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【発明の名称】 アミノ酸分析方法および装置
【発明者】 【氏名】藤井 芳雄

【氏名】伊藤 正人

【氏名】甲田 公良
【要約】 【課題】５３成分を一斉に分析可能なアミノ酸分析方法を提供する。

【解決手段】一つまたは複数種が混合された緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析方法において、前記試料が導入される緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくともβ−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで０.３mol／Ｌ以下とすることを特徴とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】一つまたは複数種が混合された緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析方法において、前記試料が導入される緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくともβ−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで０.３mol／Ｌ以下とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項２】請求項１のアミノ酸分析方法において、前記β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで、前記緩衝液のｐＨを３.５ 以下とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項３】請求項１のアミノ酸分析方法において、γ−アミノ−ｎ−酪酸（γ−ＡＢＡ）からハイドロオキシリジン(Ｈｙｌｙｓ)までの溶出時間で、前記緩衝液のリチウムイオン濃度とｐＨをグラジェントに上昇させることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項４】請求項３のアミノ酸分析方法において、前記リチウムイオン濃度は、０.４４mol／Ｌから１.００mol／Ｌにかけて、前記ｐＨは、３.６６から４.１にかけて上昇させることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項５】請求項１のアミノ酸分析方法において、ハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙｓ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）までの溶出時間で、前記緩衝液のリチウムイオン濃度を０.８１mol／Ｌ、ｐＨを４.００ とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項６】請求項５のアミノ酸分析方法において、ヒスチジン（Ｈｉｓ）溶出後は、前記緩衝液のリチウムイオン濃度を１.００mol／Ｌ、ｐＨを４.１とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項７】請求項１のアミノ酸分析方法において、バリン（ｖａｌ）からホモシトルリン（ＨＣｉｔ）の溶出時間で、カラム温度を７０℃とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項８】請求項１のアミノ酸分析方法において、チロシン（Ｔｙｒ）の溶出時間から、カラム温度を７０℃とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項９】請求項１のアミノ酸分析方法において、システイン−ホモシステイン ミクスド ジスルフィド（Ｃｙｓ−ＨＣｙｓ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）の溶出時間で、カラム温度を６３℃とすることを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項１０】一つまたは複数種が混合された緩衝液を用いて、ホスホセリン（Ｐ−Ｓｅｒ），タウリン（Ｔａｕ），ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ），ウレア(Ｕｒｅａ)，アスパラギン酸（Ａｓｐ），ハイドロオキシプロリン（Ｈｙｐｒｏ），メチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯＸ），スレオニン（Ｔｈｒ），セリン（Ｓｅｒ），アスパラギン（ＡｓｐＮＨ2），グルタミン酸（Ｇｌｕ），グルタミン（ＧｌｕＮＨ2），サルコシン(Ｓａｒ），α−アミノ アデピン酸(α−ＡＡＡ)，プロリン（Ｐｒｏ），グリシン（Ｇｌｙ），アラニン（Ａｌａ），シトルリン（Ｃｉｔ），α−アミノ−ｎ−酪酸（α−ＡＢＡ），バリン（Ｖａｌ），ピペコリン酸（Ｐｉｐｅｃｏ），ホモシステイン（ＨＣｙｓＨ），メチオニン(Ｍｅｔ)，ホモシトルリン（ＨＣｉｔ），アローイソロイシン（Ａｌｌｏ−Ｉｌｅ），シスチン（Ｃｙｓ），サッカロピン（Ｓａｃｃｈａ），イソロイシン（Ｉｌｅ），ロイシン（Ｌｅｕ），チロシン（Ｔｙｒ），シスタチオニン（Ｃｙｓｔｈｉ），フェニルアラニン（Ｐｈｅ），アルギニノコハク酸（ＡＳＡ），システイン−ホモシステイン ミクスド ジスルフィド（Ｃｙｓ−Ｈｃｙｓ），β−アラニン（β−Ａｌａ），アミノ レブリン酸（ＡＬｅｖＡ），β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ），γ−アミノ−ｎ−酪酸（γ−ＡＢＡ），ホモシスチン(ＨＣｙｓ)，アルギニノコハク酸 アンヒドライド １（ＡＳＡ−Ａｎｈｙ１），エタノールアミン（ＥＯＨＮＨ2），トリプトファン(Ｔｒｐ），アンモニア(ＮＨ3），ハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙｓ），アミノエチルシステイン（ＡＥＣ），オルニチン（Ｏｒｎ），リジン（Ｌｙｓ），１−メチル ヒスチジン(１Ｍｅｈｉｓ)，ヒスチジン（Ｈｉｓ），３−メチル ヒスチジン（３Ｍｅｈｉｓ），アンセリン（Ａｎｓ），カルノシン（Ｃａｒ），アルギニン（Ａｒｇ）の各成分を分析対象成分として分析を行うアミノ酸分析方法であって、前記緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくとも前記β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで０.３mol／Ｌ以下とし、ハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙｓ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）までの溶出時間で、０.８１mol／Ｌに保持することを特徴とするアミノ酸分析方法。
【請求項１１】複数の緩衝液を各緩衝液毎に設けられたバルブを調整することで混合し、当該混合された緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析装置において、前記混合後の緩衝液のリチウムイオン濃度が、少なくとも前記β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで０.３mol／Ｌ以下であり、ハイドロオキシリジン(Ｈｙｌｙｓ）からヒスチジン(Ｈｉｓ)までの溶出時間で、０.８１mol／Ｌに保持されるように、前記バルブを制御して緩衝液の流量調整を行うことを特徴とするアミノ酸分析装置。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床分野に好適なアミノ酸分析方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸分析計は大別して、蛋白加水分解物アミノ酸約２０成分を対象とした標準分析法と、生体液アミノ酸類縁物質約４０成分を対象とした生体液分析法を行うものに分類できる。ここでは生体液分析法、すなわち、血清や尿，髄液などの生体液を分析し、これを臨床的に利用して、病気の診断や、治療に役立てることができる分析法について述べる。
【０００３】生体液分析法を示した例としては、特開昭５３−６０２９１号公報，特開昭５９−１０８４９号公報,特開平４−１９４５７０号公報,特開平９−８００３７号公報等がある。また、報告文として、Journal of Chromatograhy，224 ; 315-321(1981)「Resolution of 52 ninhydrin-positive compounds with a High-speed amino acid analyzer」、Clinical Chemistry 43 ; 8，1421−1428(1997)「Amino Acid determination inbiological fluids by automated ion-exchangechromatography:performance of Hitachi L-8500A」がある。
【０００４】これら、従来の生体液分析法は、複数の緩衝液を混合し、混合した緩衝液に試料を添加し、分離カラムを通過させて検出するという一連の分析手法は変わるところはないが、分離カラムや緩衝液の流速などを工夫することにより、時代と共に分析時間が早くなり、通常は１１０分，高速の場合でも９０−６０分で分析できるようになった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】生体液分析法では、現在上記に示したように約４０成分（厳密には、表１に示した＊印の付されていない４１成分）の分析を一斉に行うことができる。ところが最近、これまで分析対象となっていなかったような成分が特定の病気を知るために有効であることが発見され、上記４１成分に加え、それらの成分を合わせて分析したいという要求が高まりつつある。具体的には、表１の＊印の付された１２成分が従来にない新たな分析対象成分である。当然、これら新たな１２成分は、既存の４１成分と同時に分析でき、且つそれぞれのピークが分離できることが望ましい。即ち、５３成分のアミノ酸を一斉同時分析しようという要求が生じつつある。

【０００６】

【０００７】ところがこれらの追加成分のほとんどは、特定の時間帯に集中して溶出されるので、従来からある４１成分用の分析法では、既存の何れかの成分の溶出時間と重複してしまい、ほとんど分離ができない状態にあった。
【０００８】本発明の目的は、新たに着目されるようになった１２成分を含む全５３成分のアミノ酸を一斉に分析でき、且つ出来るだけ効率良く短い時間で分析を行うことが出来るアミノ酸分析方法および装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らが、分離実験を重ねたところ、これら追加成分を含めた５３成分を一斉に分析可能な分析法を見出した。
【００１０】本発明の特徴は、緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくともβ−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで０.３mol／Ｌ以下とすることである。
【００１１】また、好ましくは、β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）が溶出される時間まで、前記緩衝液のｐＨを３.５以下とすることである。
【００１２】更に好ましくは、γ−アミノ−ｎ−酪酸（γ−ＡＢＡ）からハイドロオキシリジン（Ｈｙｌｙｓ）までの溶出時間で、リチウムイオン濃度とｐＨをグラジェントに上昇させることである。
【００１３】更に好ましくは、ハイドロオキシリジン(Ｈｙｌｙｓ)からヒスチジン(Ｈｉｓ)までの溶出時間で、０.８１mol／Ｌに保持することである。
【００１４】上記に示すように、本発明においては、緩衝液の切替え時間，混合比，グラジェント勾配などの分離改善要因を組み合わせることで、部分的なアミノ酸の分離バランスをよくすることが出来、総合的に５３成分のアミノ酸を分離することができた。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、従来実施例と比較しながら本発明の実施例の詳細を述べる。
【００１６】図２は本発明のアミノ酸分析計の装置構成及び流路説明図である。１〜４はそれぞれ第１〜第４緩衝液、５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリーズ６によって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８，オートサンプラ９を経由して分離カラム１０に送られる。オートサンプラ９によって導入されたアミノ酸試料は分離カラム１０で分離される。ここで分離した各アミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合し、加熱された反応コイル１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸は検出器１５で連続的に検知され、データ処理装置１６によってクロマトグラム及びデータとして出力され、記録，保存される。
【００１７】上記第１緩衝液１〜第４緩衝液４およびカラム再生液５としては、市販のＬ−８５００−ＰＦ−ＫＩＴ（三菱化学（株）製）を用いた（表２）。ニンヒドリン試薬１１は市販のニンヒドリン試液Ｌ−８５００セット(和光純薬工業（株）製)を用いた。分離カラム１０にはパックドカラム４.６mmＩＤｘ６０mm、充填剤としては、イオン交換樹脂２６２２ＳＣ（日立製作所製）を用いた。

【００１８】次に本発明の分析プログラムを図３に示す。また、図３の緩衝液のグラジェント混合プログラムを図表化したものを図５（Ａ）に示す。
【００１９】ここで図３の分析プログラムについて説明する。「％Ｂ１−％Ｂ５」欄は、それぞれ第１緩衝液１〜カラム再生液５に相当する。時間０で、％Ｂ１−％Ｂ５の欄に１００.０ とあるのは相当する電磁弁が１００％開くという意味である。８０と２０は、相当する二つの電磁弁が時間比で８０％と２０％に開く、すなわち８０％と２０％に液が混合するという意味である。さらに時間と共に混合比を変えると、グラジェント混合が可能となる。図１の構成であれば、最大５液までグラジェントができる。
【００２０】「温度」は、分離カラムの温度プログラムを示す。３８とあるのは次の指定時間まで３８℃一定を保つという意味である。
【００２１】「流量１」は、緩衝液ポンプの流量、「流量２」はニンヒドリンポンプの流量である。
【００２２】「％Ｒ１−％Ｒ３」欄は、ニンヒドリン試薬の混合比である。通常ニンヒドリン試薬は２液に分かれて市販されており、使用時にＲ１とＲ２は５０％ずつ混合するようになっている。Ｒ３は蒸留水が設置してあり、分析終了時の洗浄などに使用する。
【００２３】ここで、図４に従来行われていた分析プログラムを示す。また、図４の緩衝液のグラジェント混合プログラムを図表化したものを図５（Ｂ）に示す。
【００２４】図５から分かるように、従来は基本的に緩衝液は段階的に切替えが行われていた。これに対して、本発明においては、全体の分析時間は長くなるものの、グラジェントを多用し、ゆっくりとした緩衝液の切替えを行うようにしている。
【００２５】図１（Ａ）に、図３の分析プログラムを使用して得られた、本発明の結果である分析クロマトグラムを示す。また比較のため、図１（Ｂ）に従来の図４の分析プログラムによるクラマトグラムを示す。どちらのクロマトグラムも表１に示すアミノ酸試料５３成分を測定したものである。尚、図１（Ａ）には各ピークに成分の略語が記載してあるが、表１にはアミノ酸の和文名，英文名のほかに、クロマトグラムで使用している略語を記載してあるので参照願いたい。また、図１（Ｃ）は、図１（Ａ）のクロマトグラムと図１（Ｂ）のクロマトグラムのそれぞれ同じ成分のピークを線で結び表したものである。
【００２６】図１から分かるように、図１（Ｂ）ではＶａｌ〜γ−ＡＢＡの成分の間に多くの成分が集中して、良く分離出来ていない。図１（Ｂ）のＶａｌ〜γ−ＡＢＡ間に相当する部分の拡大を図６に示す。ＳａｃｃｈａとＣｙｓや、ＴｙｒとＣｙｓ−Ｈｃｙｓなどピークが重なっている成分が多く見られる。これに対して、図１（Ａ）では各成分が良く分離されていることが分かる。
【００２７】次に、図１（Ａ）に示すように、５３成分の一斉分析を可能にした本発明の分析プログラムの作成過程について述べる。
【００２８】まず各成分のピーク分離をよくするための要因であるが、分離カラムを固定し、緩衝液の処方を表２に固定した場合、次の要因が考えられる。
【００２９】１.Ｌｉイオン濃度の強さによるピーク位置の移動２.ｐＨの強さによるピーク位置の移動３.カラム温度によるピーク位置の移動４.上記１.２.３.の組み合わせこのほかに、緩衝液ポンプの流速が考えられるがここでは述べない。なお、例えば通常緩衝液ポンプの流速を２倍にすると、ほぼ比例的に分析時間が１／２に変わることは、よく知られていることである。この場合、全体的に各ピーク間の分離が悪くなることも同時に知られていることである。
【００３０】以上の要因に基づいて、分離改善する具体的手段としては、次の項目が考えられる。
【００３１】ａ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェント混合比を変える。
【００３２】ｂ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェント混合比の切替え開始時間を変える。
【００３３】ｃ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェント混合比の切替え終了時間を変える。
【００３４】ｄ：緩衝液の一定の混合比またはグラジェント混合比を３液以上にする。
【００３５】ｅ：カラム温度を変える。
【００３６】ｆ：カラム温度を切替える開始時間を変えるｇ：カラム温度を切替える終了時間を変えるｈ：上記ａ〜ｇの組み合わせ。
【００３７】以上の手段を用いた具体的分離改善の実施例を図９〜図１７を用いて説明する。
【００３８】尚、分析プログラムの時間（緩衝液切替え時間，カラム温度切替え時間等）は、図２の電磁弁シリーズ６における時間を基準としているため、クロマトグラムに示された各成分が溶出した時間（保持時間）とは異なるものであるから、その点留意願いたい。分析プログラムの時間と保持時間は、緩衝液が電磁弁シリーズ６から検出器１５に至るまでに相当する程度のタイムラグを有しており、具体的には、約５〜１０分位のずれがある。
【００３９】図９は、分析プログラムの８７分〜１０９分の間で、緩衝液Ｂ３＝１００％の場合（Ｂ）と、三つの緩衝液をグラジェントにした場合（Ａ）の分離の状態を示したものである。図９から緩衝液Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４を３液グラジェントにした方が、γ−ＡＢＡ〜Ｌｙｓ間の分離バランスが良くなることが分かる。特にＡＳＡ−Ａｎｈｙ１とＥＯＨＮＨ2 の分離が良くなる。これは、リチウムイオン濃度とｐＨがＢ３のレベル(Ｌｉ濃度：０.７２１mol／Ｌ，ｐＨ：３.６）で一定であるよりも、グラジェントに上昇させた方（Ｌｉ濃度：０.４４１mol／Ｌ→１.００mol／Ｌ，ｐＨ：３.６６→４.１）が良いことを示す。
【００４０】図１０は、上記図９の場合から観点を変えて、９２分〜１１７分でＢ２〜Ｂ４の３液グラジェントにした場合（Ａ）と、Ｂ３とＢ４の２液グラジェントにした場合（Ｂ）の状態を示す。図１０から、２液グラジェント（Ｂ）よりも３液グラジェント（Ａ）の方がＡＳＡ−Ａｎｈｙ１とＥＯＨＮＨ2 の分離が良くなることが分かる。同時にＴｒｐとＮＨ3の分離も良くなる。これは、リチウムイオン濃度とｐＨの観点で見ると、（Ｂ）Ｌｉ濃度：０.７２１mol／Ｌ→１.００mol／Ｌ，ｐＨ：３.６→４.１よりも、（Ａ）Ｌｉ濃度：０.４４１mol／Ｌ→１.００mol／Ｌ，ｐＨ：３.６６→４.１のグラジェントの方が好ましいといえる。
【００４１】したがって、上記図９の検討も合わせて考慮すると、γ−ＡＢＡ〜Ｌｙｓあたりにおいては、Ｂ２〜Ｂ４の３液グラジェントにする方法が最も良い分離バランスを得られることが分かる。本発明の分析プログラムでは、この結果を基に、９２分〜１１７分までをＢ２〜Ｂ４の３液グラジェントとするようにしている。
【００４２】図１１は、４５分から始まるＢ３のグラジェント勾配による分離改善の様子を示したものである。グラジェント勾配を２５％（Ａ）から１０％（Ｃ）まで低くすると、Ｐｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離のバランスが良くなることが分かる。ここで、リチウムイオン濃度の変化を観ると、(Ｃ）が０.１２３→０.２７７mol／Ｌ、（Ｂ）が０.１２３→０.２８０mol／Ｌ、（Ａ）が０.１２３→０.３１６mol／Ｌである。結果は、（Ｂ）の状態では各ピークが何とか分離しているが、(Ａ)の状態ではまだ分離しきれていない。このことから、リチウムイオン濃度が０.３０mol／Ｌ 以上であるとＰｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離バランスが悪く不適切といえる。従って、本発明の分析プログラムにおいては、（Ａ）の状態を目標にし、Ｂ３については、４５分から８４分にかけて、１０％のグラジェント勾配を有するように設定している。また、９２分まで、８４分時点の組成を変化させない様にしている。
【００４３】図１２は、緩衝液Ｂ４のグラジェント開始時間を８６分〜９０分で変化させた場合の様子を示す。図１２に示されるように、緩衝液Ｂ４のグラジェント開始時間を遅くすると、γ−ＡＢＡとＨｃｙｓが分離し、同時にＥＯＨＮＨ2 とＴｒｐの分離が改善されることが分かる。従って、本発明の分析プログラムでは、９２分からＢ４を切替えるようにしている。
【００４４】図１３は、１１７〜１３０分におけるＢ２とＢ４の混合比について検討したものである。図から分かるように、Ｂ４の比率を８０％から７５％に低くすると、ＡｎｓとＣａｒの分離が改善されることが分かる。リチウムイオン濃度とｐＨで観ると、Ｂ４比率８０％では、Ｌｉ濃度：０.８５１mol／Ｌ，ｐＨ：４.０２ であり、Ｂ４比率７５％では、Ｌｉ濃度：０.８１４mol／Ｌ、ｐＨ：４.００ である。よって、本発明の分析プログラムでは、１１７〜１３０分のＢ２とＢ４の混合比を１：３（Ｂ４比率７５％）とするようにしている。
【００４５】図１４は、Ｂ４を１００％の状態に切替える開始時刻を１２８分から１３５分に遅らせた場合について検討したものである。切替える時刻を遅くすると、AnsとＣａｒの分離がよくなるが、Ａｒｇの溶出時間が遅くなることを示している。したがって、本発明の分析プログラムでは、バランスを考慮して、Ｂ４を１００％の状態に切替える開始時刻を１３０分からとしている。
【００４６】上記は緩衝液の組成について検討したものであるが、カラム温度についての検討も行ったので図１５〜図１７に示す。尚、カラム温度の変化をグラフ化したものを図１８に示す。図１８において、実線（Ａ）は、図３で示した本発明の分析プログラム、破線（Ｂ）は参考として示した図４の従来の分析プログラムである。
【００４７】図１５は、カラム温度によるＭｅｔ〜Ｃｙｓｔｈｉ間の分離改善を試みたものである。カラム温度を７０℃にする時間範囲を、分析プログラムにおいて４５分〜５０分の場合と、４５分〜５５分の場合で実験を行った。この結果、４５分〜５５分にすると、バランスの良い分離改善ができることが分かった。従って、本発明の分析プログラムでは、カラム温度を４５分〜５５分で７０℃とするようにしている。
【００４８】図１６は、カラム温度切替え開始時間の変更によるＰｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離改善を試みたものである。カラム温度を７０℃にする切替え開始時間を８０分から７０分に早めていくと、分離が改善されることが分かる。従って、本発明の分析プログラムにおいては、カラム温度７０℃の切替え開始時間を７３分で行うことを採用している。
【００４９】図１７は、８５分〜１１０分間で、カラム温度を７０℃〜６０℃の範囲で変化させた場合の様子を示す。カラム温度が下がると、ＥＯＨＮＨ2 とＴｒｐの分離が改善されることが分かる。従って、本発明の分析プログラムでは、８５分〜１１０分の時間帯においては、６３℃を採用している。
【００５０】以上、図９−図１７に示した部分分離改善を組合わせることにより、図３及び図５（Ａ）に示す本発明の分析プログラムが求められ、図１（Ａ）の分離結果が実現する。
【００５１】上記本発明の分析プログラムにおいては、複数の緩衝液を混合し、且つカラム温度を調整しているが、５３成分のピークを上手く分離できた要因としては、前述したように、「Ｌｉイオン濃度の強さ」「ｐＨの強さ」「カラム温度」が大きな要因である。そこで、図７，図８に分析プログラムに沿ったＬｉイオン濃度とｐＨの変化の様子を示す。
【００５２】図７は、本発明と従来の分析プログラムにおけるＬｉイオン濃度の変化をグラフ化したものである。実線（Ａ）は図３に示す本発明の分析プログラム、破線（Ｂ）は図４の従来の分析プログラムに対応する。このグラフから分かるように、（Ａ）に示す本発明のプログラムは、（Ｂ）の従来のプログラムに比べて、Ｌｉイオン濃度の上昇が非常にゆっくりであり、且つ徐々に上昇するようになっている。
【００５３】また図８は、図７と同様に（Ａ）が本発明の図３の分析プログラム、（Ｂ）が図４の従来の分析プログラムに対応するものであり、ｐＨについての変化を測定しグラフ化したものである。本発明の分析プログラムにおいては、ｐＨもその上昇を大幅に抑えるようにしている。
【００５４】ここで、本発明の分析プログラムについて、図９−図１７に示した部分分離改善を基に、そのポイントを纏めると以下の様になる。１．γ−ＡＢＡ〜Ｌｙｓ間の分離バランスを改善するためには、Ｌｉ濃度を0.44mol／Ｌから１.００mol／Ｌに、ｐＨを３.６６から４.１ にグラジェントに上昇させる。本発明ではこれを３液グラジェントで実施する。また、この３液グラジェントを行う時間は、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、β−ＡｉＢＡからＨｙｌｙｓが溶出される時間（保持時間）で行うようにする。本発明の分析プログラムでは、８７分〜１０９分の間となる。２．Ｐｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離バランスを改善するためには、Ｌｉ濃度が０.３０mol／Ｌ以下となるようにグラジェントさせる。具体的には、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、ｖａｌからβ−ＡｉＢＡが溶出される時間（保持時間）で緩衝液Ｂ３のグラジェントの勾配を１０％に保ち、β−ＡｉＢＡ溶出時でＬｉ濃度が０.３０mol／Ｌ以下となるようにする。本発明の分析プログラムでは、４５分〜９２分間の動作となる。３．γ−ＡＢＡとＨｃｙｓ間の分離バランスを改善するためには、緩衝液Ｂ４のグラジェント開始時間を（分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、）β−ＡｉＢＡが溶出される時間（保持時間）からとする。本発明の分析プログラムでは、９２分からとなる。４．ＡｎｓとＡｒｇ間の分離バランスを改善するためには、Ｌｉ濃度を０.８１mol／Ｌ、ｐＨを４.００とする。本発明ではこれをＢ２とＢ４の混合（Ｂ４比率７５％）で実施する。また、このＬｉ濃度・ｐＨにする時間は、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、ＨｙｌｙｓからＨｉｓが溶出される時間(保持時間)で行うようにする。本発明の分析プログラムでは、１１７分〜１３０分の間となる。
【００５５】また、Ｈｉｓ溶出後（分析プログラム１３０分以降）は、緩衝液Ｂ４を１００％にし、Ｌｉ濃度を１.００mol／Ｌ、ｐＨを４.１とする。５．Ｍｅｔ〜Ｃｙｓｔｈｉ間の分離バランスを改善するために、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、ｖａｌからＨｃｉｔの溶出時間（分析プログラムで４５分〜５５分）中、カラム温度を７０℃に保つようにする。６．Ｐｈｅ〜β−ＡｉＢＡ間の分離バランスを改善するために、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、Ｔｙｒの溶出時間（分析プログラムで７３分）から、カラム温度を７０℃に切替える。７．ＥＯＨＮＨ2とＴｒｐの分離バランスを改善するために、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、Ｃｙｓ−ＨＣｙｓからＴｒｐの溶出時間（分析プログラムで８５分〜１１０分）中、カラム温度を６３℃に保つようにする。
【００５６】上記に示すように、５３成分全体の分離が可能となった要因としては数々のポイントが上げられるが、代表的なものとして、Ｌｉイオン濃度、ｐＨについて、少なくともβ−ＡｉＢＡの溶出時間まで低いレベルに抑えたことが挙げられる。これにより、最もピークが密集した部分の分離バランスが大きく改善している。
【００５７】本発明の分析プログラムを採用したことによる効果を纏めると以下の様になる。
１）緩衝液切替え時間の適正化によって、５３成分を同時に分析した場合でも各成分のピークがバランス良く分離でき、且つ、分析時間も１４８分に抑えることができた。
２）緩衝液の処方に手を加えることなく、従来と同じ緩衝液をそのまま活用することができた。
３）分析装置のハードウエアや、分離カラムを変更することなく、分析プログラムのみの改善によって、５３成分の分離が実現した。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、臨床分野において重要な５３成分の一斉同時分析が行える。これにより、臨床分野に好適なアミノ酸分析計を提供することができる。
【出願人】 【識別番号】０００００５１０８
【氏名又は名称】株式会社日立製作所
【出願日】 平成１２年９月１日（２０００．９．１）
【代理人】 【識別番号】１０００７５０９６
【弁理士】
【氏名又は名称】作田 康夫
【公開番号】 特開２００２−７１６６０（Ｐ２００２−７１６６０Ａ）
【公開日】 平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【出願番号】 特願２０００−２６９８６４（Ｐ２０００−２６９８６４）