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【発明の名称】 杠柳（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａｓｅｐｉｕｍ）由来の作用物質
【発明者】 【氏名】常盤 孝義

【氏名】山崎 泰助

【氏名】桜井 進

【氏名】河野 稔

【氏名】草野 功

【氏名】原田 国明

【氏名】桜井 正之

【氏名】松村 外志張
【要約】 【課題】関節障害にともなう科学的な指標を用いて植物成分を探索し、抗関節障害作用物質を提供することを課題とする。

【解決手段】杠柳（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）の熱水抽出物、ならびにとくにその分子量１００００以下の分画の濃縮物であって、リウマチ性関節炎ならびに変形性関節症患者由来の滑膜線維芽細胞の増殖抑制ならびにＩＬ−６産生抑制作用を持ち、その物理化学的特性が紫外吸収曲線、赤外吸収曲線ならびにゲル濾過法による分子量分布によって特長づけられた分画を提供することを課題の解決手段とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 杠柳（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）の樹皮ならびに根皮の熱水抽出物であって、リウマチ性関節炎患者の滑膜線維芽細胞ならびに変形性関節症由来滑膜線維芽細胞の増殖ならびにインターロイキン−６（ＩＬ−６）の生産性を抑制することを特長とする関節障害抑制作用物質。
【請求項２】 分子量１０，０００以下の分画よりなり、紫外領域の吸収スペクトラムが図４の特長を有し、赤外領域の吸収スペクトラムが図５の特長を有し、さらに分子量分布が図６（Ａ−３）の特長を有することを特長とする請求項１にある関節障害抑制作用物質。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物性の抗関節障害抑制作用物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】リウマチ性関節炎、変形性関節症は、成人の慢性的な生活習慣病のなかでも重要な位置を占め、その治療にはさまざまな努力が傾けられているが、引き続いて根治することの難しい疾患として知られている。従来の治療法として、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）、金などを含む免疫抑制剤、ステロイド、メトトレキセイトなど代謝拮抗剤が使用されてきているが、それぞれ効果が充分でないか、あるいは副作用が強く、さらに効果的な治療薬、治療法、あるいは補助的な治療手段が求められている（例えば橋本明「慢性関節リウマチの治療の実際、治療総論／治療のストラテジー」内科７８：２７１−２７６（１９９６））。一方、従来リウマチ性関節炎ならびに変形性関節症にたいする漢方薬あるいは民間薬として２０にあまる多数の処方が知られている（例えば水野瑞夫、米田該典「家庭の民間薬・漢方薬」新日本法規（１９９７））。芍薬、附子、甘草、五加皮などは、これらの処方に使用されている生薬の一部である。しかしこれら生薬については、経験的に使用されてきたにとどまっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明においては、関節障害にともなう細胞レベルでの科学的な指標を用いて植物成分を探索し、抗関節障害作用物質を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、この課題を解決するために、まずリウマチ性関節炎（ＲＡ）においては、関節の滑膜組織が増殖・肥厚し、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む各種炎症性の作用物質が生産される（例えば佐浦隆一、石川斎「ＤＭＡＲＤｓの滑膜繊維芽細胞の増殖に及ぼす影響」医学のあゆみ１８６：１３３−１３７（１９９８））、山村昌弘、槙野博史「関節リウマチ滑膜におけるサイトカイン発現異常」医学のあゆみ１８２：５７３−５７８（１９９７））ことに注目した。そこで、ＲＡ患者ならびに変形性関節症（ＯＡ）患者が外科的に滑膜組織の一部を摘除するに際し、摘除された組織を組織培養し、滑膜線維芽細胞を得た。このようにして得た滑膜線維芽細胞を培養し、各種の植物抽出物を培養液に添加しながら細胞の増殖ならびにＩＬ−６の生産を測定することにより、細胞を障害することなく、しかも細胞増殖ならびにＩＬ−６の生産を抑制する作用物質を探索する手段を得た。このようにして得た作用物質探索系を用いて、各種の植物由来の抽出物の細胞増殖抑制効果ならびにＩＬ−６生産抑制効果を鋭意比較検討した結果、驚くべきことに杠柳（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）の熱水抽出物、ならびにとくにその分子量１００００以下の分画に有効な成分が含まれることを発見し、さらにその物理化学的な特性を明らかにすることによって、滑膜細胞の増殖ならびにＩＬ−６産生を抑制する作用物質を得た。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明に用いられる杠柳（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）は、その樹皮ならびに根皮を乾燥し砕片したものを、さらに抽出を容易にするために粉砕して得た粉末を原料とする。なおここで、杠柳の樹皮ならびに根皮を乾燥し、砕片とした製品が以下実施例にあるように、生薬として五加皮あるいは北五加皮の名称で入手可能であるが、本発明における原料は、杠柳の樹皮ならびに根皮を乾燥し、細粉としたものであれば、この製品に限定されるものではない。
【０００６】標準的な熱水抽出工程として、蒸留水１００ｍｌに対し、杠柳皮ならびに根皮よりなる粉末を１ｇの割合で一晩浸漬し、その後全量を、１時間１００°Ｃに加熱し、加熱後全量を室温にまで冷却し、さらにその後、全量をガラス繊維濾紙で濾過し、さらに加えて孔径０．２２ミクロンのメンブレンフィルターで濾過して、粗熱水抽出物を得る。ただし、粉末に対する蒸留水の割合、熱水による抽出時間、ならびに抽出後の濾過の方法など、ここに示した標準的な工程の条件については、その多少の変更はその後の作用物質の取得に大きな影響を与えないことは当該業者であれば容易に予想できることであり、従って本発明は上記の標準的な熱水抽出工程の採用に限定されるものではない。
【０００７】標準的な分画工程においては、上記のようにして得た粗熱水抽出物を以下のようにして分画する。即ち粗熱抽出物を分画分子量１０，０００の限外濾過装置を用い、原液側（非透析側）に精製水を加えつつ、その液量を維持し、透析液側に透過液を収穫する。このようにして得た透過液を減圧濃縮し、さらに凍結乾燥して乾燥物を得る。標準工程においては、当初の杠柳樹皮ならびに根皮粉末１ｇに対する最終的な透過液６００ｍｌを得、これを１０分の１量にまで減圧濃縮し、さらに凍結乾燥するが、ここに示した標準的な工程の条件の詳細については、その多少の変更はその後の作用物質の取得に大きな影響はないことは当該業者であれば容易に予想できることであり、従って本発明は上記の標準的な熱水抽出工程の採用に限定されるものではない。例えば限外濾過装置として、平膜式限外濾過濃縮装置でなくとも、透析チューブを用いることも、また遠心式限外濾過濃縮装置を用いることも、当該業者であれば容易に想起できることであり、その選択は平膜式限外濾過濃縮装置に限定されない。
【０００８】このようにして得た凍結乾燥物を０．０２ｍｇ／ｍｌないし０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でＯＡ患者由来滑膜線維芽細胞、ならびにＲＡ患者由来滑膜線維芽細胞の細胞培養に添加したとき、その両者の細胞増殖を抑制すること、ならびに両者のＩＬ−６生産性を抑制すること、さらにその紫外吸収曲線が図４にある曲線の特長を示すこと、またさらにその赤外吸収曲線が図５にある曲線の特長を示すこと、そしてさらにまたそのゲル濾過による分子量分布が図６にある曲線の特長を示すことを確認した上で、目的とする滑膜細胞の炎症抑制作用物質を得る。
【０００９】なお、本物質は凍結乾燥した粉末の形で提供されるが、凍結乾燥物を溶解したり、あるいは他の物質と混合した標品は勿論、凍結乾燥する以前の限外濾過濃縮物、ならびにさらに限外濾過濃縮する以前の熱水抽出物も当然該作用物質を含むものであり、該作用物質の提供の形は、凍結乾燥した粉末に限らないことはゆうまでもない。また本物質は、そのＯＡ患者由来滑膜繊維芽細胞ならびにＲＡ患者由来滑膜繊維芽細胞の増殖抑制効果とＩＬ−６産生抑制効果、紫外吸収曲線、赤外吸収曲線ならびにゲル濾過による分子量分布によって特長づけられるものであるが、上記の製造法に従えば再現的にこれらの特長を有する物質を得ることがてきるのであるから、一旦製造法が確立した以上は、これらの評価試験の一部あるいは全部省略をすることによっても、本発明の新規性が失われるものではない。
【００１０】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の本実施例においては、原料とした杠柳の樹皮ならびに根皮の乾燥砕片を五加皮あるいは北五加皮と称して販売されている生薬を用いている。ここで、五加皮と称されるものに、ガガイモ科の植物である杠柳の樹皮ならびに根皮に由来するもの以外に、ウコギ科の植物に由来するものが記載されている（日本薬草全書）。しかし現在、漢方生薬として販売されているものはすべてが杠柳のものであり、以下実施例においても、特に注釈しないかぎり、五加皮あるいは北五加皮と記しているものは生薬として入手した杠柳の樹皮ならびに根皮の乾燥砕片を指す。
【００１１】乾燥した杠柳樹皮ならびに根皮の砕片は、比較するために使用した生薬である芍薬、甘草、附子それぞれの乾燥砕片標品とともに、五加皮（北五加皮）の名称で中国産の生薬として販売されているものを内田漢方より入手して使用した。しかし、同様の標品は他のルートからも入手可能であり、本発明は杠柳の皮ならびに根皮を乾燥した製品であれば、その入手先によらない。
【００１２】入手した五加皮、芍薬、甘草、ならびに附子の乾燥砕片標品をさらによく乾燥し、それぞれ１ｇづつをとって、乳鉢を用いて粉砕し、微粉末を得た。これら微粉末をそれぞれビーカーに移して、それぞれに１００ｍｌの蒸留水を注ぎ、微粉末を分散、浸漬し、常温で一晩放置した。翌日、ビーカーを１００°Ｃにおいて１時間加熱した。加熱後放冷し、さらに濾紙で濾過して濾液を得た。濾液をそれぞれ凍結乾燥し、乾燥標品を得た。
【００１３】ＲＡ患者ならびにＯＡ患者からの滑膜組織は、財団法人河野臨床医学研究所付属北品川病院（理事長河野稔）において、治療目的で手術によって摘出された組織を用いた。ＲＡ滑膜組織提供者は年齢７０歳から８０歳までの女性、ＯＡ滑膜組織提供者は年齢８４歳の男性であった。摘出組織は、メスにて細切後、６ｃｍプラスチック培養皿の底面に張り付け、１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培養液（以下ＲＰＭＩ１０ＦＢＳと表記）中、５％ＣＯ２ガスを含む加湿した気相中、３７°Ｃに保温して培養し、それぞれＲＡならびにＯＡ由来の滑膜線維芽細胞を増殖させた。増殖系の滑膜線維芽細胞の培養は、トリプシン処理によって、２回乃至３回継代培養し、以下の実験に供した。
【００１４】第一に、ＯＡ滑膜線維芽細胞に対する植物抽出物の細胞増殖抑制効果を判定する実験を行った。継代培養したＯＡ滑膜線維芽細胞の培養をトリプシン処理し、遠心分離して細胞を分離し、これをＲＰＭＩ１０ＦＢＳ培養溶液に分散して、２ｘ１０３個／ｍｌの細胞密度に調整し、調整した細胞浮遊液を０．５ｍｌずつ、９６穴のプラスチツクウエルプレートのそれぞれのウエルに播種し、このようにして播種した細胞培養を、５％ＣＯ２ガスを含む加湿した気相中、３７°Ｃに保温して１日間培養し、その後、それぞれの培養皿に五加皮、芍薬、甘草ならびに附子より得た上記抽出物を最終濃度０．００２、０．０２、０．２、ならびに２ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、さらに培養を６日間続けた。培養後、細胞の増殖をＭＴＴ法（黒木登志夫ら編「新培養細胞実験法」羊土社（１９９９））にて測定し、無添加群の増殖に対する比をとって、増殖抑制効果の指標とした。このようにして培養したＯＡ滑膜線維芽細胞の増殖に及ぼすこれら４種類の植物抽出物の効果は図１に示す通りであるが、要約すれば、ＯＡ細胞に対してはこれら４種の抽出物はどれも増殖抑制効果を示すが、そのなかで附子は最も弱く、甘草がこれに次ぎ、さらに芍薬、そして五加皮がもっとも強い抑制効果を示した。即ち五加皮においては、０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度で８０％以上の抑制を示したが、附子は０．２ｍｇ／ｍｌの濃度まで抑制を示さず、２ｍｇ／ｍｌの濃度においてはじめて４０％程度の抑制を示すにとどまり、甘草、芍薬はその中間であった。なお、本実験において、増殖抑制下での細胞を観察したところでは、細胞は生存しており、とくに障害を受けている様子は見あたらず、これら抽出物の効果は増殖抑制にあり、細胞の殺傷によるものでないと判定された。
【００１５】第二に、ＲＡ滑膜線維芽細胞に対する植物抽出物の細胞増殖抑制効果を判定した。実験は第一の実験と同様であるが、植物抽出物を添加して行った培養の期間は３日で十分に判定可能であったので、本実験ならびに以下の実験では培養期間を３日間とした。これら４種類の植物抽出物のＲＡ細胞の増殖抑制効果は図２に示す通りであるが、要約すれば、ＲＡ細胞に対しては、試験した濃度範囲においては、増殖抑制効果を示したものは芍薬と杠柳のみであり、附子と甘草には効果はみられなかった。また芍薬についても２ｍｇ／ｍｌの濃度でようやく抑制効果が見られ、０．２ｍｇ／ｍｌでは見られなかった。これに対し、杠柳では、測定した範囲で濃度依存的に抑制効果が認められた。また、検鏡した範囲においてこれら抽出物の添加は細胞の殺傷を引き起こすものでなく、増殖の抑制のみが引き起こされたものと判断された。
【００１６】図１ならびに図２に結果を示した以上２実験から、試験した４種類の植物抽出物のうち、ＯＡ細胞ならびにＲＡ細胞に対してともに増殖抑制効果を示したものは、杠柳と芍薬の２種であり、とくに杠柳の抽出物が濃度依存的に高い抑制効果を示した。ＲＡにおいては滑膜線維芽細胞の増殖が誘起されることが病状の進行と深く関わっていることが従来示されているが（例えば佐浦隆一、石川斎「ＤＭＡＲＤｓの滑膜繊維芽細胞の増殖に及ぼす影響」医学のあゆみ１８６：１３３−１３７（１９９８））、本実験の結果は、杠柳がＲＡ由来滑膜線維芽細胞の増殖を抑制し、したがってＲＡの進行を抑制する作用を持っていることを示したものである。
【００１７】第三に、培養したＯＡ滑膜線維芽細胞ならびにＲＡ滑膜線維芽細胞のＩＬ−６生産に対する杠柳抽出物の効果を判定するために、それぞれの細胞を１ｘ１０３個／０．５ｍｌずつ９６穴ウエルプレートの各ウエルに播種し、１日間培養した後、第一ならびに第二の実験におけると同様に凍結乾燥した五加皮熱水抽出物をそれぞれ０．２ならびに２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、引き続き３日間培養した後、培養上清中のＩＬ−６の濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定した。測定結果は図３に表記する通りであるが、要約すれば、細胞数当たりのＩＬ−６生産は、ＯＡ細胞においても、ＲＡ細胞においても、０．２ｍｇ／ｍｌならびに２ｍｇ／ｍｌの濃度で抑制され、とくにＲＡ細胞に対しては、濃度依存的な抑制がみられ、０．２ｍｇ／ｍｌで７０％、２ｍｇ／ｍｌで９０％以上の抑制が見られた。ＲＡにおいては滑膜線維芽細胞の増殖が誘起されるばかりでなく、サイトカイン、とくＩＬ−６の生産が昂進することが病状の進行と深く関わっていることが従来示されているが（例えば山村昌弘、槙野博史「関節リウマチ滑膜におけるサイトカイン発現異常」医学のあゆみ１８２：５７３−５７８（１９９７））、本実験の結果は、杠柳抽出物がＲＡ由来滑膜線維芽細胞の増殖ばかりでなく、ＩＬ−６産生を抑制し、したがってＲＡの進行を抑制する作用を持っていることを示したものである。
【００１８】第四に、杠柳樹皮ならびに根皮熱水抽出物の本体を明らかにするために、抽出物の分画を行った。すなわち、五加皮の砕片標品をさらによく乾燥し、その２ｇをとって乳鉢を用いて粉砕し、微粉末を得た。これら微粉末をビーカーに移して、２００ｍｌの蒸留水を注ぎ、微粉末を分散、浸漬し、常温で一晩放置した。翌日、ビーカーを１００°Ｃにおいて１時間加熱した。加熱後放冷し、ガラスフィルター（ＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａ、粒子保持能１．６μｍ）濾過し、さらにメンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ）で濾過し、濾液１４０ｍｌを得た。この濾液を２等分し、７０ｍｌは直接凍結乾燥して、乾燥品３０８ｍｇを得た。この乾燥品をＡ−１とした。いま一方の濾液７０ｍｌは、限外濾過装置（分画分子量１０，０００、タンジェンシャルフロー型、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｍｉｎｉｔａｎ）を用いて限外濾過した。本装置によって限外濾過する間、非透析側に精製水を滴下補給しつつ、５０ｍｌ透過ごとに透過液の吸光度を２８０ｍｎならびに３２０ｎｍにおいて測定し、充分な限外濾過がなされるまで濾過を続けた。結果、６００ｍｌの限外濾過液を回収した時点で、吸光度から推定される濾過物質の回収をほぼ終了した。このとき、濾過液への回収率は、２８０ｍｎならびに３２０ｎｍにおける吸光度を指標として、それぞれ８２％ならびに７８％であった。限外濾過後、濾過されなかった非透析液１６０ｍｌを回収し、その容積を１０分の１にまで減圧濃縮した後、凍結乾燥し、乾燥物２３ｍｇを得た。この標品をＡ−２とした。一方、限外濾過後の透析液６００ｍｌについても同様にその容積を１０分の１にまで減圧濃縮した後、凍結乾燥し、乾燥物２６０ｍｇを得た。この標品をＡ−３とした。
【００１９】以上の抽出ならびに分画の結果を要約すると表１の通りである。

【００２０】 第五に、得られた３画分Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３について、ＲＯ患者由来滑膜線維芽細胞に対する増殖抑制効果ならびにＩＬ−６生産抑制効果を測定した。ここで９６穴プラスチック培養皿の各ウエルに滑膜線維芽細胞１ｘ１０３個を含むＲＰＭＩ１０ＦＢＳ培養溶液０．５ｍｌを播種し、さらにそれぞれのウエルに凍結乾燥した分画物を無添加、０．２ｍｇ／ｍｌ添加あるいは２ｍｇ／ｍｌ添加し、３日間培養した後に増殖率の測定をＭＴＴ法にて行い、またＩＬ−６の生産性をＥＬＩＳＡ法によって行った。
【００２１】以上の実験の結果は表２に示す通りである。

【００２２】表２に示すように、Ａ−１分画が０．２ｍｇ／ｍｌの添加量でＲＡ細胞の増殖ならびにＩＬ−６生産能を著しく抑制することは、さきに図２ならびに図３で示した結果を追加確認すものであるが、Ａ−３分画添加群においても、同様な結果が得られたにも関わらず、Ａ−２分画では増殖抑制、ならびにＩＬ−６生産抑制ともに弱く、しかもＡ−２分画の回収量はＡ−３分画の１０％以下であることから、杠柳熱水抽出物中のＲＡ滑膜線維芽細胞増殖抑制ならびにＩＬ−６生産抑制作用を示す作用物質はその大部分がＡ−３分画に回収されたものと結論される。
【００２３】第六に、ここで得られた分画、Ａ−３について、その物質の物理化学的特性を明らかにした。すなわち、その紫外領域の吸収曲線を図４に、その赤外領域の吸収曲線を図５に、さらに分析的ゲル濾過装置によって測定した分子量分布を図６に示した。ここで、紫外線吸収曲線は、濃縮・凍結乾燥する以前のＡ−３分画を５倍希釈し、従って９０μｇ／ｍｌの濃度でＵ−２０００型日立ダブルビーム分光光度計を用いて測定したものである。また赤外吸収は、ＦＴ−７１０型フーリエ変換赤外分光光度計（（株）堀場製作所）で測定したものである。さらにまた、分画の分子量分布は、吸光度２８０ｎｍの吸収を指標として、Ａｓａｈｉ Ｐａｃｋ ＧＦ−５１０ＨＱゲル濾過カラムをＷａｔｅｒｓ社製アライアンスＨＰＬＣシステムに着装して測定したものであり、Ａ−２分画ならびに分画前の熱水抽出物であるＡ−１試料との比較で測定を行った。
【００２４】図４に示す紫外領域の吸収スペクトラムは、２８０ｎｍ付近ならびに３２０乃至３３０ｎｍ付近の２領域に高いピークを示した。このような二峰性の吸収曲線はフラボノイドの存在を示唆するものである（家森幸男他編「大豆イソフラボン」幸書房（２００１））。また図５に示す赤外領域の吸収スペクトラムにおいて、１０５０ｃｍ−１付近の吸収は糖質（Ｃ−ＯＨ構造）の存在を、１４００ｃｍ−１付近の吸収は糖質、飽和炭化水素あるいは複素芳香環、１５５０乃至１６５０ｃｍ−１付近の吸収は（芳香環）＝Ｏ構造、複素芳香環、あるいはアミノ酸の存在を示すものである（島内武彦「赤外線吸収スペクトル解析法」南江堂（１９８０））。また図６に示す分子量分布から、Ａ−３分画からはＡ−１分画の高分子成分であり、Ａ−２分画に濃縮されている分子量約９０００ドルトンの成分は除去されており、Ａ−３分画の主成分は分子量３０００から１５００ドルトン付近に少なくとも３つのピークを有する混合物であること、ならびにこれらのピークは、未分画Ａ−１試料に含まれるピークと対応するものであることが明らかであった。これら化学組成についての総合的な結論として、Ａ−３分画はフラボノイド配糖体が主成分であることが推定される。
【発明の効果】１．古来より中国において、五加皮あるいは北五加皮の名称で、漢方薬ならびに薬用酒の原料として使用されてきたにも関わらず、その作用が明確でなかった杠柳（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）樹皮ならびに根皮の熱水抽出物を、抽出分画して科学的特性を一部明らかにするとともに、ＲＡ患者ならびにＯ患者由来の滑膜線維芽細胞の増殖の抑制ならびにＩＬ−６産生の抑制という科学的に作用の知れた抗関節障害作用物質として取り扱うことを可能とした。
２．従来知られているリュウマチ性関節炎ならびに変形性関節症に対する薬剤に加えて、新たな薬剤あるいは機能性食品の素材を提供した。
【出願人】 【識別番号】０００１３９２４１
【氏名又は名称】株式会社ローマン工業
【識別番号】５０１３３３３９７
【氏名又は名称】財団法人河野臨床医学研究所
【出願日】 平成１３年７月１９日（２００１．７．１９）
【代理人】
【公開番号】 特開２００３−３４６４５（Ｐ２００３−３４６４５Ａ）
【公開日】 平成１５年２月７日（２００３．２．７）
【出願番号】 特願２００１−２５２１１７（Ｐ２００１−２５２１１７）