トップ :: A 生活必需品 :: A01 農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業




【発明の名称】 ヨウ化アルキルを含む生物標本用燻蒸剤、およびヨウ化アルキルを用いた生物標本の保存方法
【発明者】 【氏名】赤川 茂樹

【氏名】田口 信洋

【氏名】宮沢 孝明
【要約】 【課題】遺伝子に影響を与えない生物標本の燻蒸剤およびそれを用いた生物標本の保存方法を提供する。

【解決手段】ヨウ化アルキルを含む生物標本用燻蒸剤、および、ヨウ化メチルを含む燻蒸剤で燻蒸することを特徴とする生物標本の保存方法である。本発明の燻蒸剤および保存方法は、高い殺生物特性を持つとともに遺伝子損傷率が極めて低いことから、動植物を標本として保存した後の遺伝子解析を可能とするものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ヨウ化アルキルを含む生物標本用燻蒸剤。
【請求項２】 前記ヨウ化アルキルはヨウ化メチルである、請求項１に記載の燻蒸剤。
【請求項３】 ヨウ化アルキルを含む燻蒸剤で燻蒸することを特徴とする、生物標本の保存方法。
【請求項４】 前記ヨウ化アルキルの含有量が、燻蒸剤質量に対して５質量％以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】 前記燻蒸剤を気化装置によって気化させて燻蒸する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】 燻蒸条件が、温度０〜４０℃、湿度５〜１００％である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】 前記燻蒸剤は、さらに殺虫剤または殺菌剤を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】 前記燻蒸剤と、前記殺虫剤または殺菌剤とをそれぞれ単独に、順次気化して燻蒸する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】 前記殺虫剤は、クロルピクリン、二硫化炭素、フッ化スルフリル、臭化メチルおよび青酸からなる群より選択される１以上の物質である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】 前記殺菌剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレイン、メタアクロレイン、ブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、アリルアルコール、ブチルアルコールおよび過酸化水素からなる群から選択される１以上の物質である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】 前記ヨウ化アルキルは、ヨウ化メチルである、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物および動物標本の保存方法に関し、特に燻蒸技術を用いた保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】昨今、遺跡から発掘された植物、動植物の化石、動植物標本からＤＮＡを抽出し、遺伝子解析をする技術が注目を集めている。それに呼応して、生物標本を扱う博物館、資料館、各種研究所において、サンプルの保存方法が問題になっている。
【０００３】従来、このような施設での生物標本は、害虫や微生物による食害、変質および腐敗を防ぐために、殺生物性ガスによる燻蒸処理が施されてきた。燻蒸には、臭化メチルと酸化エチレンとからなる燻蒸剤（商品名「エキボン」）が用いられてきた。しかしながらこれらの成分は、殺生物能力は高いが、ＤＮＡを著しく損傷するため、遺伝情報源としてのサンプルの価値をなくしてしまう。
【０００４】そのため、遺伝情報を保存したいサンプルには上記燻蒸処理を行わない、という方策が採られた。しかしながら、殺生物効果が低いために、害虫や微生物が繁殖しやすいという問題がある。このようなサンプルからＤＮＡを抽出すると、害虫や微生物のＤＮＡが混入し、目的ＤＮＡの収率が低下してしまう。これは、その後の遺伝解析の正確性に影響を及ぼす。加えて、臭化メチルはオゾン層を破壊する性質により今後使用が禁止される物質であり、さらに酸化エチレンは発ガン性および発火性が高いという問題がある。
【０００５】これまでに、文化財を害虫や微生物から保護するためのヨウ化アルキルを含有する燻蒸剤が開示されている（特開２０００−２１２００６号公報を参照）。これは、アルキルハロゲン化物が有機体に含まれるアミノ酸やペプチド中のＮＨ2基やＳＨ基に対して２分子求核置換反応を起こすことによる殺生物作用を利用したものであり、文化財に対して変色や変質などを及ぼさず、しかも従来品である臭化メチルよりも広域かつ少量で強度の抗菌作用を奏する燻蒸方法に関するものである。さらに従来の燻蒸剤に一般的に含まれる酸化エチレンを配合する必要がなく、環境性および安全性に優れるという利点がある。しかしながら、ヨウ化アルキルを含む燻蒸剤を、植物や動物組織などの生物標本の保存に用いることは未だ知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的は、殺生物効果および遺伝情報の保存性の両立が可能な、生物標本の保存方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来高い殺生物性を有することが知られているヨウ化アルキル化合物が、遺伝物質であるＤＮＡに対して分解性が低いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、ヨウ化アルキルを含む生物標本用燻蒸剤である。
【０００９】さらに本発明は、前記ヨウ化アルキルはヨウ化メチルである、前記方法である。
【００１０】さらに本発明は、ヨウ化アルキルを含む燻蒸剤で燻蒸することを特徴とする、前記方法である。
【００１１】さらに本発明は、前記ヨウ化アルキルの含有量が、燻蒸剤質量に対して５質量％以上である、前記方法である。
【００１２】さらに本発明は、前記燻蒸剤を気化装置によって気化させて燻蒸する、前記方法である。
【００１３】さらに本発明は、燻蒸条件が、温度０〜４０℃、湿度５〜１００％である、前記方法である。
【００１４】さらに本発明は、前記燻蒸剤は、さらに殺虫剤または殺菌剤を含む、前記方法である。
【００１５】さらに本発明は、前記燻蒸剤と、前記殺虫剤または殺菌剤とをそれぞれ単独に、順次気化して燻蒸する、前記方法である。
【００１６】さらに本発明は、前記殺虫剤は、クロルピクリン、二硫化炭素、フッ化スルフリル、臭化メチルおよび青酸からなる群より選択される１以上の物質である、前記方法である。
【００１７】さらに本発明は、前記殺菌剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレイン、メタアクロレイン、ブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、アリルアルコール、ブチルアルコールおよび過酸化水素からなる群から選択される１以上の物質である、前記方法である。
【００１８】さらに本発明は、前記ヨウ化アルキルは、ヨウ化メチルである、前記方法である。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明は、ヨウ化アルキルを含む生物標本用燻蒸剤、および、密閉室内または密封容器を用いて遺伝物質の温存が望まれる生物標本を、ヨウ化アルキルを含む燻蒸剤で燻蒸することを特徴とする生物標本の保存方法であり、燻蒸により遺伝物質の破損および分解がし難いという利点を有する。
【００２０】生物標本とは、一般的に博物館、資料館、各種研究所における展示用または研究用の、外観を著しく変えることなくかつ遺伝情報を温存することが望まれる生物標本全般を指す。もちろん、個人レベルでの研究試料にも用いることができる。生物標本とは、植物または動物全般（例えば、昆虫、地衣類、菌類、ウイルス）の全体もしくは一部（例えば、種子、胞子、芽胞、毛皮、卵）を、周知の技術で標本化したものである。さらに、様々な微生物、昆虫等を含む土壌や岩石のサンプルも含まれる。ここで遺伝物質とは、核酸を意味し、ＤＮＡまたはＲＮＡを問わない。最も一般的にはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。
【００２１】燻蒸による遺伝物質の破損および分解はできるだけ低いことが好ましい。例えば、燻蒸後の標本から抽出、精製されたＤＮＡを、市販または合成のプライマーを用いてＰＣＲ法にて特定配列を増幅した場合、燻蒸前とほぼ同量かつ同品質のＰＣＲ産物が得られる、塩基配列解析において燻蒸剤の影響と思われる読解不可能領域が無いまたは微小である、クローニングして所望のタンパク質を生産できる、など、遺伝子工学的またはタンパク質工学的な周知の操作に十分使用可能な遺伝物質の品質を保つことが好ましい。
【００２２】密閉室内または密閉容器とは、燻蒸剤による燻蒸処理の間、燻蒸剤の機密性が維持される室内または容器であればよくその材質や大きさは多様であり得る。例えば、チャンバーや燻蒸室、燻蒸専用倉庫などの燻蒸専用施設が挙げられ、また小規模の燻蒸には一般的に化学実験で用いるデシケータや、ガラス、プラスチック製の密封可能な容器が挙げられる。燻蒸の準備面からは、チャンバーや燻蒸室の使用が好ましい。さらに、樹脂フィルムやシートで密封性が保持されるよう燻蒸物をくるむ場合（被覆燻蒸または包み込み燻蒸）、樹脂フィルムやシートを粘着剤等で張り合わせて作成した容器に標本を収納する場合（密閉燻蒸）も本発明において選択可能である。また、博物館、資料館、各種研究所の展示用または保存用の部屋がある程度密閉性を保てる場合には、これをそのまま本発明の燻蒸に用いても良い。
【００２３】このような密閉室内または密閉容器を使用することで、燻蒸剤の使用量を低減することができ、しかも燻蒸剤の大気中への放出を抑制し、回収処理も可能となる。これらの密閉室内または密閉容器に加えて、気温や湿度の調整装置を備えれば、燻蒸環境、標本の種類、サイズ、含水率等のにあわせた燻蒸処理が可能である。また、従来の臭化メチル／酸化エチレン合剤用の燻蒸設備を軽微な変更を加えるだけで使用可能である、という利点も有する。
【００２４】本発明の燻蒸剤は、ヨウ化アルキルを含有する。ヨウ化アルキルとしては、炭素数１から４のアルキルモノヨードが好ましい。例えばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化ブチル、ヨウ化ノルマルプロピルであり、これらは、殺生物効果が確実であり、沸点以下でも揮発性が高いために、本発明の使用条件下において効果が確実な濃度で液化することなく揮発状態を保ち、しかも従来品である臭化メチルよりも抗菌性に優れるためである。特に好ましくヨウ化メチルであり、これは、臭化メチルよりも抗菌性に優れると共に害虫に対する殺虫効果に優れるためである。
【００２５】ヨウ化アルキルの含有量は、燻蒸剤質量に対して、好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、さらにより好ましくは１５質量％以上である。ここで含有量が５質量％未満の場合、殺生物効果が低くなる恐れがある。ヨウ化アルキルを高含有することについては何ら不利益を生じないので、上限については特に限定されない。
【００２６】本発明では、ヨウ化アルキル単独使用の他に、他の殺菌剤や殺虫剤をヨウ化アルキルと共に使用することができる。使用できる殺菌剤としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレイン、メタアクロレイン、ブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、アリルアルコール、ブチルアルコール、過酸化水素がある。これらはヨウ化アルキルとの併用が可能であると共に、併用においても他の殺菌効果が損なわれない。本発明では、これら殺菌剤の１種を併用する場合の他２種以上を併用してもよい。
【００２７】さらに本発明では、ヨウ化アルキルと殺虫剤とをあわせて燻蒸に用いてもよく、それぞれ別段階として燻蒸してもよい。殺虫剤としては、クロルピクリン、二硫化炭素、フッ化スルフリル、臭化メチルおよび青酸が挙げられ、これらの１種を併用しても、２種以上を併用してもよい。なかでも、生物標本への影響が比較的少ないフッ化スルフリル、臭化メチルを併用することが好ましい。このようにすることによって、環境保全に留意しつつ殺虫および殺菌効果に優れる生物標本の燻蒸が可能である。
【００２８】燻蒸温度は、対象とする生物標本によって適宜選択しうるのであるが、温度０〜４０℃であることが好ましく、より好ましくは２０〜３０℃である。
【００２９】燻蒸剤は気化器を使用して予め気化し燻蒸することが好ましい。これは、ヨウ化アルキルを燻蒸容器内で自然気化させることよりも燻蒸時間を短縮でき、さらにヨウ化アルキルが液体の場合には、ヨウ化アルキルが直接生物標本に接触し、生物標本を汚染することも防ぐことができる。もちろん、容器中に噴霧器を用いて散布しても、燻蒸剤を含むシャーレやビーカー等を容器内に静置し自然気化させてもよい。これらは、特別な燻蒸設備を必要としないため、個人レベルの使用や、少量のサンプルを逐次燻蒸したい場合に非常に便利である。
【００３０】燻蒸時間は、対象とする生物標本の種類や燻蒸剤の種類により適宜選択できるが、一般には、２４〜７２時間で十分である。例えば、殺虫のためには１２〜２４時間が好ましく、殺カビのためには２４〜７２時間である。
【００３１】上記殺菌剤または殺虫剤は、予めヨウ化アルキルと混合した燻蒸剤を調製して燻蒸してもよく、ヨウ化アルキルと殺菌剤または殺虫剤をそれぞれ別個に気化、燻蒸してもよい。上記密閉室内または密封容器内のヨウ化アルキルの濃度は、好ましくは０．００５〜１．５ｍＭ／Ｌ、より好ましくは０．０２〜１．０ｍＭ／Ｌ、特に好ましくは０．０５〜０．５ｍＭ／Ｌである。また、殺菌剤の濃度は、好ましくは０．００５〜１．５ｍＭ／Ｌ、より好ましくは０．０２〜１．０ｍＭ／Ｌ、特に好ましくは０．０５〜０．５ｍＭ／Ｌである。また、殺虫剤の濃度は、好ましくは０．００５〜１．５ｍＭ／Ｌ、より好ましくは０．０２〜１．０ｍＭ／Ｌ、特に好ましくは０．０５〜０．５ｍＭ／Ｌである。この範囲で十分な殺生物性が得られると共に、生物標本の変質、腐食などが少ないからである。なお、燻蒸濃度は、対象とする生物標本の種類などを考慮して適宜上記範囲内で選択することができる。
【００３２】燻蒸温度は、対象とする生物標本の種類を考慮して選択することができる。広汎には５〜３０℃、好ましくは１０〜３０℃であるが、生物標本の種類によってさらに選択的に管理されるべきである。例えば、皮革では１５．５〜２３．５℃、毛皮では１６〜２４℃、昆虫、動植物標本では１６〜２４℃、剥製では４．４〜１０℃である。
【００３３】燻蒸湿度は、対象とする生物標本の種類を考慮して選択することができる。広汎には５〜１００％、好ましくは３０〜７０％であるが、生物の種類によって、含水率、構造の強度などの様々な性質を考慮する必要がある。例えば、相対湿度で表せば、皮革では５５〜６０％、毛皮では４５〜６３％、昆虫、動植物の標本では５０〜６３％、剥製では５０％が好ましい。
【００３４】次に本発明の燻蒸方法の一例を説明する。
【００３５】燻蒸対象である生物標本を用意する。ここで生物標本は通常の方法によって生物から作成されたものである。また標本の種類により、燻蒸前にシリカゲルなどの乾燥剤、活性炭などの吸着剤で前処理してもよい。
【００３６】次にこれらサンプルを、気化した燻蒸剤が均一にサンプルにまわるように密閉室内または密封容器中に適当に置き、燻蒸に適した温度、湿度に調整する。この際、好ましくは保温性の高い厚手の樹脂フィルムやシートを使用するか更にシート上を保温材で覆い温度調節または湿度調節器を使用して行うことが好ましい。
【００３７】次に燻蒸剤を、気化器を用いて予め気化する。気化した燻蒸剤をブロワーによって上記容器に送り、適切な時間燻蒸する。燻蒸中、温度、圧力、燻蒸剤濃度、湿度をそれぞれ適切に制御する。
【００３８】燻蒸終了後、燻蒸ガスを排気し、好ましくは回収する。残存したガスは、例えば活性炭のような多孔質材料を容器内に置いて吸着させて除去することが好ましい。使用済みの燻蒸ガスおよび多孔質材料は再度利用することができる。
【００３９】
【実施例】以下、本発明の実施例により具体的に説明する。
【００４０】＜実施例１および比較例１：ヨウ化メチル燻蒸による生物標本の燻蒸＞試料：ケゼニゴケ（葉状体）、アカマツ（葉）、アラカシ（葉）、ホウレンソウ（葉）、ブナシメジ、二ワトリ（ささみ）を、シリカゲル乾燥処理したものを用いた。
【００４１】方法：ゴム製ガス投入口（以下、「セプタム」ともいう）を有する３Ｌガラス製デシケータを用意した。デシケータの下にマグネチックスターラーを設置し、かつ内部に攪拌子を入れ、これにより内部雰囲気が常に均一になるようにした。
【００４２】それぞれ紙製の標本袋に包まれた上記試料、および、燻蒸剤気化用ガラスシャーレをデシケータの中に置いた。デシケータを密封し、内部の空気が所定圧力になるまで、セプタムに差し込んだシリンジを用いて脱気した。次に、シリンジを用いてシャーレに所定量の燻蒸剤を投入した。ガラスシャーレ上で燻蒸剤は気化した。
【００４３】使用燻蒸剤および燻蒸条件：温度は１９〜２３℃、湿度は３０〜３５％であり、下記表１に示す燻蒸剤を用いて、上記試料の燻蒸を行った。燻蒸後、各サンプルを、室内のドラフト中、２０℃、湿度４０％で１２時間放置した。
【００４４】
【表１】

【００４５】表２に、燻蒸開始からのデシケータ内ガス濃度を、実施例および比較例においてガスクロマトグラフィーにより測定した結果を示す。
【００４６】
【表２】

【００４７】表２より、実施例および比較例は、殺虫および殺菌に十分な燻蒸剤濃度を７２時間維持しており、殺菌、殺虫条件を十分満たしていた。
【００４８】＜燻蒸サンプルからのＤＮＡ抽出および遺伝子解析＞上記で得られた燻蒸サンプルから、ＤＮＡを抽出し、特定配列をＰＣＲ法にて増幅し、その塩基配列を解析することにより、燻蒸によるＤＮＡへの影響を調べた。
【００４９】各サンプルからのＤＮＡの抽出：各サンプルを少量の石英砂とともに乳鉢で粉砕した。次に、乳鉢に氷冷したＰＥＧ溶液を２．０ｍｌ加えてよく混合し、得られた溶液をチューブに移し、氷上に１０分間放置した。このチューブを遠心（５，０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、上清を捨てた。上記同様にＰＥＧ溶液を加えて遠心した。２回目の遠心後、上清を捨てて、そこにＴＥ溶液を２ｍｌ加えてよく攪拌し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、上清を捨てた。
【００５０】このチューブに抽出用溶液０．８ｍｌを加えて沈殿を攪拌した後、室温で１０分放置した。次にチューブにクロロホルム液０．８ｍｌを加え、ロータリー式振盪機で１０分間転倒混和した。その後、チューブに５Ｍ酢酸カリウム水溶液を０．３ｍｌ加えてよく混合し、１０分間氷上に放置し、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した。遠心後、上清を新しいチューブに移し、ここに等量のイソプロピルアルコールを加え、数回ゆるやかに転倒混和し、氷上に１０分間放置し、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した。遠心後、上清を捨てて、１０分間沈殿を乾燥させた。
【００５１】このチューブに２００μｌのＲＮアーゼ溶液を加えて、３７℃で３０分間放置した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した。上清を新しいチューブに移し、２倍量の酢酸アンモニウム−エタノール溶液を加え、転倒混和し、−２０℃で一晩放置した。
【００５２】チューブを遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、上清を捨て、７５％エタノール溶液４００μｌを加え、さらに遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を捨て、１０分間沈殿を乾燥させた（これを２回繰り返した）。その後、滅菌水５０μｌを加えて、ＤＮＡを溶解させて、ＤＮＡ溶解液を得た。
【００５３】抽出ＤＮＡの評価：抽出されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、収率を調べた。まず、アガロースゲルをサブマリン型電気泳動装置にセットし、上記ＤＮＡ溶解液２μｌおよびオレンジＧ色素液５μｌを混合し、これを各ウェルにローディングした。ここで、それぞれのサンプルは、適宜希釈するかまたは泳動量を調節し、泳動像が適切に観察できるように調製された。泳動槽の蓋を閉め、１００Ｖ、３０分間泳動した後、暗所にて紫外線をゲルに当ててバンドを確認した。
【００５４】ＰＣＲ法による遺伝子増幅試験：ヨウ化メチルによる燻蒸処理を施したアブラナおよびアラカシより抽出したＤＮＡを鋳型として、葉緑体遺伝子ｒｂｃＬ（リブロース−１，６−２リン酸脱炭酸・酸化酵素のラージサブユニットをコードする）および核遺伝子ａｄｈ（アルコール脱水素酵素をコードする）断片を、ＰＣＲ法によって増幅させた。同様に、ニワトリより抽出したＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア遺伝子ｃｙｔｂ（チトクロームｂタンパク質をコードする）断片を増幅させた。用いたプライマーの配列を以下に示す。
【００５５】
【化１】

【００５６】遺伝子の増幅方法を以下に示す。基質・酵素・プライマー溶液（１０μｌ）の入った０．５ｍｌチューブに、上記で得られた抽出ＤＮＡを５μｌ（ＤＮＡは約５ｎｇ含有）加え、滅菌水で２５μｌに調製し、ＰＣＲサーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いてＰＣＲを、以下のサイクルで行った。
【００５７】
サイクル１（１回）：94℃(1分)、60℃(1分)、72℃(1分30秒)サイクル２（２４回）：95℃(30秒)、60℃(30秒)、72℃(1分)得られたサンプルを分子量マーカーとともに電気泳動し、フラグメントの増幅を確認した。
【００５８】塩基配列の決定：ヨウ化メチルによる燻蒸処理を行ったアブラナのＤＮＡより増幅された葉緑体遺伝子ｒｂｃｌ断片と、ニワトリのＤＮＡより増幅されたミトコンドリア遺伝子ｃｙｔｂ断片を、ジーンクリーンII（Gene Clean II; Bio 101Co.）によって精製した。次にビッグダイターミネーターシークエンスキット（Big Dye terminator sequening Kit）と、ＡＢＩ ３１０プリズムシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いて精製した各断片の配列を決定した。
【００５９】結果および考察：（１）抽出ＤＮＡの収率について各燻蒸処理後サンプルの電気泳動像を図１に示す。Ａはケゼニゴケ、Ｂはアカマツ、Ｃはアラカシ、Ｅはホンレンソウ、Ｆはブナシメジ、Ｇはニワトリであり、それぞれレーン１に無処理サンプル（対照）、レーン２に本発明のヨウ化メチル燻蒸サンプル、レーン３に酸化エチレン／臭化エチレン混合剤燻蒸サンプル（以下、比較サンプルともいう）を電気泳動した。それぞれのサンプルを適宜希釈するかまたは泳動量を調節し、泳動像が適切に観察できるようにした。具体的には、ケゼニゴケおよびブナシメジは原倍で２μｌ、ホウレンソウは１００倍希釈で２μｌ、それ以外は１０倍希釈で２μｌを泳動した。
【００６０】まず植物・菌類サンプルについて考察する。ケゼニゴケおよびアカマツのヨウ化メチル燻蒸サンプル（ＡおよびＢのレーン２）において、対照（レーン１）とほぼ同量のＤＮＡ量が観察された。またアラカシにおいては、対照（Ｃのレーン１）および比較サンプル（レーン３）よりヨウ化メチル燻蒸サンプル（レーン２）のほうが、ＤＮＡ収率が高かった。これは、対照サンプルでは細胞壁やクチクラ層の影響でＤＮＡ収率が低く、一方ヨウ化メチル燻蒸サンプルでは燻蒸によりそれらが分解されやすくなりＤＮＡの収率を上げることができたものと推測される。比較サンプルでＤＮＡ収率が低い原因は、細胞壁やクチクラ層の影響かまたは燻蒸によるＤＮＡ分解のいずれかが考えられる。
【００６１】一方、ホウレンソウおよびブナシメジのヨウ化メチル燻蒸サンプル（ＥおよびＦのレーン２）では、対照（レーン１）に比べるとＤＮＡ量が減少しているが、酸化エチレン／臭化エチレン混合剤燻蒸サンプルはさらに減少している。このように、ホンレンソウ（Ｅ）のようにクチクラ層を有さない草本類植物においては、燻蒸によるＤＮＡ分解、変性作用を受けやすいが、抽出されるサンプル当りのＤＮＡ量が多いために、研究材料としては十分な量が燻蒸後も確保できる。
【００６２】次に動物サンプルについて考察する。ニワトリのヨウ化メチル燻蒸サンプル（Ｇのレーン２）において、対照（レーン１）とほぼ同量のＤＮＡが残存しており、一方で酸化エチレン／臭化エチレン混合剤燻蒸サンプル（レーン３）はまったくバンドが検出されなかった。
【００６３】まず対照とヨウ化メチル燻蒸サンプルとがほぼ同量のＤＮＡ収率を示したことについて説明する。通常、動物細胞からのＤＮＡ抽出において、クロロホルム処理により大量のタンパク質が沈殿するが、このときＤＮＡもそれと同時に沈殿し、収率が低下するという問題が生じる（対照、すなわち燻蒸非処理サンプルがこれにあたる）。本発明のヨウ化メチルは、タンパク質のジスルフィド結合を切断することにより、高次構造を壊す作用があると推測されている。これにより、タンパク質は可溶化し、ＤＮＡより離脱することによって、クロロホルム処理などのタンパク質沈殿処理においてＤＮＡが一緒に沈殿してＤＮＡの収率を低下させることを防ぐ、と考えられる。このような理由により、対照とほぼ同量のＤＮＡが得られたのであろう。
【００６４】以上より、植物、菌類、動物サンプルにおいて、本発明の燻蒸剤はＤＮＡを損傷しにくく、かつタンパク質を変性させ可溶化させるため動物サンプルにおいては精製のＤＮＡ収率を高めることがわかる。
【００６５】
（２）ＰＣＲ法による遺伝子増幅試験について各燻蒸処理後サンプルを鋳型にしたＰＣＲ産物の電気泳動像を図２に示す。Ａはアラカシ（ｒｐｃＬ遺伝子断片）、Ｂはアブラナ（ｒｐｃＬ遺伝子断片）、Ｃはアラカシ（ａｄｈ遺伝子断片）、Ｄはアブラナ（ａｄｈ遺伝子断片）、Ｅはニワトリ（ｃｙｔｂ遺伝子断片）であり、それぞれレーン１に無処理サンプル（対照）、レーン２に本発明のヨウ化メチル燻蒸サンプル、レーン３に酸化エチレン／臭化エチレン混合剤燻蒸サンプルを鋳型にしたＰＣＲ産物を電気泳動した。ここで、ニワトリの酸化エチレン／臭化エチレン混合剤燻蒸サンプルはＤＮＡ濃度が著しく低かったため、最終サンプル、１０×最終サンプル、および５０×最終サンプルの３種類の濃度に調整し、それぞれについてＰＣＲ増幅を行った。
【００６６】アラカシ（Ａ）およびアブラナ（Ｂ）の電気泳動像をみると、ｒｐｃＬ遺伝子断片と思われる約１０５０ｂｐ付近に、対照、ヨウ化メチル燻蒸サンプルおよび比較サンプルのすべてに単一バンドが検出された。同様にアラカシ（Ｃ）およびアブラナ（Ｄ）において、ａｄｈ遺伝子断片と思われる約１０００〜１１００ｂｐの単一バンドが全サンプルにおいて検出された。
【００６７】同様に、ニワトリ（Ｅ）の電気泳動像においても、ｃｙｔｂ遺伝子断片と思われる約１０３０ｂｐの単一バンドが全サンプルにおいて検出された。また、ニワトリについては比較サンプルの鋳型ＤＮＡ濃度を変えてＰＣＲを行ってみたが、いずれの濃度においてもＰＣＲ産物の増幅量に変化は見られなかった。この原因は、酸化エチレン／臭化エチレン混合剤での燻蒸によってＤＮＡが変質したかまたは増幅反応を阻害する成分が残存してしまうかのいずれかと推測される。
【００６８】（３）塩基配列解析についてアブラナを用いて、上記（２）と同様にアブラナｒｂｃＬ遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行った。得られた対照、ヨウ化メチル燻蒸サンプル、酸化エチレン／臭化エチレン混合剤燻蒸サンプルのアブラナｒｂｃＬ遺伝子断片と思われるＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。それぞれのサンプルにおいて、ＰＣＲ産物を１チューブ当り約５０ｎｇ仕込んで反応させた。ただしニワトリの比較サンプルのみ、ＰＣＲ産物収量が少なかったため、得られた全ＰＣＲ産物を精製、濃縮したものを仕込んだ。
【００６９】得られた塩基配列ピークを図３および図４に示す。図３は、アブラナの燻蒸処理後サンプルを鋳型にし、ｒｂｃＬ遺伝子を増幅させたＰＣＲ産物の塩基配列ピーク図である。１は無処理の葉のＤＮＡを、２はヨウ化メチル処理の葉のＤＮＡを、３は酸化エチレン／臭化エチレン混合剤処理の葉のＤＮＡをそれぞれ鋳型にして増幅させたＰＣＲ産物を解析したものである。図４は、ニワトリの燻蒸処理後サンプルを鋳型にし、ｃｙｔｂ遺伝子を増幅させたＰＣＲ産物の塩基配列ピーク図である。１は無処理の組織のＤＮＡを、２はヨウ化メチル処理の組織のＤＮＡを、３は酸化エチレン／臭化エチレン混合剤処理の組織のＤＮＡをそれぞれ鋳型にして増幅させたＰＣＲ産物を解析したものである。これより、アブラナではいずれのサンプルも、全配列解読可能でかつ配列の間違いもない、明晰な解析結果が得られた。ニワトリでも上記同様の明晰な解析結果が得られたが、比較サンプルではプライマー部位から比較的近傍（図中の矢印部分）であるにもかかわらず解読困難な個所があり、加えて配列後半は解読不可能であった。
【００７０】以上（２）および（３）の結果より、ヨウ化メチル燻蒸はＤＮＡを変性しにくく、ＰＣＲ法、塩基配列解析に良好に用いられることがわかった。
【００７１】ＤＮＡ抽出用試薬の調製：上述の実験で用いられた各種試薬の組成を以下に示す。
【００７２】１．ＰＥＧ溶液：１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００１Ｍ ＮａＣｌ（オートクレーブ滅菌処理後、冷蔵保存。使用時によく混ぜる）
２．ＴＥ溶液：１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ０．８）ｍＭ１ｍＭ ＥＤＴＡ（オートクレーブ滅菌処理後、冷蔵保存。使用時によく混ぜる）
３．抽出用溶液：１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
１．４Ｍ ＮａＣｌ１０％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンＮａ（蒸留水を加えて総液量を１００ｍｌに調製する）
４．クロロホルム液：クロロホルム ２４ｍｌイソアミルアルコール １ｍｌ５．ＲＮアーゼ溶液：０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＴＥ溶液 ２５０μｌ６．酢酸アンモニウム−エタノール液：酢酸アンモニウム ７．７ｇ滅菌水 ５．０ｍｌエタノール ９０．０ｍｌ７．電気泳動緩衝液トリス ４８ｇＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．７４ｇ酢酸 １．４４ｍｌ（脱イオン水１０００ｍｌに溶解させる）
８．２％ アガロースゲルアガロース ２ｇ電気泳動緩衝液 １００ｍｌ９．エチジウムブロマイド染色液エチジウムブロマイド ０．５ｍｇ（脱イオン水１０００ｍｌに溶解させる）
１０．オレンジＧ色素液オレンジＧ ０．１ｇサッカロース ５．０ｇＴＥ溶液 １００ｍｌ１１．基質・酵素・プライマー溶液 ２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＴＴＰ）
１０μｌ １０×緩衝液a) ２５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３０μｌ 滅菌水 ３５μｌ Taqポリメラーゼ(5U/μl) １．５μｌ プライマーA(50pmol/μl) １μｌ プライマーB(50pmol/μl) １μｌ （a)５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）
ＤＮＡ操作に用いられる上記滅菌水は、孔径０．２２μｍミリポアフィルター（ミリポア株式会社製）を用いて吸引ろ過した脱イオン蒸留水をオートクレーブ滅菌処理したものを用いた。
【００７３】＜実施例２〜４：燻蒸による殺生物能力試験＞本発明の燻蒸材の殺生物能力を、コクゾウ虫（Sitophilus zeamais）および黒コウジカビ（Aspergillus niger）を用いて確かめた。
【００７４】まず、密封系作製の手順を以下（１）〜（６）に示す。
【００７５】（１）ポテトデキストロース寒天平板培地で２７℃、５日間培養し得た黒コウジカビ（Aspergillus niger）のコロニーの一部を、滅菌した生理食塩水に懸濁した。その一部を無菌的に所定倍率に希釈して、各希釈液を再びポテトデキストロース寒天平板培地に塗抹した。残りの懸濁液は４℃で保存した。
【００７６】（２）塗抹をしたポテトデキストロース寒天平板培地を２７℃、３日間培養し、出現したコロニーの数から保存中の懸濁液の菌数を算出した。懸濁液中の生菌濃度は、２×１０7ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００７７】（３）保存中の懸濁液の０．１ｍｌを１０ｍｍ径の滅菌したペーパーディスクにしみ込ませ、クリーンベンチ内で４時間風乾燥した。乾燥後のペーパーディスクをガラス製サンプル管に入れ、内径１ｍｍ長さ６０ｍｍの中空なガラス管を中央に貫通させたゴム栓で蓋をし、供試菌とした。
【００７８】（４）玄米にて飼育中のコクゾウ虫１０匹を飼育床の古玄米１ｇと共に２０ｍｌ容量のガラス製サンプル管に入れ、内径１ｍｍ長さ６０ｍｍの中空なガラス管を中央に貫通させたゴム栓で蓋をし、供試虫とした。
【００７９】（５）投薬口を設けた内容量１．５Ｌのガラス製デシケータ内にある陶器製の中板上に上記供試虫および供試菌を入れ、蓋の接面をシリコングリスを塗布し密封性を確保した。
【００８０】（６）ゴム製のシリンジ差し込み栓を装着したガラス管を貫通させたゴム栓で上記（５）の投薬口を密封した。
【００８１】実施例２予め供試虫および供試菌を配置した密封系内に、表３に示すヨウ化メチルの所定量をシリンジで秤量し、投薬口のシリンジ差し込み栓にシリンジの針を内部まで貫通させたのち注入し、それぞれの投薬量のデシケータを２５℃にて２４時間放置した。尚、デシケータ内の湿度は７０％とした。なお、高湿度下におけるヨウ化メチルの燻蒸効果を評価するため、上記手順（５）のデシケーターの陶器製中板の下に精製水を浸した脱脂綿を置き、温度２５℃、湿度１００％の環境を調製した。
【００８２】結果の判定はコクゾウ虫の成虫に対する効果を試験終了後の成虫の致死で、蛹および卵については２５℃、湿度７５％の孵卵器内でその後３０日までの孵化を確認することで評価した。また、黒コウジカビの殺菌効果を試験したペーパーデイスクをポテトデキストロース寒天平板培地上に移しその後７日間の増殖の確認において行い、有効性の判断は試供した虫並びに菌の１００％致死をもって有効とし、ヨウ化メチルの燻蒸効果を評価検討した。また、比較として臭化メチルの有効性も同様に試験した。結果を表３に示す。
【００８３】表３に示すように、コクゾウ虫（成虫、蛹、卵）の殺虫を目的とするヨウ化メチルの最低有効投薬量は０．０１ｍＭ／Ｌであり高湿度下においてもその効果はかわらなかった。また、黒コウジカビの殺菌を目的とするヨウ化メチルの最低有効投薬量は０．５０ｍＭ／Ｌであった。
【００８４】
【表３】

【００８５】実施例３予め供試虫および供試菌を配置した密封系内にヨウ化メチルの０．０２ｍＭ／Ｌまたは０．２ｍＭ／Ｌを投薬した後、他の薬剤成分の所定量をさらに投薬してヨウ化メチルとの共存による燻蒸効果を評価した。各投薬量のデシケータは、温度２５℃で２４時間放置したものである。尚、デシケータ内の湿度は６５〜７５％であった。結果を表４に示す。
【００８６】コクゾウ虫成虫においては試験した投薬系全てで１００％の致死を確認した。その一方、黒コウジカビに対する殺菌効果は、ヨウ化メチル単剤では殺菌不可能な投薬量下においてもヨウ化メチルと殺菌効果を期待した種々薬剤殺菌との併用によって、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレイン、メタアクロレイン、ブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、アリルアルコール、ブチルアルコールあるいは過酸化水素おいて殺虫と殺菌を目的とした場合の投薬量を低減することができた。
【００８７】
【表４】

【００８８】実施例４予め供試虫および供試菌を配置した密封系内に表５に示す被試験物質を投薬し、燻蒸効果を検討した。各投薬量のデシケータを温度２５℃で２４時間放置した。尚、デシケータ内の湿度は６５〜７５％であった。結果を表５に示す。コクゾウ虫に対する殺虫効果は、測定した濃度範囲においてヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化ｎプロピルおよびヨウ化ｎブチルにおいて殺虫効果が認められた。
【００８９】
【表５】

【００９０】
【発明の効果】本発明は、ヨウ化アルキルを含む燻蒸剤で生物標本を燻蒸することにより、生物標本を変質させることなく、優れた殺菌、殺虫効果を有することに加え、遺伝物質が破損および分解されにくいという特徴を有する。当該方法にて得られた生物標本の遺伝物質は、抽出後、ＰＣＲ法による特定配列の検出、クローニング、変異導入、塩基配列解析等の、遺伝子工学的およびタンパク質工学的な解析、操作の材料として十分の品質を有する。
【出願人】 【識別番号】０００２２７６５２
【氏名又は名称】日宝化学株式会社
【出願日】 平成１３年６月２７日（２００１．６．２７）
【代理人】 【識別番号】１０００７２３４９
【弁理士】
【氏名又は名称】八田 幹雄 （外４名）
【公開番号】 特開２００３−１２４０１（Ｐ２００３−１２４０１Ａ）
【公開日】 平成１５年１月１５日（２００３．１．１５）
【出願番号】 特願２００１−１９５４９２（Ｐ２００１−１９５４９２）