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【発明の名称】 防カビ剤の評価方法
【発明者】 【氏名】森数 啓次
【住所又は居所】東京都新宿区下落合１丁目４番１０号 エステー化学株式会社内

【氏名】柴谷 治雄
【住所又は居所】東京都新宿区下落合１丁目４番１０号 エステー化学株式会社内
【要約】 【課題】揮散性が小さく、効力を発揮するまでに、ある程度の期間が必要となる防カビ剤の本来の効力を的確に評価することができる防カビ剤の評価方法を提供すること。

【解決手段】一定容積の閉鎖空間内に防カビ剤と試験培地を入れ、該空間内に防カビ剤を揮散させて所定期間経過した後、試験培地にカビ菌を接種し、さらに一定期間を経過させた後、試験培地表面のカビ菌の生育状態を確認することを特徴とする防カビ剤の評価方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 一定容積の閉鎖空間内に防カビ剤と試験培地を入れ、該空間内に防カビ剤を揮散させて所定期間経過した後、試験培地にカビ菌を接種し、さらに一定期間を経過させた後、試験培地表面のカビ菌の生育状態を確認することを特徴とする防カビ剤の評価方法。
【請求項２】 試験培地の培地面を下向きにして設置することを特徴とする請求項第１項記載の防カビ剤評価方法。
【請求項３】 一定容積の閉鎖空間内に防カビ剤を入れ、閉鎖空間内に防カビ剤を揮散させて所定期間経過した後、該空間内に試験培地を入れ、必要により一定期間経過させた後、試験培地にカビ菌を接種し、さらに一定期間を経過させた後、試験培地表面のカビ菌の生育状態を確認することを特徴とする防カビ剤評価方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は防カビ剤の評価方法に関する。さらに詳細には、長期間効力を保つことができる揮散性防カビ剤の効力を正しく評価できる防カビ剤の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、揮散性の防カビ剤の効力の程度を試験する方法は数多く知られている。例えば、揮散性防カビ剤の試験法のうちよく知られているものとしては、Maruzzellaの方法（American Perfumers & Aromatics.74,August,21-22(1959)）がある。この方法は、まず、内容積１００ｍｌ程度のペトリ皿の底に培地を固めて菌を接種し、一方のペトリ皿の蓋の裏側に防カビ剤を含浸した試料を固定する。次いで、蓋をかぶせた後、蓋を下にして置き、室温で３日間培養し、カビの発生の程度を観察するものである。この方法は、有効成分である防カビ剤の基本的な効力を調べるために用いられている。
【０００３】また、実際に使用される状態に近い条件で、揮散性の防カビ剤を含有する防カビ製剤の効力を試験できる方法としては、内容積約５００ｌのガラスケースの天井から防カビ製剤の試料を吊り下げておき、同じガラス容器の天井部、底部および側壁部に、カビ懸濁液を接種したシャーレを取り付け、２５℃で１２０時間保持した後のカビの発育状況を肉眼で観察する方法が開示されている（特開昭６１−６０６０２号公報）。
【０００４】上に述べた方法は、試験容器の容積の違いはあるが、いずれも試験開始から３日あるいは５日後という比較的短い期間での防カビ剤の効力を評価している。その他の一般的な方法も、試験開始数日後という比較短期間での防カビ効力を調べるものである。
【０００５】一方、揮散性防カビ剤は、繊維製品の保存中のカビの発生を防ぐために使われており、揮散性防虫剤に配合して用いられることも多い。この場合、揮散性防カビ剤は配合される揮散性防虫剤の有効期間中防カビ効力を保つように設計され、その有効期限は数ケ月から半年、場合によっては１年間という長期間に及ぶ。このように長期間効力を持続することができる防カビ剤には、徐々に揮散して長く効力を保つために、揮散性の小さい防カビ剤が用いられていた。
【０００６】揮散性の小さい防カビ剤は、使用される環境下で徐々に揮散して、容器内の有効成分の濃度が徐々に高まるので、容器内の防カビ剤が十分に効力を発揮できる濃度に達するまでに１〜２週間を要することもある。これらの防カビ剤は、効力を発揮するまでにある程度の日数が必要であっても、その後は、数ヶ月から１年という長期間にわたりその効力を持続できるので、その効力発生までの時間が問題とされることは少なかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このような揮散性は小さいが長期間にわたりその効力を持続できる防カビ剤は、上に述べた従来の防カビ剤の試験方法では、試験日数が短いため、該防カビ剤が本来の効力を十分発揮するまでに試験が終了してしまい、適切な試験方法とは言い難かった。
【０００８】すなわち、従来法での試験結果によれば、揮散性の低い防カビ剤は、「試験期間中は試験容器内で防カビ剤が未だ十分な濃度に達していないので、防カビ効力はない」という結果になったり、本来の効力より小さい効力を示すことになったりしてしまっていた。すなわち、従来の試験方法では、揮散性は小さいが長期間有効な防カビ剤の、本来の防カビ効力を正しく評価することができなかったという問題が生じていたのである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このような問題を解決し、揮散性は小さいが長期間有効な防カビ剤を評価することのできる方法について鋭意検討を行った。そしてその結果、一定の容積の閉鎖空間を設けて、その中に防カビ剤及び試験培地を入れ、該空間内に防カビ剤を揮散させた後に、試験培地にカビ菌を接種、培養すれば、揮散性の小さい防カビ剤の本来の効力を評価できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】すなわち本発明は、一定容積の閉鎖空間内に防カビ剤と試験培地を入れ、該空間内に防カビ剤を揮散させて所定期間経過した後、試験培地にカビ菌を接種し、さらに一定期間を経過させた後、試験培地表面のカビ菌の生育状態を確認することを特徴とする防カビ剤の評価方法を提供するものである。
【００１１】さらに、本発明は、一定容積の閉鎖空間内に防カビ剤を入れ、該閉鎖空間内に防カビ剤を揮散させて所定期間経過した後、該空間内に試験培地を入れ、必要により一定期間経過させた後、試験培地にカビ菌を接種し、さらに一定期間を経過させた後、試験培地表面のカビ菌の生育状態を確認することを特徴とする防カビ剤評価方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明の防カビ剤の評価方法を実施するには、まず、一定容積の閉鎖空間内に防カビ剤と試験培地を入れることが必要があるが、この閉鎖空間は、密閉容器も用いて設けることができるが、完全に密閉されている必要はない。該容器の形状は、一定の容積を有して閉鎖状態を維持できるのであれば、箱型、円柱形等の各種形状のものを使用することができる。また、後に述べるように、防カビ剤や試験培地を設置したり、出し入れしたりするため、蓋付のものを用いるのが好ましい。
【００１３】該容器の材質は、ステンレスや防食処理が施された各種金属材料、ガラスやプラスチックなどを使用することができる。また、その容積は、防カビ剤の種類やその揮散性、実使用上の条件等を考慮して適宜に決定できるが、一般に、１〜５００ｌ程度が好ましい。
【００１４】また効力の評価対象となる防カビ剤は、製剤化された製品、つまり防カビ製剤をそのまま用いてもよく、更に実用条件での保存容器と試験容器の容積の違いを考慮して、製品の一部を用いてもよい。更にまた、実使用上の条件で評価を行う場合は、適当な揮散性防虫剤等に配合して用いてもよい。
【００１５】使用される防カビ製剤の剤型も特に制限はなく、固体状、液状、ゲル状等各種の剤型のものを使用することができる。なお、防カビ剤が液状等一定の形態を維持できない場合は、防カビ剤を、適当な含浸体に含浸させた製剤を用いてもよい。これらの防カビ剤は、実使用条件を考慮して閉鎖空間内の適当な場所に設置することができ、例えば容器等の蓋の裏などに設置することができる。
【００１６】一方、カビ菌を接種する培地は、通常カビ菌の培地として使用されているものであれば特に制限はないが、例えば、ポテトデキストロース寒天培地やグルコースペプトン寒天培地などの培地を用いることができる。また、実用条件に近づけるためには、栄養源の濃度を、標準状態の１０％程度に希釈するのが適当である。培地は、シャーレなどの開口面積の大きい皿形の小容器に入れて、試験培地として閉鎖空間内に入れることが好ましい。なお、後記するように培地を該容器に充填して試験培地とした後、その培地面を下向きに設置する場合には、培地が容器から脱落しないよう、ある程度の固さと接着性がある培地を選択する必要がある。
【００１７】培地が入った該皿形小容器は、実使用条件を考慮して閉鎖空間の適当な場所に設置することができ、閉鎖空間内の底面部に設置するするのが通常であるが、容器底部と空隙をおいて培地面を下向きにして設置することが好ましい。培地面を下向きにすることにより、防カビ剤が本来の効力を発揮する前に、空中落下菌によって培地が汚染されることを防ぎ、防カビ剤の効力をより正しく試験することが可能となる。この場合、容器等の閉鎖空間内の底部に、空隙部を多く持つ架台を別途設置して、その上に、培地を入れた皿形小容器を、培地面を下向きにおいて固定するなどの方法を行えば、培地面が下向きの状態を維持することが容易となる。
【００１８】このような操作を行い、防カビ剤と試験培地を閉鎖空間に入れる必要があるが、試験培地にカビ菌を接種する前に、所定期間その状態で放置する必要がある。これは、空間内に防カビ剤を揮散させて、防カビ剤が十分にその効力を発揮できる状態にするためである。この所定期間は、防カビ剤の種類、使用する容器の大きさ等の条件により適宜設定することができるが、通常は３日〜２０日、好ましくは５日〜１０である。
【００１９】上記の所定期間が経過した後、閉鎖空間内の試験培地にカビ菌を接種する。接種するカビ菌の種類は、特に制限はなく、種々のカビ菌を使用でき、一般的なものとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger、ＩＦＯ６３４１）およびペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum、ＩＦＯ６３５２）などが挙げられる。これらのカビ菌の接種の方法としては、定量白金耳法によるワンポイント接種などが簡便で好ましい。
【００２０】本発明の評価方法は、カビを試験培地に接種した後に、さらに一定期間、閉鎖空間をそのままの状態で放置する必要がある。この一定期間を一つの基準として、カビの生育状態を比較することになる。この一定期間は、接種するカビの種類によって適宜定められるが、カビが増殖するかどうかを判断する目安という点から、３日〜７日が好ましい。
【００２１】この一定期間が経過した後、試験培地表面のカビ菌の増殖状態を測定して、防カビ剤の効力の程度を評価する。カビの増殖状態を判定する方法は、目視等一般的な測定方法を用いることができるが、例えば、カビ菌の発育直径を測定する方法や、発育の程度を、「＋：カビの発育が認められる」、「±：ごくわずかにカビの発育が認められる」および「−：カビの発育が認められない」、などという評価基準を設けることより、半定量的に表す方法などが用いられる。
【００２２】また、本発明の評価方法では、閉鎖空間内にまず防カビ剤のみを入れて、所定期間保存して防カビ剤を揮散させ、その後に試験培地を設置することによっても、実施は可能である。具体的には、閉鎖空間内にまず防カビ剤のみを入れて、閉鎖空間内で所定期間防カビ剤を揮散させた後、この空間内に試験培地を入れる。カビ菌の接種はこのときに行ってもいいが、必要で有ればさらに一定期間経過させた後に培地にカビ菌を接種してもよい。カビ菌の接種後、一定期間を経過させた後、試験培地表面のカビ菌の培養状態を確認して、防カビ剤の効力を評価する。
【００２３】この方法では、培地を入れた小容器を設置する前に、防カビ剤のみを入れて保持する期間は、防カビ剤の種類、使用する容器の大きさに応じて適宜定められるが、通常は１日から３日程度が好ましい。また、培地の培地面の向きについては、上向きや下向きのどちらでもよい。
【００２４】以上説明した本発明の評価方法では、閉鎖空間内は、試験培地が乾燥しないように、常時適当な湿気のある状態にしておくことが好ましい。簡便な方法としては、閉鎖空間内に水の入った開口容器を設置しておく方法などが挙げられる。また、閉鎖空間内が一定湿度に保つことができるような装置を別途設置してもよい。
【００２５】本発明の評価方法により、揮散性が小さく、効力を発揮するまでに、ある程度の期間が必要となる防カビ剤の本来の効力を的確に評価することができる。揮散性の小さい防カビ剤の例としては、Ｎ−（フルオロジクロロメチルチオ）−フタルイミド（一般名：フルオロフォルペット、商品名：プリベントールＡ３；バイエル社製）、Ｎ−ジクロロフルオロメチルチオ−Ｎ '，Ｎ '−ジメチル−Ｎ−フェニルスルファミド（一般名：ジクロフルアニド、商品名：プリベントールＡ４；バイエル社製）、３−ヨード−２−プロピニルブチルカーバメート（ＩＰＢＣ）、パラクロロメタキシレノール（ＰＣＭＸ）、２−イソプロピル−５−メチルフェノール（チモール）、３−メチル−４−イソプロピルフェノール（ビオゾール）、オルトフェニルフェノール（ＯＰＰ）などを挙げることができ、本発明は、これらの防カビ剤の効力の評価方法として有効に作用するものである。また、それのみでなく、未だ防カビ活性が知られていない化合物について、これが長期間揮散するタイプの防カビ剤として使用できるかどうかについてスクリーニングする場合にも使用可能である。
【００２６】
【実施例】次に実施例、比較例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
【００２７】実 施 例 １蓋の開閉をすることができる容積約４５ｌの円筒状ステンレス製容器（サイズ：直径３９０ｍｍ、高さ３９０ｍｍ）を用意し、容器内の底面の中央に、ステンレス線材で組立てたサイズ１００ｍｍ×２００ｍｍ×８０ｍｍの架台を設置し、試験容器とした。
【００２８】表１に示す各防カビ剤２ｍｇを、揮散性防虫剤エムペントリン１００ｍｇに溶解し、サイズ３０ｍｍ×４０ｍｍ×０．５ｍｍのセルロース製多孔質担体に含浸して防カビ製剤を調製した。この防カビ製剤を試験容器の蓋の中央に固定した。一方、直径５０ｍｍ、高さ１０ｍｍのシャーレに、１／１０希釈ポテトデキストロース寒天培地５ｍｌを入れて固め、試験培地とした。これを、上記の架台の上に、培地面を下向きにして置いた。また、容器の底部には、水の入ったビーカーを併せて設置した。
【００２９】試験培地を設置した後、試験容器に蓋をかぶせて、２５℃の恒温室で７日間保存して容器内に防カビ製剤を揮散させた。その後、蓋を開け、試験培地の中心にカビ胞子懸濁液（アスペルギルス・ニガー ＩＦＯ ６３４１およびペニシリウム・シトリナム ＩＦＯ ６３５２）１０μｌを接種した。シャーレをもとの状態に戻し、再び蓋をかぶせて、さらに同じ条件で５日間保存してカビ菌を培養した。培養後、試験培地表面のカビの発育直径を測定して、防カビ効力を試験した。この結果を後記表２に示す。
【００３０】比 較 例 １実施例１において、試験培地に菌を接種する前に７日間保存することを行わず、試験培地を試験容器内に設置する際に、試験培地の中心にカビ胞子懸濁液１０μｌを接種した。接種後試験容器に蓋をかぶせ、２５℃の恒温室で５日間保持して培養した。培養後、試験培地表面上のカビの発育直径を測定し、防カビ効力を試験した。この結果も表２に示す。
【００３１】（使用した防カビ剤）
【表１】

【００３２】（ 結 果 ）
【表２】

【００３３】表２の結果より、どの防カビ剤を用いた場合においても、実施例１の評価方法を用いた場合の試験培地上のカビ菌の発育直径は、比較例１のそれよりも小さいものであり、防カビ剤が的確に効力を発揮していることが確認できた。
【００３４】実 施 例 ２内容積４５ｌのステンレス製容器に替えて、内容積約１０ｌの円筒状ステンレス容器（サイズ：直径２４０ｍｍ、高さ２４０ｍｍ）を用いた。防カビ剤は、表１に示した防カビ剤のうち「１」〜「４」をそれぞれ０．４ｍｇをエムペントリン２０ｍｇに溶解し、サイズ１０ｍｍ×２４ｍｍ×０．５ｍｍのセルロース製多孔質担体に含浸して調製した。その他は、実施例１と同様にして、防カビ効力を試験した。この結果を後記表３に示す。
【００３５】比 較 例 ２実施例２と同様の試験において、培地に菌を接種する前に７日間保持することを行わず、試験培地を試験容器内に設置する際に、試験培地の中心にカビ胞子懸濁液１０μｌを接種した。接種後試験容器に蓋をかぶせて、２５℃の恒温室で５日間保持して培養した。培養後、試験培地表面上のカビの発育直径を測定し、防カビ効力を試験した。この結果を表３に示す。
【００３６】（ 結 果 ）
【表３】

【００３７】表３の結果より、どの防カビ剤を用いた場合においても、実施例２の評価方法を用いた場合の試験培地上のカビ菌の発育直径は、比較例２のそれよりも小さいものであり、防カビ剤が的確に効力を発揮していることが確認できた。
【００３８】実 施 例 ３実施例１で用いたものと同サイズの４５ｌの円筒状ステンレス製容器の蓋の中央に、表１に示される防カビ成分のうち「１」「２」を、実施例１と同様に調製した防カビ剤を固定し、蓋をかぶせ、２５℃の恒温室で２日間保持して容器内に防カビ剤を揮散させた。その後、蓋を開け、容器の底の中央に、実施例１と同サイズのシャーレを培地面を上向きにして置いた。
【００３９】蓋をかぶせた後、２５℃の恒温室で７日間保存し、再び蓋を開け、試験培地の中心にカビ胞子懸濁液１０μｌを接種した。シャーレをもとの状態に戻し、蓋をかぶせて、さらに同じ条件で５日間保存して培養した。培養後、試験培地上のカビの発育直径を測定して、防カビ効力を試験した。この結果を後記表４に示す。
【００４０】（ 結 果 ）
【表４】

【００４１】表３の結果より、どの防カビ剤を用いた場合においても、実施例３の評価方法を用いた場合の試験培地上のカビ菌の発育直径は、比較例１のそれよりも小さいものであり、防カビ剤が的確に効力を発揮していることが確認できた。
【００４２】
【発明の効果】本発明の防カビ剤の評価方法は、揮散性が小さく、効力を発揮するまでに、ある程度の期間が必要となる防カビ剤の本来の効力を的確に評価することができる。
【００４３】よって、本発明の評価方法を用いることで、フルオロフォルペット、ジクロフルアニド、ＩＰＢＣ、ＰＣＭＸ、チモール、ビオゾール、ＯＰＰなどの揮散性の小さい防カビ剤の本来の効力の評価を正確に行うことが可能となる。また、未だ知られていない揮散性が低く、長期間効果が維持できる防カビ剤のスクリーニングにも有利に使用することができるものである。
以 上
【出願人】 【識別番号】０００１０２５４４
【氏名又は名称】エステー化学株式会社
【住所又は居所】東京都新宿区下落合１丁目４番１０号
【出願日】 平成１３年７月１２日（２００１．７．１２）
【代理人】 【識別番号】１０００８６３２４
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 信夫 （外１名）
【公開番号】 特開２００３−２６５０３（Ｐ２００３−２６５０３Ａ）
【公開日】 平成１５年１月２９日（２００３．１．２９）
【出願番号】 特願２００１−２１２７２０（Ｐ２００１−２１２７２０）