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【発明の名称】 毒素産生菌類の殺菌方法および生成毒素の不活性化方法
【発明者】 【氏名】鈴木 鐵也
【要約】 【課題】毒素産生菌類の殺菌、および、当該毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化を、特殊な装置を要することなく、少ないエネルギーの消費で効率よく行うことができる処理方法を提供する。

【解決手段】毒素産生菌類を殺菌する処理液として、また、当該毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化する処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水する有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用し、電解生成酸性水が有する高水準の有効塩素および溶存酸素の作用にて、殺菌しかつ不活性化する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】毒素産生菌類を殺菌する方法であり、殺菌処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用することを特徴とする毒素産生菌類の殺菌方法。
【請求項２】請求項１に記載の毒素産生菌類の殺菌方法において、前記殺菌処理液は、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水であって、ｐＨが２．０〜３．５の範囲で、有効塩素濃度が２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲で、かつ、溶存酸素濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にあることを特徴とする毒素産生菌類の殺菌方法。
【請求項３】請求項１に記載の毒素産生菌類の殺菌方法において、殺菌処理の対象とする毒素産生菌類は、真菌類、ブドウ球菌類または桿菌類であることを特徴とする毒素産生菌類の殺菌方法。
【請求項４】毒素産生菌類が産生する生成毒素を不活性化する方法であり、不活性化処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用することを特徴とする毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化方法。
【請求項５】請求項４に記載の生成毒素の不活性化方法において、前記不活性化処理液は、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水であって、ｐＨが２．０〜３．５の範囲で、有効塩素濃度が２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲で、かつ、溶存酸素濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にあることを特徴とする毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化方法。
【請求項６】請求項４に記載の生成毒素の不活性化方法において、不活性化処理の対象とする生成毒素は、真菌類、ブドウ球菌類または桿菌類が産生する生成毒素であることを特徴とする毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、毒素を産生する菌類（本発明ではこれを毒素産生菌類と称する）の殺菌方法、および、当該毒素産生菌類により産生された毒素（本発明ではこれを生成毒素と称する）の不活性化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品や飼料等の安全性を確保することは、ヒトや家畜等にとって極めて重要な要素の一つである。有毒な菌類（毒素産生菌類）およびその生成物（生成毒素）により汚染された食品や飼料等は、ヒトや家畜等の健康を害する原因となることから、食品や飼料等を汚染している毒素産生菌類を殺菌し、かつ、毒素産生菌類が産生する生成毒素を不活性化することは、食品や飼料等の安全性を確保するための重要な手段である。食品や飼料等を汚染して食中毒の原因となる微生物は多く存在するが、その代表例としては、真菌類、ブドウ球菌類、桿菌類等を挙げることができる。
【０００３】食品の安全管理については、大規模な食中毒の発生を防ぐため、食中毒の原因となる病原性菌類の防除、増殖の抑制、殺菌等を重要視して、食品業界では、危害分析重要管理点という評価基準を設けて、この評価基準に適合する技術の開発を要請している。食品業界では、この要請に基づいて、食品のオゾン処理、電子ビーム放射処理等の技術が提案されている。また、特定された菌類である真菌およびその生成毒素であるアフラトキシンに対しては、高温によるアンモニアガス処理等が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】すでに提案されているこれらの安全対策は、いずれの手段も、毒素産生菌類の殺菌を主たる目的としているもので、毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化が不十分であったり、また、生成毒素の不活性化に十分な効果が認められる手段にあっては、食品の品質を損なうおそれがあるものであって、必ずしも実用的であるとは認められない。その上、これらのいずれの手段においても、処理に要するエネルギーの消費量が大きく、かつ、特殊な処理装置を必要とすることから、コスト的にも問題がある。このため、近年では、食品や飼料等の汚染防止の対策として、効果的で、かつ、省エネルギーを意図した技術のさらなる開発が要請されている。
【０００５】本発明者は、電解生成酸性水の殺菌作用に着目してかかる問題に対処しようとするもので、その主たる目的は、毒素産生菌類の殺菌、および、当該毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化を、特殊な装置を要することなく、少ないエネルギーの消費で効率よく行うことができる処理方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、毒素産生菌類の殺菌方法、および、毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化方法に関するものであり、本発明に係る毒素産生菌類の殺菌方法にあっては、殺菌処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用することを特徴とするものである。また、本発明に係る生成毒素の不活性化方法にあっては、不活性化処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用することを特徴とするものである。
【０００７】本発明に係る殺菌方法および不活性化方法で採用する殺菌処理液および不活性化処理液としては、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水であることが好ましく、さらには、ｐＨが２．０〜３．５の範囲で、有効塩素濃度が２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲で、かつ、溶存酸素濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にある強酸性の電解生成酸性水であることがより好ましい。
【０００８】本発明に係る毒素産生菌類の殺菌方法、および、生成毒素の不活性化方法は、特に、真菌類、ブドウ球菌、桿菌等の殺菌処理に、また、これらの菌類が産生する生成毒素、すなわち、アフラトキシン、ブドウ球菌腸管毒素Ａ（黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ…ＳＥＡ）、バチルスセレウス毒素等の不活性化処理に好適に採用できる。
【０００９】
【発明の作用・効果】本発明に係る毒素産生菌類の殺菌方法においては、殺菌処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用しているものであり、当該電解生成酸性水が含有する高水準の有効塩素および溶存酸素の作用により、毒素産生菌類を迅速かつ効果的に殺菌することができるものである。また、当該電解生成酸性水が含有する殺菌能を有する有効塩素および溶存酸素は、殺菌処理中にまたはその後に速やかに消失して食品、飼料等の被処理物に残留することがなく、被処理物の処理後の安全性も十分に確保されるものである。
【００１０】また、本発明に係る生成毒素の不活性化方法においては、不活性化処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用しているものであり、当該電解生成酸性水が含有する高水準の有効塩素および溶存酸素の作用により、毒素産生菌類が産生する生成毒素を迅速かつ効果的に不活性化することができるものである。また、当該電解生成酸性水が含有する不活性化能を有する有効塩素および溶存酸素は、不活性化処理中にまたはその後に速やかに消失して食品、飼料等の被処理物に残留することがなく、被処理物の処理後の安全性も十分に確保されるものである。
【００１１】本発明に係る殺菌方法および不活性化方法においては、殺菌処理液および不活性化処理液として、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用することが好ましく、さらには、ｐＨが２．０〜３．５の範囲で、有効塩素濃度が２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲で、かつ、溶存酸素濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にある強酸性の電解生成酸性水を採用することが好ましい。当該電解生成酸性水を採用すれば、毒素産生菌類を迅速かつ効果的に殺菌でき、また、生成毒素を迅速かつ効果的に不活性化することができることは勿論であるが、被電解水が塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする希薄水溶液であることから、被処理物の処理後の安全性は一層確実に確保される。
【００１２】本発明に係る毒素産生菌類の殺菌方法、および、生成毒素の不活性化方法は、特に、急性の肝臓障害や肝臓癌を惹起する真菌類、および、真菌類が産生する生成毒素に対して極めて有効な方法であり、また、大規模な食中毒を発生させるブドウ球菌類、および、ブドウ球菌類が産生する生成毒素、なかでも、黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａに対しても極めて有効な方法である。
【００１３】なお、本発明に係る毒素産生菌類の殺菌方法、および、生成毒素の不活性化方法においては、桿菌等の殺菌処理や、桿菌類が産生するバチルスセレウス毒素の不活性化にも有効である。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、毒素産生菌類の殺菌方法、および、毒素産生菌類が産生する生成毒素の不活性化方法に関するものである。毒素産生菌類の殺菌処理および生成毒素の不活性化処理においては、殺菌処理液および不活性化処理液として、無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を採用するものである。殺菌処理液および不活性化処理液の好適な態様としては、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする無機塩、特に、食塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解により、電解槽の陽極側の電解室にて生成される強酸性の電解生成酸性水であって、ｐＨが２．０〜３．５の範囲で、有効塩素濃度が２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍで、かつ、溶存酸素濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にあるものである。
【００１５】本発明が殺菌処理の対象とする菌類は、毒素を産生する能力を有する菌類、すなわち毒素産生菌類であって、その菌類タイプには何等限定されるもではなく、各種タイプの毒素産生菌類を殺菌処理の対象とするものである。また、本発明が不活性化処理の対象とする生成毒素は、殺菌処理の対象とする毒素産生菌類が産生する生成毒素である。本発明が殺菌処理の対象とする菌類を例示すれば、アスペルギルスフラバス、アスペルギルスパラチティカスや、スタフィロコッカス（黄色ブドウ球菌）、ビブリオ、ウイルス、サルモネラ、バチラス等の食中毒を惹起する菌類等を挙げることができる。
【００１６】これらの毒素産生菌のうち、その代表例の一つであるアスペルギルスフラバス、アスペルギルスパラチティカス等の真菌によっては、真菌毒素（マイコトキシン）のうちの最も強力なアフラトキシンが生成され、アフラトキシンは急性の肝臓障害や肝臓癌を惹起する。また、代表例の他の一つであるスタフィロコッカス（黄色ブドウ球菌）によっては、８種類のスタフィロコッカス・エンテロトキシン（ブドウ球菌腸毒素）Ａ，Ｂ，Ｃ1，Ｃ2，Ｃ3，Ｄ，Ｅ，Ｆが生成される。スタフィロコッカス・エンテロトキシンのうちでは、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ブドウ球菌腸毒素Ａ…ＳＥＡ）が最も強力なもので、わずかな量で数時間のうちに食中毒を惹起する。
【００１７】本発明は、ＮａＣｌ等の無機塩の希薄水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される強酸性の電解生成酸性水を殺菌処理液としてこれらの毒素産生菌類を殺菌し、また、当該電解生成酸性水を不活性処理液として、これらの毒素産生菌類が産生する生成毒素を不活性化するものである。当該電解生成酸性水は、有隔膜電解槽を有する公知の電解水生成装置を電解運転することによって生成されるもので、電解槽を構成する陽極側の電解室にて生成される。当該電解運転では、同時に陰極側の電解室にて電解生成アルカリ水が生成される。
【００１８】当該電解水生成装置の電解運転では、各種の運転条件によって特性の異なる電解生成水が生成されるが、ＮａＣｌの０．１〜０．５重量％の希薄水溶液を被電解水として、区画された各電解室に配設されている各電極に直流電圧を印加することにより、陽極側の電解室にて、ｐＨが２．０〜３．５の範囲で、有効塩素濃度が２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲で、かつ、１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にある強酸性の電解生成酸性水が生成される。各電極に対する印加電圧は、被電解水を連続して流動しつつ電解する連続式電解と、被電解水を各電解室に停滞させて電解するバッチ式電解とでは異なるが、数Ｖ〜数十Ｖの範囲で適宜設定することにより、殺菌処理液おび不活性化処理液に好適な電解生成酸性水を得ることができる。
【００１９】表１には、特定された電解水生成装置を使用して生成された電解生成水の物理化学パラメーターを示しており、また、表２には、電解時間の電解生成酸性水の物理化学パラメーターに及ぼす影響を示している。表１および表２に示す電解生成水は、塩化白金を電極とし、イオン交換膜で区画された有隔膜電解槽を有する二室大容量型電解装置（葵電気株式会社製Ｓｕｐｅｒｏｘｓｅｅｄ Ｌａｂｏ ＪＥＤ−０２０ 静岡市函南）を使用して、バッチ式の電解方法で生成されたものであり、表１に示す電解生成水は、超純水とＮａＣｌで調製された１７．１ｍＭのＮａＣｌ希釈水溶液を被電解水とし、室温（２５℃）にて、電解電圧ＤＣ９〜１２Ｖで１０分間電解して生成されたものである。また、表２に示す電解生成酸性水は、超純水とＮａＣｌで調製された０．１重量％のＮａＣｌの希釈水溶液を被電解水とし、室温（２５℃）にて、電解電圧ＤＣ９〜１１Ｖで３０分までの間電解して生成されたものである。
【００２０】
【表１】

【００２１】
【表２】

電解生成酸性水、電解生成アルカリ水、および、被電解水の調製に使用した超純水の物理化学パラメーターには、大きな相違が認められる。表１に示す電解生成水の物理化学パラメータは、１７ｍＭのＮａＣｌ水溶液を被電解水として１０分間有隔膜電解して生成されたものであるが、電解生成酸性水は強酸性で、有効塩素濃度および溶存酸素濃度共に高く、ＯＲＰ（酸化還元電位）も高い。これに対して、電解生成アルカリ水は強アルカリ性で、溶存酸素の濃度は低く、有効塩素は皆無に近く、ＯＲＰは極端に低い。また、これらの電解生成水は、超純水とは物理化学パラメーターを明らかに異にし、電解生成酸性水は酸化率が高く、電解生成アルカリ水は還元率が高いことが確認される。なお、有効塩素濃度は、セントラル化学株式会社（東京都）製の「有効塩素計」により電量滴定法に基づいて測定したものである。
【００２２】強酸性の電解生成酸性水においては、酸化性成分として作用する有効塩素は、表２に示すように電解時間の長短により異なるものであって、有効塩素は経時的に漸次増大する。本発明においては、表１に示す物理化学パラメーターまたはこれに近似する物理化学パラメーターの電解生成酸性水を、殺菌処理液および不活性化処理液として採用するものである。
【００２３】強酸性の電解生成酸性水は、毒素産生菌類を殺菌する殺菌能を有する有効塩素および溶存酸素を大量に含有していることから、当該電解生成酸性水を毒素産生菌類を殺菌するための殺菌処理液として採用することにより、毒素産生菌類を迅速かつ効果的に殺菌することができる。また、当該電解生成酸性水が大量に含有する有効塩素および溶存酸素は、毒素産生菌類が産生する生成毒素を不活性化するための不活性化能を有することから、当該電解生成酸性水を不活性化処理液として採用することにより、生成毒素を迅速かつ効果的に不活性化することができる。
【００２４】当該電解生成酸性水では、含有する有効塩素および溶存酸素は、殺菌処理や不活性化処理中に、また、その処理後に速やかに消失して、食品、飼料等の被処理物に残留することがなく、被処理物の処理後の安全性を十分に確保されるが、特に、当該電解生成酸性水を生成するための被電解水として、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムを主要成分とする食塩等の希薄水溶液を採用する場合には、殺菌処理や不活性化処理後の食品、飼料等の被処理物には、健康に有害となるおそれがある物質が残留することは全くなく、被処理物の処理後の安全性は一層十分に確保される利点がある。
【００２５】
【実施例１】本実施例においては、食中毒の原因となり急性の肝臓障害や肝臓癌を惹起する真菌類の一種であるアスペルギルスパラチティカス、アスペルギルスパラチティカスが産生する真菌毒素の一種であるアフラトキシンを採用して、これらを殺菌および不活性化するための実験を行った。本実験では、殺菌処理液および不活性化処理液として、電解生成酸性水および電解生成アルカリ水を採用して処理し、処理の効果を、アフラトキシンの高性能薄層クロマトグラフイー分析（ＨＰＴＬＣ）、高性能液体クロマトグラフイー分析（ＨＰＬＣ）、ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８、および、同ＴＡ−１００菌株に対する突然変異誘発性試験によって評価した。結論的に云えば、アスペルギルスパラチティカスの殺菌およびアフラトキシンの不活性化には、強酸性の電解生成酸性水が極めて有効であり、電解生成アルカリ水ではその有効性は認められない。これは、強酸性の電解生成酸性水が高水準で含有する有効塩素と溶存酸素に起因するものと推測される。
【００２６】例えば、０．０１ｍＬ中１０3胞子の濃度のアスペルギルスパラチティカスは、５０倍量（０．５ｍＬ）の強酸性の電解生成酸性水の下では、その増殖が完全に抑制できた。ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８および同ＴＡ−１００菌株に対するアフラトキシンＢ1（ＡＦＢ1）の突然変異誘発性は、ＡＦＢ1を強酸性の電解生成酸性水で処理したものでは著しく弱くなることが確認された。また、ＡＦＢ1を強酸性の電解生成酸性水で処理した場合には、ＨＰＬＣ分析でのＡＦＢ1に相当するピークは認められず、ＡＦＢ1は強酸性の電解生成酸性水での処理によって分解されたことを確認した。これに対して、電解生成アルカリ水には、アスペルギルスパラチティカスの増殖抑制効果も、ＡＦＢ1の突然変異誘発性の低下も認められなかった。
【００２７】本実験の結果からすれば、強酸性の電解生成酸性水は、真菌類に対して強力な殺菌作用を有すること、真菌毒素（マイコトキシン）に対して強力な不活性化作用を有することが確認され、食品および飼料の処理に極めて有効であることが確認された。以下には、本実験の詳細な条件と結果を示す。
（１）アスペルギルス寄生菌の殺菌実験：大阪発酵研究所（大阪市道修町）から購入したアスペルギルスパラチティカスＩＦＯ−３０１７９（ＡＴＣＣ１５５１７相当）を用いて、真菌毒素産生菌類に対する電解生成水の抗菌作用を確認する実験を行った。凍結乾燥した菌類の胞子を、滅菌した蒸留水中に１０5（１０万個）胞子／ｍＬの濃度となるように懸濁させた後、アスペルギルスフラビンおよびアスペルギルスパラチティカス用に特定された液状媒体（ＡＦＡＰ媒体）に接種した。菌類を２〜１０時間増殖させた後、細胞数の概算のため部分標本を採り、培養菌を希釈して１０5（１０万個）ｃｆｕ／ｍＬ濃度の菌株細胞懸濁液を調製した。
【００２８】殺菌実験のため、１０3（１０００個）ｃｆｕを含む菌株細胞懸濁液１０μＬを多数用意し、これらに、ＮａＣｌの希薄水溶液を被電解水とする電解により生成された電解生成水を、０．０１ｍＬ、０．０２ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．５ｍＬを別々に混ぜ、室温で１２時間（一晩）培養した。次いで、各懸濁液に滅菌した蒸留水を１．０１ｍＬの量になるまで加え、その後、希釈されたサンプル液各０．５ｍＬをＡＦＰＡ寒天培地に接種して、２５℃で５日間培養した。殺菌効果の評価は、寒天プレート上の細菌コロニーの発生状態により評価した。なお、当該殺菌実験では、生物障害防止のため、全ての実験工程を隔離された安全ボックス内で行った。
（２）アフラトキシンの不活性化実験：殺菌実験で採用したアスペルギルスパラチティカスの二次代謝物であるアフラトキシンの不活性化実験を行った。高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）で分析したアフラトキシンＢ1，Ｂ2，Ｇ1，Ｇ2を１０ｎｇずつ混合した計４０ｎｇ、および、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析したアフラトキシンＢ1（ＡＦＢ1）のみの１０ｎｇに電解生成水を加え、突然変異誘発性を調べるために、これらの液をクロロホルムに浸した。クロロホルムを、窒素ガスを流しながら慎重にアフラトキシンから蒸発させ、異なった量の電解生成水を１０分間加えて、アフラトキシンの分解を確認した。ＡＦＢ1の不活性化実験では、０℃、２０℃、３０℃、４５℃の温度で、異なる処理時間で繰り返し行い、処理温度および処理時間の２つのパラメーターがアフラトキシンの電解生成水による分解に及ぼす影響を確認した。
【００２９】なお、アフラトキシンは、毒性が強くて肝癌誘発性であるため、その取り扱いは安全キャビネット内で行い、体内に摂取しないように、ゴム手袋と保護マスクを着用して行った。実験後は、余剰の電解生成酸性水でアフラトキシンを分解処理し、密閉した試験管に入れて、１２０℃で１５分間オートクレーブによる消毒を行ってから廃棄した。
【００３０】電解生成水の反応性化学種は完全には特定されていないが、電解生成酸性水中の主要な反応化学種は次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）である。しかしながら、アフラトキシン溶液の電解生成酸性水に対するモル濃度混合比は、有効塩素濃度および／または次亜塩素酸濃度のｎｍｏｌ値を元に算出したため、１：１〜１：２００までの幅がある。一方、電解生成アルカリ水の反応性化学種は、ＮａＯＨと溶解水素以外は知られていないため、１０倍量の電解生成アルカリ水をＡＦＢ1に混合した。電解生成水のいずれの実験でも、１０分間培養した後に無水エタノールを最終的に１ｍｌの量となるように加えた。
【００３１】比較例として、現在食材の殺菌に使用されているＮａＯＣｌの、ＨＰＴＬによるＣＡＦＢ1斑点の消失に対する効果を確認するため、ＡＦＢ1にＮａＯＣｌ水溶液を８：１の比率（有効塩素のＡＦＢ1に対するモル濃度比）で室温で１０分間、アルカリ性および酸性の両方の条件で混合した。ＮａＯＣｌはそれ自体、強アルカリ性（ｐＨ１１．５）であるため、ＮａＯＣｌに０．０１ＮのＨＣｌ水溶液を慎重に加えてｐＨ３．０まで下げて弱酸性の処理液を調製して、この処理液にＡＦＢ1を混合した。
【００３２】本実験では、ＡＦＢ1の分解状態を、先ず、ＨＰＴＬＣおよびＨＰＬＣによるクロマトグラフィーのパターン上の変化に基づいて評価し、その後、ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８および同ＴＡ−１００の菌株に対する突然変異誘発性に基づいて評価した。
（３）ラジカル・スカベンジャーの効果：ＨＯＣｌから発生したＯＨ基および／またはＣｌ基等の反応性化学種が殺菌処理に関与していると仮定して、ＡＦＢ1の処理前に、ＯＨ基スカベンジャーと看なされているマンニトールとチオ尿素で電解生成酸性水の前処理を行った場合の効果を確認した。マンニトールは１：１０の比率（ＡＦＢ1の有効塩素に対するモル濃度比）で、また、チオ尿素は０．１：１の比率（チオ尿素の有効塩素に対するモル濃度比）で電解生成酸性水に加えた。この場合、有効塩素はＨＯＣｌのモル濃度に相当する。マンニトールおよびチオ尿素をそれぞれ含む各電解生成酸性水によるＡＦＢ1の処理は、室温で１０分間行い、ＣＨＣｌ3（クロロホルム）で反応生成物を抽出し、ＨＰＬＣで分離して、ＡＦＢ1中の変化を確認した。
（４）処理されたアフラトキシンのクロマトグラフィー分析：(4a)高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）：アフラトキシンを異なったモル濃度比の電解生成水で処理した後、エチルアルコールを１．０ｍＬまで加えるとともにエチルアセテートを０．５ｍＬ加えてよく振り、アフラトキシンと反応生成物を有機溶媒相に抽出した。エチルアセテートをＮ2ガスを流しながら慎重に蒸発させてから、新たにエチルアセテートを０．０１ｍＬ加えた。（アフラトキシン／電解生成水）反応混合液から抽出したエチルアセテート２０μＬと、ＡＦＢ1溶液またはアフラトキシン混合液のいずれか２０μＬを、電解生成水による処理の有無で、ＨＰＴＬＣプレート（１０×１０ｃｍのシリカゲル６０コーティング済みプレート）に載せ、ＣＨＣｌ3：アセトン＝９：１（ｖ／ｖ）の比率で７ｃｍ顕色した。アフラトキシンは、ＵＶ−Ａ（３６５ｎｍ）の照明で、青白い斑点として検出される。
(4b)高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：ＨＰＬＣ分析は、誘導体化の有無の条件で行った。初めに、ＡＦＢ1と電解生成酸性水に反応させたＡＦＢ1とを、ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ＝３５：６５（ｖ／ｖ）の混合液で、室温中、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎにて溶出した逆相オクタデシル・コラム（Ｚｏｒｂａｘ ＯＤＳ…４．６×２５０ｍｍ、ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ製）を用いて、ＨＰＬＣによる分析を行った。アフラトキシンは、ヘウレットパカードＨＰ１０４６Ａ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ１０４６Ａ）プログラム可能蛍光検知器で３６５ｎｍで励起し、４１２ｎｍで放射する蛍光光度法にて検出した。ＨＰＬＣによる分析前に、ＡＦＢ1と、電解生成酸性水に反応させたＡＦＢ1をトリフルオロアセチル誘導体に変換した。
【００３３】コントロールとして、エタノール１０μＬに１０ｎｇのＡＦＢ1を入れ、無水トリフルオロアセチル酸（ＴＦＡ−アンヒドリン）２０μＬを瓶に入れて密閉した状態でよく振り、トリフルオロアセチル化させた後、室温の暗所で１５分間培養した。その後、アセトン：水＝１：９（ｖ／ｖ）の混合液１８０μＬを加え、溶液をよく振って混ぜてから、ＨＰＬＣにかけた。同様に、反応させたＡＦＢ1溶液を真空状態で蒸発させて、上記した手順でトリフルオロアセチル化させた。
【００３４】次に、逆相コラムＯＤＳ−８０TM（４．６×１５０ｍｍ：ＴＯＳＯ社製 ＴＳＫ−Ｇｅｌ）で、化学的に誘導化せずに分析した。段階的溶出法を用いて、０分〜４０分後までは、１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で水中に３０％のアセトニトリルを流し、その後４０分〜７０分後まではアセトニトリルを３０％〜１００％に線形上昇させた。溶出物は上記した蛍光光度法にて測定した。ラジカル・スカベンジャー実験では、溶出のピークは３６５ｎｍで測定した。
（５）ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８および同ＴＡ−１００に対する突然変異誘発性実験：ＡＦＢ1の突然変異誘発性は、ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８および同ＴＡ−１００を用いて行い、従来のエームズ試験法に基づいて評価した。ヒスチジン・フレームシフト突然変異菌を含むヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８、および、ヒスチジン・ミスセンス突然変異菌を含むヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−１００の培養菌は、大阪発酵研究所（大阪市北区道修町）から購入したものである。
【００３５】２００ｎｇのＡＦＢ1（０．６４ｎｍｏｌ）に、０．７６ｎｍｏｌ等量のＨＯＣｌを含む電解生成酸性水１００μＬ、または、電解生成アルカリ水１００μＬを混ぜた後、２０μＬの部分標本を、Ｓ９混合液（ｐＨ７．５）またはリン酸塩緩衝液５００μＬに加え、次いで、１０7ｃｆｕ／ｍＬを含むヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８または同ＴＡ−１００を１００μＬ加えた。コントロールとしては、電解生成水に代えて、ジメチルスルホキシド１００μＬを加えた。
【００３６】混合液を十分に振って、３７℃で２０分間培養した後、ソフト寒天２ｍＬを加えてから、Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ Ｅ 寒天培地に接種して、３７℃で４８時間放置した。突然変異誘発性は、Ｓ９混合液が存在するときに発生する復帰変異体のコロニー数で評価した。その他の実験条件は、Ｓｗｅｎｓｏｎ他によるＡＦＢ1−２，３−ジクロライド（二塩化物）の突然変異誘発性分析と同様にした。
（６）ＥＳＲによるラジカル種の特定：電解生成酸性水をＥＳＲ分光鏡検査法にて分析し、水酸基（ＯＨ）が殺菌作用に関与しているか否かを確認した。電解生成酸性水２００μＬに、スピン拘束剤ＤＭＰＯ（５，５−ジメチル−１−ピロリン−酸化物）の８９０ｍＭ溶液１０μＬを混ぜてスピン付加物を作り、ＪＥＳ−ＲＥ３Ｘ／ＥＳＲ データシステムＥＳＰＲＩＴ３３０（ＪＥＯＬ）および上記した実験条件にてＥＳＲ分光鏡検査法による分析を行った。
（７）結果および考察：(7a)電解生成水によるアスペルギルスパラチティカスの殺菌効果：表３には、電解生成酸性水および電解生成アルカリ水を処理液として、アスペルギルスパラチティカスを殺菌処理した場合の結果を示している。当該殺菌処理では、１０μＬの細胞懸濁液（１０3ｃｆｕ）を、各処理液に種々の混合比に添加し、その後、ＡＦＡＰ寒天プレート上に接種して２５℃で５日間培養している。表３に示すコントロールとは、処理液を加えない場合を意味する。菌類の増殖については、ｃｆｕでは正確に測定できないので、増殖結果を半定量状態で表示している。
【００３７】
【表３】

すなわち、+++印は菌類がプレート上で完全に増殖している状態を示し、±印はわずかにコロニーを形成している状態を示し、−印は菌類の増殖が認められない状態を示している。処理液として強酸性の電解生成酸性水を採用する場合には、細胞懸濁液（１０3ｃｆｕ）の５０倍量でほぼ完全に殺菌することができる。一方、処理液として強アルカリ性の電解生成アルカリ水を採用する場合には、アスペルギルスパラチティカスを殺菌することはできない。
【００３８】また、図１は、上記した条件にて３０℃で５日間培養した状態の複数個のペトリ皿の表面を示す写真であり、これらの写真中、左下の写真（Control）はコントロール処理後のペトリ皿の表面上の菌類培養状態、右下の写真（×１０vol）は電解生成酸性水の１０倍量での処理後のペトリ皿の表面上の菌類培養状態、左上の写真（×２０vol）は電解生成酸性水の２０倍量での処理後のペトリ皿の表面上の菌類培養状態、上中央の写真（×５０vol）は電解生成酸性水の５０倍量での処理後のペトリ皿の表面上の菌類培養状態、右上の写真（×１００vol）は電解生成酸性水の１００倍量での処理後のペトリ皿の表面上の菌類培養状態を示している。
【００３９】これらの写真中、コントロール処理後のペトリ皿の表面を示す左下の写真（Control）、電解生成酸性水の１０倍量での処理後のペトリ皿の表面を示す右下の写真（×１０vol）、電解生成酸性水の２０倍量での処理後のペトリ皿の表面を示す左上の写真（×２０vol）では、ペトリ皿の表面に白い綿毛状の菌糸体が認めらる。これに対して、電解生成酸性水の５０倍量での処理後のペトリ皿の表面を示す上中央の写真（×５０vol）、電解生成酸性水の１００倍量での処理後のペトリ皿の表面を示す右上の写真（×１００vol）では、菌糸体の存在は全く認められない。
【００４０】以上の結果は、モデル実験で得られたもであり、実際に黒コショウとターメリックの表面に付着した真菌類を電解生成酸性水で殺菌処理した結果では、アスペルギルスパラチティカスを完全に殺菌するには、モデル実験で得た結果より大量の電解生成酸性水を要した。この場合、電解生成酸性水による処理後に電解生成アルカリ水で同様に処理すると、アスペルギルスパラチティカスを極めて効果的に殺菌除去することができることを確認した。アスペルギルスパラチティカスの殺菌処理において、互いに特性の異なる電解生成酸性水と電解生成アルカリ水を併用することは、有効な手段であるものと推測される。
(7b)アフラトキシン分解のＨＰＴＬＣ評価：アフラトキシンを異なったモル濃度比の電解生成水で処理した後、溶液のＨＰＴＬＣ分析を行った。その結果を、ＨＰＴＬＣの分析状態の写真として、図２の（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００４１】図２の（ａ）は、電解生成酸性水による処理の有無における、アフラトキシンＢ1，Ｂ2，Ｇ1，Ｇ2（各１０ｎｇ）の個別のＨＰＴＬＣと、これらの全ての混合物（アフラトキシンＢ1，Ｂ2，Ｇ1，Ｇ2Ｍｉｘ）の処理無しのＨＰＴＬＣとを示すものである。数字は、アフラトキシン混合物の電解生成酸性水に対するモル濃度混合比を示す。すなわち、（１）は１：１、（２）は１：４、（３）は１：６、（４）は１：８、（５）は１：１０、（６）は１：２０、（７）は１：４０、（８）は１：６０のモル濃度混合比を示している。
【００４２】図２の（ｂ）は、電解生成水による処理後のＡＦＢ1のＨＰＴＬＣの分析状態をを示す写真である。１０ｎｇのＡＦＢ1を、（１：１）〜（１：１０）モル等量の有効塩素を含有する電解生成酸性水に混合し、また、電解生成アルカリ水については有効塩素を含有していないため、ＡＦＢ1溶液に１〜１０倍量の電解生成アルカリ水を混合した。数字１はコントロールＡＦＢ1（１０ｎｇ）、数字２〜５は、１倍、３倍、５倍、１０倍モル等量の有効塩素を含有する電解生成酸性水で処理したＡＦＢ1を示し、数字６〜９は、１倍、３倍、５倍、１０倍量の電解生成アルカリ水で処理したＡＦＢ1を示す。なお、矢印はＡＦＢ1の斑点を示す。
【００４３】図２の（ｃ）は、ｐＨ１１．５のＮａＯＣｌ水溶液による処理後のＡＦＢ1のＨＰＴＬＣの分析状態を示す写真である。１０ｎｇのＡＦＢ1を、（１：１）〜（１：８）モル等量の有効塩素を含有するｐＨ１１．５のＮａＯＣｌ水溶液に混合した。符号ＣはコントロールＡＦＢ1を示し、数字１〜８は、１倍〜８モル等量の有効塩素を含有するＮａＯＣｌ水溶液で処理したＡＦＢ1を示す。なお、矢印はＡＦＢ1の斑点を示す。
【００４４】図２の（ｄ）は、ｐＨ３のＮａＯＣｌ水溶液による処理後のＡＦＢ1のＨＰＴＬＣの分析状態を示す写真である。１０ｎｇのＡＦＢ1を、（１：１）〜（１：８）モル等量の有効塩素を含有するｐＨ３のＮａＯＣｌ水溶液に混合した。符号ＣはコントロールＡＦＢ1を示し、数字１〜８は、１倍〜８モル等量の有効塩素を含有するＮａＯＣｌ水溶液で処理したＡＦＢ1を示す。なお、矢印はＡＦＢ1の斑点を示す。
【００４５】これらの各図を参照すれば明らかなように、ＨＰＴＬＣプレート上のＡＦＢ1の蛍光斑点とアフラトキシンＢ1，Ｂ2，Ｇ1，Ｇ2混合物の蛍光斑点は、モル濃度の７倍の有効塩素を含有する電解生成酸性水で処理することにより消滅した（図２のａを参照）。強酸性の電解生成酸性水による処理では、ＡＦＢ1の蛍光斑点を完全に消滅させることができるが、強アルカリ性の電解生成アルカリ水の処理では、ＡＦＢ1の蛍光斑点を消滅させることはできず、ＡＦＢ1に対する効果がないことが確認される（図２のｂを参照）。ＡＦＢ1をモル濃度の８倍のｐＨ１１．５のＮａＯＣｌ水溶液で処理しても、ＡＦＢ1の蛍光斑点は消滅しなかった（図２のｃを参照）。ＮａＯＣｌ水溶液をｐＨ３．０に調製したＮａＯＣｌ水溶液でＡＦＢ1を処理した場合には、ＡＦＢ1の蛍光斑点は消滅した（図２のｄを参照）。
【００４６】以上に結果から、アフラトキシンの破壊に関与している化学種は、ＣｌＯ-イオンではなく、反応性の酸素と作用するものと推測されるＨＣｌＯ、および、ＨＯＣｌから発生する化学種であるものと推定される。
(7c)アフラトキシン分解のＨＰＬＣ評価：アフラトキシンを異なったモル濃度比の電解生成酸性水で処理した後、溶液のＨＰＬＣ分析を行った。図３は、３８．４ｎｇのＡＦＢ1のクロマトグラムを示すもので、図３のチャート（ａ）はコントロール、同図のチャート（ｂ）はモル濃度比３倍の電解生成酸性水で処理した場合、同図のチャート（ｃ）はモル濃度比７倍の電解生成酸性水で処理した場合の、経時的なＡＦＢ1ピークのチャートである。図３に示すＡＦＢ1ピークのチャートを参照すると、５．１分後に溶出したＡＦＢ1ピークは電解生成酸性水のモル濃度比（有効塩素に基づく）が増加するに従って減少し、モル濃度の７倍の有効塩素を有する電解生成酸性水で処理した場合には、ＡＦＢ1ピークは完全に消滅することが確認される。なお、３．１分後と８．３分後に溶出するピークについては、未だ特定されていないが、８．３分後のピークは、電解生成酸性水で処理した後に形成されるＡＦＢ1に関連する生成物であるものと推測される。
【００４７】なお、図４は、ＡＦＢ1減少量と電解生成酸性水の量との関係を示すグラフであり、ＡＦＢ1に対する電解生成酸性水の混合量を、ＨＯＣｌモル濃度を基準にして増大させると、混合量の増大に応じてＡＦＢ1減量が減少することが確認される。
(7d)反応時間、温度、有効塩素濃度の影響：ＡＦＢ1およびその反応物に対する電解生成酸性水による処理時間の影響の実験を行って、ＨＰＬＣで評価した。ＡＦＢ1（７２．４μＭ）を、ｐＨ２．０で、Ｃｌ-濃度２０ｍＭの電解生成酸性水（有効塩素７２．４μＭ）にて、０℃で５分間および６０分間処理した。その結果（クロマトグラム）を図５に示す。この結果は、ＨＰＬＣによる分析に基づくものであるが、反応生成物を誘導体化しない条件下のもので、図３に示すクロマトグラムとは異なるものである。図５のチャートａを参照すると、ＡＦＢ1は１２．５分後に単独のピークとして溶出するが、このピークは、０℃の電解生成酸性水による５分後および６０分後の処理では、８分後の大ピークと３５分後の小ピークに置換することが認められる。
【００４８】図６に示すグラフ（ａ），（ｂ）は、ＡＦＢ1の分解、および、８分後に溶出する反応生成物の出現に対する温度と処理時間の関係を示すもので、これらのグラフのうち、グラフ（ａ）はＴR＝１２．５ｍｉｎ後に出現するピーク（ＡＦＢ1）であり、グラフ（ｂ）はＴR＝８ｍｉｎ後に出現するピーク（反応生成物）のものである。各グラフにおける縦軸は蛍光光度のピーク面積比を示し、横軸は処理時間を示す。各グラフを参照すると、ＡＦＢ1（ピークＴR＝１２．５ｍｉｎ）の量が減少すると、反応物質（ピークＴR＝８ｍｉｎ）の量が増大することが認められる。また、低温による処理では、ＡＦＢ1の消滅は多少遅れるが、０℃での５分間の処理によっても、ＡＦＢ1はそのほぼ４０％が消滅していることが確認される。８ｍｉｎ後に溶出するるピークは、ＡＦＢ1の反応生成物や電解生成酸性水が含有する次亜塩素酸であるものと推測される。この反応は、ＡＦＢ1が０℃での処理によって大幅に消滅していることから、遊離基によって惹起されていることが推測される。
【００４９】図７は、ＡＦＢ1の分解に対する有効塩素濃度の影響を示すクロマトグラムであり、下記の実験で得た結果である。すなわち、ＡＦＢ1（０．８ｎｍｏｌ）を、２〜２００倍のモル濃度比の有効塩素（１．６〜１６０ｎｍｏｌ）の電解生成酸性水に、Ｃｌ-イオン濃度を２０ｍＭに保持した状態で混合して、３０℃で１０分間処理し、その後、ＨＰＬＣ分析を行った結果である。なお、コントロール、モル濃度比２倍（×２）、モル濃度比１０倍（×１０）のクロマトグラムは、元のサイズの１／８倍で表示している。
【００５０】ＡＦＢ1を電解生成酸性水中の等モル濃度のＨＯＣｌで５分間処理すると、ＡＦＢ1は４０％減少する。電解生成酸性水中の有効塩素を増加すると、２倍量の有効塩素では、ＡＦＢ1を３０℃で１０分間処理した場合には、ＡＦＢ1は完全に消滅している。ＡＦＢ1を１０倍量の有効塩素を含有する電解生成酸性水で処理すると、４分後のピーク、８分後のピーク、３２分後のピークが減少している。一方、１３分後に溶出するピークは、有効塩素が増加するのに応じて増加している。ＡＦＢ1を２００倍量の有効塩素を含有する電解生成酸性水で処理した場合には、クロマトグラフ上の全てのピークが大幅に減少している。
(7e)ラジカル・スカベンジャーによるＡＦＢ1分解抑制の影響：ＡＦＢ1（０．１２８ｍＭ）を電解生成酸性水により処理するに当たって、電解生成酸性水にマンニトールまたはチオ尿素のいすれかを、有効塩素（０．６４０ｍＭ）に対するモル濃度比を増やしながら加えた。これらの各電解生成酸性水でＡＦＢ1（０．１２８ｍＭ）を３０℃で１０分間処理して、ラジカル・スカベンジャーによるＡＦＢ1分解抑制の影響を評価した。得られた結果を、図８および図９のグラフに示す。
【００５１】図８は、マンニトールを有効塩素の２〜１０倍のモル濃度に加えた場合の影響を示すグラフであり、図９は、チオ尿素を有効塩素の０．１〜１．０倍のモル濃度に加えた場合の影響を示すグラフであって、縦軸は３６５ｎｍで観察したコントロールＡＦＢ1の全ピーク範囲の合計に対する％として算出したＡＦＢ1のＨＰＬＣピークの強さ（残存ＡＦＢ1）を示し、横軸はラジカル・スカベンジャーの有効塩素に対するモル濃度比を示す。
【００５２】電解生成酸性水が含有する有効塩素に対するマンニトールのモル濃度比が高くなると、破壊されたＡＦＢ1の割合が低くなり、ラジカル・スカベンジャーがチオ尿素である場合も同様である。但し、ラジカル・スカベンジャーがチオ尿素である場合は、有効塩素に対するチオ尿素が１／１０の量の電解生成酸性水では、２５％のＡＦＢ1しか分解されず、チオ尿素を有効塩素と同じ割合にした場合には、ＡＦＢ1の分解は全く認められない。本実験の結果では、マンニトールおよびチオ尿素、特に、チオ尿素のラジカル・スカベンジャーとしての効果は、ＡＦＢ1の消滅が遊離基を媒介とする反応によるものであることを明確に示している。マンニトールについては、マンニトールがＡＦＢ1を電解生成酸性水から完全に保護し得なかったのは、本実験で使用したマンニトールの濃度が十分でなかったためと推測される。従って、マンニトールにＯＨ基スカベンジャーとしての効果を発揮させるためには、飽和状態に近い濃度が必要であるものと推測される。
(7f)電解生成酸性水のアフラトキシン突然変異誘発性に及ぼす影響：アフラトキシンの突然変異誘発性実験を、マロン・アメズ法（Ｍａｒｏｎ ａｎｄ Ａｍｅｓ １９８３）に則って、Ｈｉｓ−ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８および同ＴＡ−１００で行った。３ｎｍｏｌのＡＦＢ1を、４０ｐｐｍの有効塩素を含有する電解生成酸性水の異なった量で、室温下、１０分間処理した。次いで、これらの溶液にＳ−９混合液を入れて２０分間予備培養した後、ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株を入れて、３７℃で４８時間培養した。結果を表４に示す。なお、表４に示すデータは、〔（サンプルのｃｆｕ−ブランクのｃｆｕ）／（ブランクのｃｆｕ）〕×１００で算出し、相対突然誘発性パーセントで表示している。ＮＧは、マイナス成長（コントロールを下回るｃｆｕ）を意味する。また、電解生成酸性水の量は、ＨＯＣｌのｎｍｏｌ値を表示している。
【００５３】
【表４】

表４を参照すると明らかなように、３ｎｍｏｌのＡＦＢ1は、ヒスチジン要求性サルモネラ菌変異株ＴＡ−９８および同ＴＡ−１００のいずれに対しても、高い突然変異誘発性を示すが、ＡＦＢ1を電解生成酸性水で１０分間処理すると、ＡＦＢ1の突然変異誘発性は、電解生成酸性水のＨＯＣｌ濃度の増大に応じて低下することが認められる。ＡＦＢ1の突然変異誘発性は、電解生成酸性水中の有効塩素量を１７３ｎｍｏｌのＨＯＣｌに相当する５８倍にして処理すると著しく低下する。電解生成酸性水中の有効塩素量をさらに増大すれば、ＡＦＢ1の突然変異誘発性を消滅させることができる。
(7g)電解生成酸性水中の化学種のＥＳＲ分析：ラジカル種を特定するため、スピン拘束剤ＤＭＰＯ（５，５’−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキサイド）を用いて、電解生成酸性水のＥＳＲ分析を行った。先ず、ＯＨ基の形成を示す弱いスペクトルが得られ、次いで、このスペクトルを強化するため、１ｍＭのＦｅＳＯ4と１０ｍＬのＤＭＰＯを電解生成酸性水に加えた。Ｆｅ2+イオンが存在する場合、図１０に示すように、ＯＨ基に対するＤＭＯＰの典型的な反応（Ｆｅｎｔｏｎ反応）を示すＥＳＲスペクトルが得られ、電解生成酸性水には、Ｈ2Ｏ2も含まれることがわかる。以上の結果は、電解生成酸性水中には、ＯＨ基とＨ2Ｏ2が存在していることを示している。また、酸性のｐＨでは、電解生成酸性水中にＨＯＣｌが存在することも、分光光度法にて確認している。
（８）考察のまとめ：強酸性の電解生成酸性水は、アスペルギルスパラチティカスを殺菌し、アフラトキシンＡＦＢ1の突然変異誘発性を消失させることが確認された。また、アフラトキシンＡＦＢ1は、電解生成酸性水で処理することにより分解されることがＨＰＬＣ分析で確認された。但し、電解生成酸性水の処理によって、生成される反応生成物の化学式については、ＬＣ−ＭＳ法およびＮＭＲ法により特定している。
【００５４】
【実施例２】本実施例においては、食中毒を惹起する代表的なブドウ球菌が産生するブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）を不活性化するための実験を試みた。食中毒の原因となる病原菌を殺菌することは一般に行われていることであるが、病原菌を殺菌しても、病原菌が産生する生成毒素が活性を完全に失っていない場合があるため、本実験を試みた。
【００５５】本実験で不活性化処理の対象とした毒素は、腸毒素型疾患の原因となるブドウ球菌腸毒素中の最強のブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）であり、ＳＥＡは、シグマ社（Ｓｉｇｍａ社，米国ミズリー州セントルイス）より購入したものである。ＳＥＡは、わずか０．４ｎｇ／ｍＬ〜０．８ｎｇ／ｍＬの濃度でも、３時間〜５時間以内にヒトに食中毒を惹起するもので、熱的には極めて安定していて、その毒性は１００℃で３０分処理しても残存し、強酸および強アルカリに対して大きい抵抗力を有する強力な毒性を持っている。
【００５６】また、本実験で不活性化処理液として採用した電解生成水は、塩化白金を電極としイオン交換膜で区画された有隔膜電解室を有する二室大容量型電解装置（葵電気株式会社製Ｓｕｐｅｒｏｘｓｅｅｄ Ｌａｂｏ ＪＥＤ−０２０ 静岡市函南）を使用して、バッチ式の電解方法で生成されたものである。被電解水としては、脱イオン水にＮａＣｌを溶解して調製された０．１％濃度の希薄水溶液を採用し、室温（２５℃）にて、電解電圧ＤＣ９〜１１Ｖで１２分間電解して生成されたものである。当該電解によれば、電解槽の陽極側の電解室では、有効塩素濃度が約３６．３ｐｐｍ、酸化還元電位（ＯＲＰ）が＋１１８０ｍＶ、ｐＨ２．５〜２．８の強酸性の電解生成酸性水が生成され、また、電解槽の陰極側の電解室では、ＯＲＰが−８８０ｍＶ、ｐＨが１１．６〜１２．０の強アルカリ性の電解生成アルカリ水が得られる。
【００５７】本実験では、ブドウ球菌腸毒素Ａ（以下これをＳＥＡという）を一定量含む溶液に、異なった量の強酸性の電解生成酸性水（実施例）、強アルカリ性の電解生成アルカリ水（比較例）を添加して３０分間撹拌してＳＥＡの不活性化処理を行い、ＳＥＡに対する不活性化処理の効果を、ＲＰＬＡ法、免疫検定法、天然ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、アミノ酸分析法によって評価した。
【００５８】得られた結果から結論すれば、ＳＥＡを大量（１０倍量以上）の強酸性の電解生成酸性水で処理すると、ＳＥＡおよび特定の抗ＳＥＡ抗体間の免疫反応性が消失し、ＳＥＡ蛋白質が分裂し、アミノ酸、特にメチオニン(Met)、チロシン(Tyr)、イソロイシン(Ile)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)の含有量が減少することが判明した。これらの現象は、ＳＥＡが不活性化されたことを意味する。ブドウ球菌によって培養菌ブロス中に排出されるＳＥＡも、大量の強酸性の電解生成酸性水で処理することにより、不活性化できることが判明した。以下には、本実験の詳細な条件と結果を示す。
（１）ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）の不活性化実験：有機物無しの媒体でのモデル実験では、２．８μｇ／ｍＬのリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ：ｐＨ７．４）を基礎溶液として、これに、シグマ社（Ｓｉｇｍａ社，米国ミズリー州セントルイス）から購入したＳＥＡを懸濁させた。ＰＢＳ２５μＬ中にＳＥＡを７０ｎｇ含有するサンプル溶液を、０μＬ、７５μＬ、１２５ｍＬ、２５０ｍＬの電解生成酸性水または電解生成アルカリ水に混合し、室温で３０分間培養した。次いで、１％のマンニトールをそれぞれ４００μＬ、３２５μＬ、２７５μＬ、１５０μＬ加えて反応を停止して、２５μＬの部分標本を、メーカーの取扱説明書に従ってＲＰＬＡ法に基づいて分析した。ＳＥＡ含有量の半定量分析を、標準のＳＥＡ溶液を３７℃で２４時間培養した場合の結果と比較して行った。
【００５９】７０ｎｇのＳＥＡを含有する懸濁液のサンプル溶液を、ＨＯＣｌのＳＥＡに対するモル濃度比の約２３０、３８０、７６０にそれぞれ相当する３倍、５倍、１０倍の量の電解生成酸性水に混合して、室温で３０分間放置した。同様に、１００ｎｇのＳＥＡを含有する懸濁液のサンプル溶液を、同じ体積比の電解生成アルカリ水に混合して、室温で３０分間放置した。サンプル溶液の分析では、ＳＥＡについてはＲＰＬＡ法およびＥＬＩＳＡ法で、タンパク質については天然ＰＡＧＥ法で、アミノ酸混合物についてはＨＰＬＣ法で行った。
（２）ＳＥＡを含有する液体培養ブロスの不活性化実験：黄色ブドウ球菌によって産生されるＳＥＡを含有するブロスを使用して、有機媒体に細胞外放出されたＳＥＡの、電解生成酸性水による不活性化実験を行った。脳−心臓注入液体媒体に懸濁させたＳＥＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を、培養ブロス（２５μＬ）に細胞外放出されたＳＥＡと看なして、これを、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍の量の電解生成酸性水（有効塩素３６．３ｐｐｍ、ｐＨ２．３１、ＯＲＰ１１５８ｍＶ）に混合して５分間放置し、その後にＲＰＬＡ法で分析した。コントロールとして、７０ｎｇのＳＥＡを含有する上澄み液（２５μＬ）を、電解生成酸性水ではなくて、１０倍量のＰＢＳに混合した。細胞上澄み液から出たＳＥＡと、ラテックスのビード（珠）に結合した抗ＳＥＡとの反応後の凝結を、３７℃で２４時間培養した後で評価し、これをコントロールの場合と比較した。
（３）ＳＥＡ凝縮の酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）：ＲＰＬＡ法は半定量測定法にすぎないため、ＳＥＡの変性を、ＥＬＩＳＡ法によっても確認した。電解生成酸性水１５０μＬとＳＥＡ１５０μＬを、複数容器微量滴定プレート（ファルコン マイクロテストIII フレキシブル検定プレート、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ製、米国ニュージャージー州）に加えて３７℃で２時間培養し、ＳＥＡを凝固させた。次いで、電解生成酸性水と未凝固のＳＥＡを捨てて、凝固したＳＥＡを２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳで室温下、３０分間ブロッキング（粘着）させた。ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液は捨て、容器中のＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を１５０μＬ入れて３回洗浄した。
【００６０】次いで、抗ＳＥＡ抗体１５０μＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、米国ミズーリ州セントルイス）を、一次抗体の２０，０００倍に希釈して加え、プレートを３７℃で１時間培養した。その後、この溶液を捨てて、ＰＢＳにＴｗｅｅｎ−２０を入れて容器を洗浄した。続いて、各容器に、１，０００倍に希釈したラビットＩｇＧに対する過酸化酵素親和標識純化抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、米国メリーランド州ゲテルズバーグ）１５０μＬを加え、３７℃で１時間培養した。さらに、この溶液を捨てて、ＰＢＳにＴｗｅｅｎ−２０を入れて容器を洗浄した。続いて、各容器に０．０３％の２，２’−アジノジ−３−スルホン酸エチルベンズチアゾリンと０．１％の過酸化水素の混合物１５０μＬを加え、３７℃で１時間培養した。各容器の吸収は、マイクロプレート・リーダー（Ｃｏｒｏｎａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ製ＭＴＰ−１２０、東京）により４１５ｎｍにて確認した。
（４）不活性化後のＳＥＡとその反応生成物の天然ＰＡＧＥ分析：電解生成酸性水により処理したＳＥＡの変性を確認した。電解生成酸性水による処理の前後のＳＥＡ溶液を、７．５％のポリアクリルアミド・ゲルと２５ｍＭトリス−１９０ｍＭグリシン電気泳動緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で確認した。タンパク質の帯は、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色で視覚化した。
（５）電解生成酸性水の処理の有無のＳＥＡアミノ酸構成分析：電解生成酸性水の処理後のＳＥＡのアミノ酸の構成を、処理なしのＳＥＡの場合と比較した。ＳＥＡを、１％のフェノールを含有する６ＮのＨＣｌを用いて、１１０℃で２４時間加水分解した。加水分解によってＳＥＡから放出された遊離アミノ酸を、イソチオシアン酸フェニル（ＰＴＣ）で誘導体化した後、逆相ＰＩＣＯ−ＴＡＧコラム（３．９×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）を用いて、２５４ｎｍで紫外線吸収を観察して、ＨＰＬＣ法で分析した。ＰＴＣアミノ酸誘導体は、プログラミングされた勾配で、溶液Ａと溶液Ｂから溶出させた。溶液Ａは、０．２％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンを５０：３の割合（ｖ／ｖ）で含むアセトニトリルで、０．１４Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ６．８に調製したもの、溶液Ｂは６０％のアセトニトリルである。
（６）結果および考察：(6a)電解生成水によるブドウ球菌毒素Ａ（ＳＥＡ）の不活性化効果（ＲＰＬＡ法による）：７０ｎｇのＳＥＡを、異なった量の電解生成酸性水と電解生成アルカリ水で３０分間処理した場合（有機物なしのモデル試験）のＲＰＬＡ法による分析結果を図１１のグラフに示す。同グラフにおいては、縦軸が残存するＳＥＡの量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は電解生成水のＳＥＡに対する混合比を示している。
【００６１】ＳＥＡの不活性化に使用する電解生成酸性水の量は、実験結果に大きな影響を及ぼすことが確認された。有機物なしのモデル試験では、ＳＥＡを等量の電解生成酸性水で処理した場合には、ＳＥＡの不活性化の効果はほとんど認められないが、３倍量の電解生成酸性水で処理した場合には、ＳＥＡの量は約２５％減少した。ＳＥＡの不活性化の効果は、電解生成酸性水を増加するに伴い増大するが、ＳＥＡを１０倍量の電解生成酸性水で処理した場合には、ＳＥＡの抗ＳＥＡ抗体ラテックスとの凝結は認められなかった。一方、ＳＥＡの電解生成アルカリ水による処理では、ＳＥＡに対する不活性化の効果は認められない。
【００６２】図１２のグラフは、ＳＥＡを栄養ブロスの条件で異なった量の電解生成酸性水で処理した場合のＲＰＬＡ法による分析結果を示す。同グラフにおいては、縦軸が残存するＳＥＡの量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は電解生成酸性水のＳＥＡに対する混合比を示している。
【００６３】培養液に懸濁させたＳＥＡの処理については、１６０ｎｇ／ｍＬのＳＥＡを、脳−心臓注入液体媒体によって増殖させた細胞の上澄み液に加えると凝縮が明に認められたが、ＳＥＡを１００倍量の電解生成酸性水で処理すると、凝縮は認められなかった。この結果は、電解生成酸性水を大量に使用すれば、有機物が存在する場合でも、ＳＥＡタンパク質の免疫反応部位の変性が可能であるを示唆しているものである。
(6b)電解生成水によるブドウ球菌毒素Ａ（ＳＥＡ）の不活性化効果（ＥＬＩＳＡ法による）：ＲＰＬＡ法は、半定量測定法であって、感度が必ずしも十分であるとはいえないことから、ＳＥＡの電解生成水による処理の結果をＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着剤検定法）で確認した。図１３のグラフは、ＳＥＡを電解生成酸性水で処理した結果を示している。同グラフにおいては、縦軸は４１５ｎｍでの吸光度を示し、横軸はＳＥＡの量（ｎｇ）を示している。また、各グラフ中、プロット□印のグラフ１はコントロール、プロット◇印のグラフ２は（１：５ｖ／ｖ）比の電解生成酸性水で処理した場合、プロット○印のグラフ３は（１：１０ｖ／ｖ）比の電解生成酸性水で処理した場合である。
【００６４】ＳＥＡを電解生成酸性水で処理しないコントロール実験（グラフ１）では、４１５ｎｍでの吸収により測定したＳＥＡの検出限度は、３ｎｇであることがわかった。しかし、ＳＥＡを５倍量の電解生成酸性水で処理した場合（グラフ２）、および、ＳＥＡを１０倍量の電解生成酸性水で処理した場合（グラフ３）には、ＳＥＡの元の量を１００ｎｍに増やしても、ＥＬＩＳＡ法によってＳＥＡは検出できなかった。
【００６５】以上の結果は、ＳＥＡを電解生成酸性水で処理することにより、ＳＥＡの抗原性を決定する部位が変性されるか、または、ＳＥＡの三次元タンパク質構造が改造されて、ＳＥＡの抗ＳＥＡ抗体に対する免疫反応性が失われていることを示唆している。
(6c)天然ＰＡＧＥ法による分析：ＳＥＡを電解生成水で処理した場合と処理しない場合の天然ポリアクリルアミド・ゲル電気永動のパターンを図１４に示す。図１４は、天然ＰＡＧＥのパターンを示す写真であって、当該天然ＰＡＧＥのパターンにおいては、矢印１はＳＥＡの位置を示し、矢印２はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を示しており、レーン１は標準ＳＥＡ、レーン２〜４は３倍、５倍、１０倍の量の電解生成酸性水で処理したもの、レーン５〜７は３倍、５倍、１０倍の量の電解生成アルカリ水で処理したものである。
【００６６】天然のＳＥＡタンパク質は、約３０ｋＤａで観察できたが、電解生成酸性水で処理したＳＥＡは、３０ｋＤａ領域の下とその周辺にかすんだ帯が見えるだけで、電解生成酸性水がタンパク質分子の分解と分裂を惹起したことを示している（レーン２〜４）。電解生成アルカリ水で処理したＳＥＡの電気永動パターンには、変化は見られなかった（レーン５〜７）。以上に結果は、電解生成酸性水がＳＥＡタンパク質を細かく分解することを示している。
(6d)アミノ酸分析法による分析：ＳＥＡを電解生成酸性水で処理した場合と処理しなかった場合の、アミノ酸の構成の比較を表５に示す。表中、(Asx)はアスパラギン酸＋アスパラギンを、(Glx)はグルタミン酸＋グルタミンを示す。また、表中の参考値の欄の数値は、未処理の完全なＳＥＡ中の残留アミノ酸を、ＳＥＡ１Ｍｏｌに対するｍｏｌ値で示している数値（Ｈｕａｎｇ 他 １９８７）であり、また、処理無しの欄の数値は、ＨＰＬＣによるアミノ酸分析から得た数値である。
【００６７】
【表５】

ＳＥＡを１０倍量の電解生成酸性水で処理すると、ＳＥＡが含有するアミノ酸は明らかに減少しているのが認められる。但し、本実験でのアミノ酸分析では、加水分解のために、トリプトファンとシステインについてのデータが正確ではない点に注意する必要がある。処理なしの場合のＳＥＡのアミノ酸の構成は、参考値とよく一致しているが、電解生成酸性水で処理した場合のＳＥＡでは、ほとんどのアミノ酸の含有量は減少している。特に、メチオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸の含有量の減少が顕著である。メチオニンとイソロイシンは極めて酸化し易く、特に、メチオニンはＨＯＣｌに敏感である。しかし、酸化し易いことで知られているヒスチジンの含有量は、メチオニンほどの減少は認められない。
（７）考察のまとめ：ＳＥＡは、電解生成酸性水で処理することにより、不活性化することができる。特に、脳−心臓注入液体媒体によって増殖させた黄色ブドウ球菌の細胞から細胞外媒体に分泌されたＳＥＡは、電解生成酸性水にて処置することによって不活性化することができる。電解生成酸性水は、ＳＥＡを、ＯＨ基と反応性塩素による酸化化学反応によって変性させる。酸化化学反応は、一般に、硫黄を含むアミノ酸等の有機物が存在すると効果が抑制されるもので、電解生成酸性水のこの作用は注目に値するものである。
【００６８】病原菌の毒性を消失させまたは弱体化させる電解生成酸性水による処理は、食品や飼料の衛生管理に応用することができる。病原菌の完全な殺菌が困難な場合でも、病原菌が産生する生成毒素を減少させることで病原性を低下させて、食中毒の発生を防止することができる。
【００６９】なお、次亜塩素酸イオン（有効塩素５００ｐｐｍ）による殺菌処理では、クロイツフェルド−ヤコブ症候群の原因であるプリオンの不活性化に有効であるとの報告があり、電解生成酸性水は、ウシ海綿状脳炎の予防に有効であるものと推測される。また、次亜塩素酸ナトリウムがＡ型肝炎ウイルスを９９．９％減少させるとの報告があり、電解生成酸性水は、Ａ型肝炎ウイルスに対する殺菌に有効であるものと推測される。
【出願人】 【識別番号】５００５４３６２７
【氏名又は名称】鈴木 鐵也
【出願日】 平成１４年１月４日（２００２．１．４）
【代理人】 【識別番号】１０００６４７２４
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷 照一 （外１名）
【公開番号】 特開２００３−２０６２０９（Ｐ２００３−２０６２０９Ａ）
【公開日】 平成１５年７月２２日（２００３．７．２２）
【出願番号】 特願２００２−６４（Ｐ２００２−６４）