro Arg Ser Asp Lys Leu Tyr Thr His 885 890 895Ser Val Gly Gly Ile Gln Trp Pro Lys Asn Gly Ile Thr Pro Ser Thr 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| 【出願人】 |
【識別番号】０００１６５２５１
【氏名又は名称】月桂冠株式会社
【住所又は居所】京都府京都市伏見区南浜町２４７番地
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| 【出願日】 |
平成１４年２月６日（２００２．２．６） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００７５７７５
【弁理士】
【氏名又は名称】戸田 親男
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| 【公開番号】 |
特開２００３−２３０３８１（Ｐ２００３−２３０３８１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１５年８月１９日（２００３．８．１９） |
| 【出願番号】 |
特願２００２−３０１４５（Ｐ２００２−３０１４５） |
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