| 【発明の名称】 |
食用鳥類解体残渣の水溶性分画物 |
| 【発明者】 |
【氏名】政 孝浩
【氏名】冨永 明宏
【氏名】安食 親孝
【氏名】多和田 明
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| 【要約】 |
【課題】ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む、食用鳥類解体残渣の水溶性分画物及び水溶性分解物を提供すること。
【解決手段】少なくとも硬骨、軟骨および皮を含む食用鳥類解体残渣を、温水抽出、油分除去およびタンパク質解酵素処理からなる前処理工程の１以上を組み合わせて処理して得られる、ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む、食用鳥類解体残渣の水溶性分解物および該分解物を膜分画して得られる水溶性分画物。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣の水溶性分画物であって、該分画物はペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含み、該分画物はコンドロイチナーゼABC易消化性成分を0.01〜0.1重量％含み、該グリコサミノグリカン中コンドロイチン硫酸及び／又はデルマタン硫酸からなる画分のN-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸とN-アセチル-D-ガラクトサミン6-硫酸の量比が、高速液体クロマトグラフィーにおける面積比で９：１〜６：４であり、該ペプチド及びタンパク質が５０〜９５重量％含まれる食用鳥類解体残渣の水溶性分画物。
【請求項２】 該ペプチド及びタンパク質の主要構成アミノ酸がグリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸である請求項１記載の食用鳥類解体残渣の水溶性分画物。
【請求項３】 少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣を温水抽出、油分除去及びタンパク質分解酵素処理からなる前処理工程の１以上を組み合わせて処理した後、膜分画処理して得られる請求項１又は２に記載の食用鳥類解体残渣の水溶性分画物。
【請求項４】 少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣を温水抽出、油分除去及びタンパク質分解酵素処理からなる前処理工程の１以上を組み合わせて処理して得られるペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む食用鳥類解体残渣の水溶性分解物。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣から得られる、ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む食用鳥類解体残渣の水溶性分画物ならびに水溶性分解物に関する。
【０００２】
【従来の技術】グリコサミノグリカンは、コラーゲン等と結合して組織細胞を形成し、体液の形で体内のいたるところに存在しており、この体液は、細胞の隙間を埋めて皮膚に潤いを与えたり、関節において潤滑油の役割を果たすなど、人体にとって非常に重要な役割を果たしている。このため、グリコサミノグリカンは医薬分野、化粧品分野、食品分野等に広く用いられている。特にグリコサミノグリカンの一種であるヒアルロン酸は、鶏冠（鶏のトサカ）からの抽出精製あるいは細菌類の培養により工業的に生産され、医薬品、化粧品として使用されている。
【０００３】近年食品分野においてヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカンが健康食品、サプリメントとして利用され始め注目されている。例えば特開平９−９８７３９号公報には種々の動物、植物原料から抽出されたムコ多糖（グリコサミノグリカン）とペプタイドとが結合した複合ムコ多糖を有する健康食品が開示され、また特許第２７８７２５４号公報には鶏冠から蛋白質分解酵素で酵素分解してペプタイド状にした蛋白質とヒアルロン酸を有する食品が開示されている。
【０００４】上記特許公報等に開示された健康食品を含め、従来、生体由来のグリコサミノグリカンの抽出は、生体を腑分けしてから各組織、臓器毎に区分けし、特に鶏の場合は、主にトサカ、軟骨あるいは腎臓等の限られた部位から個別に抽出して行うことが一般的であった。この従来型の抽出法は原材料の中で出発材料となるもの及び食用材料となるもの以外は廃棄され、これら廃棄物の活用の道は閉ざされており、原材料の有効活用はなされていなかった。
【０００５】更に煩雑な抽出工程を経て得られる精製されたグリコサミノグリカンは、それ自身では健康食品あるいは機能性食品としては比較的高価なもので、用途が限られていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】しかし、近年鶏の骨格筋においてもグリコサミノグリカンの存在が報告（Brandan E.(1994)Braz. J. Med. Biol. Res. 27(9),2109-16）されたことから、本発明者らは、従来産業廃棄物として処理されていた食用鳥類解体残渣、すなわち鶏等の食用鳥類から肉類、食用臓器を除いた残渣（例えば廃鶏等）を有効利用すべく鋭意検討した結果、少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣より、健康食品、栄養補助食品あるいは機能性食品として摂取可能な、ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む水溶性分画物を得、食用鳥類解体残渣（例えば廃鶏等）の有効利用につながる本発明に至った。
【０００７】すなわち、本発明は、少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣の水溶性分画物であって、該分画物はペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含み、該分画物はコンドロイチナーゼABC易消化性成分を0.01〜0.1重量％含み、該グリコサミノグリカン中コンドロイチン硫酸及び／又はデルマタン硫酸からなる画分のN-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸とN-アセチル-D-ガラクトサミン6-硫酸の量比が、高速液体クロマトグラフィーにおける面積比で９：１〜６：４であり、該ペプチド及びタンパク質が５０〜９５重量％含まれる食用鳥類解体残渣の水溶性分画物に関する。
【０００８】更に本発明は、少なくとも硬骨、軟骨及び皮を含む食用鳥類解体残渣を温水抽出、油分除去及びタンパク質分解酵素処理からなる前処理工程の１以上を組み合わせて処理して得られるペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む食用鳥類解体残渣の水溶性分解物に関する。
【０００９】ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンは、近年健康食品、栄養補助食品もしくは機能性食品として広く普及していることから、上記成分を含む本発明の水溶性分画物又は水溶性分解物は、ヒト、家畜、ペット等の前記食品、飼料として利用することが可能であり、さらに皮膚化粧料、毛髪化粧料、シャンプー等の原料として化粧品分野にも利用可能である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において食用鳥類とは、鶏、あひる、鴨、合鴨、鵞鳥、うずら、すずめ等を意味し、より一般的には鶏が好ましく用いられる。
【００１１】食用鳥類解体残渣とは、屠殺処理された食用鳥類より頭、羽根、足及び内臓を除去し、骨肉分離器にかけることにより食用となる肉を取り除いた、硬骨、軟骨及び皮を含む材料を意味する。ただし、骨に付着して除ききれなかったり、混入した肉（付着肉）、内臓を含む材料である。また、グリコサミノグリカンとは、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸を意味する。
【００１２】コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン4-硫酸（コンドロイチン硫酸A）、コンドロイチン6-硫酸（コンドロイチン硫酸C）、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）及びそれらのポリ硫酸化物ならびにヒアルロン酸に作用し、それぞれ対応する不飽和二糖硫酸を生成する酵素である。より具体的には、プロテウス・ブルガリス等の細菌由来のコンドロイチナーゼABC（例えば生化学工業（株）からの市販品）が好ましく、これは脱離酵素で、コンドロイチン4-硫酸（コンドロイチン硫酸A）、コンドロイチン6-硫酸（コンドロイチン硫酸C）、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）、コンドロイチン及びヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸残基をもつ２糖を主に生成し、ケラタン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸には作用しない酵素である。以下に本発明の食用鳥類解体残渣の水溶性分画物を得るための具体的手法を示す。
【００１３】まず硬骨、軟骨及び皮（付着肉を含む）が混在する食用鳥類解体残渣の重量を測定し、４０℃〜１００℃の温水中において約５分〜３０分加熱処理及び油脂等の抽出処理を行い、表面に浮いてくる油脂分、固形分等を金網などですくい取ったり、遠心分離して除去する。このように温水抽出された解体残渣処理物を水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム等のアルカリ、望ましくは0.5N NaOH溶液下、５０℃の恒温槽で約１時間から６時間処理し、タンパク質の一部を変性させることによりタンパク質とグリコサミノグリカン鎖を切り離す。アルカリ処理後、氷水等で冷却し、塩酸、硫酸、酢酸等の酸を用いてｐHを約９に調整する。続いてトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ、サーモリシン（和光純薬社製）、アクチナーゼ（科研製薬社製）等のタンパク質分解酵素、好ましくはプロナーゼ等のアルカリプロテアーゼを加え、使用するタンパク質分解酵素の至適条件、例えばプロナーゼの場合、ｐHを約９に調整し、５０℃の恒温槽で約１時間から４８時間反応させることにより、溶液中の遊離タンパク質及びグリコサミノグリカン鎖に結合しているタンパク質を分解する。得られた分解物を濃縮等の不溶物除去工程に付し、未分解物及び硬骨からなる不溶物を濾過、遠心分離等の固液分離手段により除き、ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む水溶液（請求項４の水溶性分解物）を得る。
【００１４】本発明の水溶性分解物の製造法は、上記の方法、順序に限定されるものではなく、温水抽出、油分除去、タンパク質分解酵素処理を原料等に応じて適宜組み合わせて行えばよい。要は、原料中のグリコサミノグリカンが十分に抽出され、タンパク質が適度に分解される方法であればよい。ここで得られた抽出分解物は、次いで行われる精製工程を経なくても健康食品、栄養補助食品、機能性食品、化粧品、飼料あるいはそれらの原材料として使用可能である。
【００１５】上記で得られた水溶液を濃縮し、水溶性有機溶媒、好ましくはアルコール、より好ましくはエタノールを加えることにより沈殿を得、アミノ酸などを除去する。得られた沈殿を脱イオン水等に溶解し、透析、限外濾過、逆浸透処理等の膜処理（例えば、約１時間〜７２時間流水透析）を行い、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩を除く。得られた膜処理液をアンバーライトIR-120B（オルガノ社製）、Dowex 50X4（ダウケミカル社製）、ダイアイオンSK、ダイアイオンPK、ダイアイオンHPK（いずれも三菱化学社製）等の陽イオン交換樹脂に通し、通過液のｐHを約６〜８に調整後、水溶性有機溶媒、好ましくはアルコール、より好ましくはエタノールを加えることにより沈殿を得、アミノ酸及び他の混在物（例えば、変性コラーゲン、不溶化した変性タンパク質等）をさらに除去する。得られた沈殿を脱イオン水等に溶解後、好ましくは凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥等の乾燥処理に付すことによって、目的物質である食用鳥類解体残渣の水溶性分画物（請求項１の水溶性分画物）を得る。
【００１６】この水溶性分画物を脱イオン水に溶解し、Dowex 1X2（ダウケミカル社製）、Ecteola-セルロース（ナカライテスク社製）、DEAE-セルロース（和光純薬社製）、DEAE-セルロファイン（生化学工業（株）販売）、DEAE-セファデックス（ファルマシアバイオテク社製）、ダイアイオンSA、ダイアイオンPA、ダイアイオンHPA（いずれも三菱化学社製）等を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、濃度を変えた塩（塩化ナトリウム等）で溶出させた各画分中のグリコサミノグリカンを、コンドロイチナーゼABCで消化し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて二糖分析をおこなった。一方、該水溶性分画物に含まれるペプチド、タンパク質のアミノ酸分析は常法（アミノ酸分析機を用いた特殊アミノ酸分析法）に従っておこなった。
【００１７】本発明の水溶性分画物は、ペプチド、タンパク質及びグリコサミノグリカンを含み、該分画物はコンドロイチナーゼABC易消化性成分を0.01〜0.1重量％含み、該グリコサミノグリカン中コンドロイチン硫酸及び／又はデルマタン硫酸からなる画分のN-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸とN-アセチル-D-ガラクトサミン6-硫酸の量比は、高速液体クロマトグラフィーにおける面積比で９：１〜６：４であり、また、該水溶性分画物に含まれる、ペプチド及びタンパク質の比率は約５０〜９５重量％であり、その主要構成アミノ酸は、含量の多い順に、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸である。他のアミノ酸としてはアラニン、プロリン、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、メチオニン、システインが含まれる。
【００１８】コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、及びデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）の主要構成成分は、それぞれ、N-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸とD-グルクロン酸、N-アセチル-D-ガラクトサミン6-硫酸とD-グルクロン酸、ならびにN-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸とL-イズロン酸又はD-グルクロン酸であることから、本発明の水溶性分画物は、コンドロイチン硫酸A及び／又はデルマタン硫酸を多く含有することがわかる。更に、本発明の水溶性分画物は上記成分に加えて、金属、核酸（DNA，RNA）、グルコース等の還元糖及びグリコサミノグリカン以外の多糖などを含む。
【００１９】
【実施例】〈水溶性分画物の調製〉鶏の解体残渣（廃鶏；静岡県成鶏加工協同組合より入手）1.6kgを温水で10分間煮沸して、表面に浮いてきた油脂分(141.26g)を金網ですくい取った。煮沸後、固形物（1.245kg）を5Lの三角フラスコに移し、0.5N NaOHを2L加え、50℃の恒温槽で1時間40分処理した。処理後氷水で冷却し、6N HCl でpH9に調整した。次にエスペラーゼ（ノボノルディスク社製）を加えpH を9に調整し、50℃の恒温槽で酵素反応させた (液量は3.2L)。
【００２０】反応後金網を用いて未分解物及び骨片（378.6g）を分別除去し、4Lの濾液を得た。濾液4L中に含まれる抽出物重量は866.4g（対原料比：54.15%）であった。この濾液を濃縮し1.25Lとした。これに４倍量のエタノール（EtOH）を加え粗標品（本発明の水溶性分解物）を沈殿させた。上記粗標品を脱イオン水に溶解し、約３時間流水透析を行った。透析後の液(800ml)をアンバーライトIR-120B(φ4×34cm)にアプライし、通過液をpH7.0に調整し、EtOH沈殿をした。得られた沈殿を少量の脱イオン水にとかし、凍結乾燥を行い、本発明の水溶性分画物34.0g(対原料比：2.13%)を得た。
【００２１】〈水溶性分画物中のコンドロイチナーゼABC易消化性成分の分析〉上記の凍結乾燥分画物3.5gを50mlの脱イオン水に溶解し、Dowex 1X2 (100-200mesh)にアプライし、イオン交換クロマトグラフィーを行った。ウロン酸をカルバゾール反応で確認し、塩化ナトリウム濃度0.5M、1.25M、1.5M、1.8M、2.0Mによるステップワイズ（各1L）で溶出した。溶出された各画分をコンドロイチナーゼABC（生化学工業（株）製）で消化し、HPLCにより、不飽和コンドロ二糖キット（生化学工業（株）製）を用いて二糖（不飽和二糖）分析を行った。
【００２２】その結果を表１に示す（原料１kg当たりに得られる本発明の水溶性分画物21.25g中の数値に換算(mg)、二糖分析結果は、原料１kg当たりの対応する代表的構成二糖の存在量（mg）を示す）。
【００２３】
【表１】分析結果
【００２４】ΔDi-HA：Δ4,5-グルクロニド-N-アセチル-D-グルコサミンΔDi-0S：Δ4,5-グルクロニド-N-アセチル-D-ガラクトサミンΔDi-4S：Δ4,5-グルクロニド-N-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸ΔDi-6S：Δ4,5-グルクロニド-N-アセチル-D-ガラクトサミン6-硫酸【００２５】結果、コンドロイチナーゼABCによって分解されうるグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸）は、原材料1kg当たり約325mg(約0.03%)であった。二糖分析の結果より得られた各画分におけるN-アセチル-D-ガラクトサミン4-硫酸／N-アセチル-D-ガラクトサミン6-硫酸比は以下の通りであった。
【００２６】・0.5M画分では0Sが主なピーク（ヒアルロン酸、コンドロイチン）として観測された。
・1.25M画分では4-S／6-S比は64:36であった。
・1.5M画分では4-S／6-S比は69:31であった。
・1.8M画分では4-S／6-S比は85:15であった。
・2.0M画分では4-S／6-S比は88:12であった。
【００２７】上記の結果より本発明の水溶性分画物は、コンドロイチン硫酸及び／又はデルマタン硫酸を多く含み、特にコンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸A（コンドロイチン4-硫酸）の含量が多いことが証明された。
【００２８】〈ペプチド／タンパク質含量及びアミノ酸分析〉水溶性分画物試料に0.02mol/L塩酸1 mLを加えて溶解したものを被験液とし、日立高速アミノ酸分析機L-8500（日立製作所社製）を用いて複数回（６回）試験した結果から平均値を算出した。
【００２９】結果、上記水溶性分画物中に含まれるタンパク質含有量は88%であり、そのアミノ酸組成比は含有量の多い順にグリシン(26.87%)、グルタミン酸(15.61%)、アスパラギン酸(13.47%)、アラニン(7.67%)、プロリン(7.56%)、リジン(5.83%)、アルギニン(5.29%)、セリン(4.25%)、スレオニン(3.23%)、ロイシン(2.36%)、バリン(2.00%)、イソロイシン(1.54%)、フェニルアラニン(1.24%)、チロシン(1.14%)、ヒスチジン(1.13%)、メチオニン(0.60%)、システイン(0.21%)であった。
【００３０】
【発明の効果】従来産業廃棄物として処分されてきた食用鳥類解体残渣（廃鶏等）の有効利用を図るとともに、高価であったグリコサミノグリカン含有健康食品、栄養補助食品あるいは機能性食品をより安価に提供することができる。
【００３１】更に本発明の水溶性分画物はコンドロイチン硫酸の含量が多いことから、これを経口で服用することにより、血中脂質濃度の改善及び慢性の関節痛に効果が期待される。さらにグリコサミノグリカンとタンパク質、ペプチドを含むので化粧品原料としても利用可能である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００１９５５２４
【氏名又は名称】生化学工業株式会社
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| 【出願日】 |
平成１４年４月５日（２００２．４．５） |
| 【代理人】 |
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| 【公開番号】 |
特開２００３−２８９８１１（Ｐ２００３−２８９８１１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１５年１０月１４日（２００３．１０．１４） |
| 【出願番号】 |
特願２００２−１０３１３７（Ｐ２００２−１０３１３７） |
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