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【発明の名称】 グラジェント液体クロマトグラム測定装置および測定方法
【発明者】 【氏名】磯部 稔

【氏名】宮路 敏彦

【氏名】工藤 憲一

【氏名】篠崎 美雄
【要約】 【課題】本発明の目的は検出精度を向上するために、μｌ／ｍｉｎオーダーで分析でき、再現性があり、精度の高いグラジェントが得られ、廉価で操作が容易な、流量を変化させても精度の高い測定結果を得る事ができ、質量分析計を検出器として使用する際には目的成分の全量を質量分析計へ導入可能で、質量スペクトル測定を行う際は、測定に同期して流量、圧力、グラジェントの傾きの調整が行い得る装置、測定方法を提供することである。

【解決手段】前記目的を達成するために、本発明にかかるグラジェント液体クロマトグラム測定装置２は、送液用ポンプ４、６と、少なくとも１回の測定に用いられるグラジェント溶媒の全容量を収納可能なグラジェント溶媒充填管８を備える送液系１０と、試料注入機構１４と、分離カラム１６と、検出器１８とを備える分離検出系２０からることを特徴とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 グラジェント溶媒を用いてクロマトグラムを測定することが可能な装置であって、前記装置は、異なる複数の溶媒の混合量を変化させて作成されるグラジェント溶媒を作成するために、前記複数の溶媒各１種の送液量を調整しながら送液するための少なくとも各溶媒１種につき１つずつ備えられた複数の送液用ポンプと、前記送液用ポンプから送液されて混合されることによって作成された少なくとも１回の測定に用いられるグラジェント溶媒の全容量を収納可能なグラジェント溶媒充填管を備える送液系と、試料を分離するための分離カラムと、前記分離カラムに試料を注入するための試料注入機構と、前記分離カラムによって分離された成分を検出するための検出器とを備える分離検出系からなることを特徴とするグラジェント液体クロマトグラム測定装置。
【請求項２】 請求項１に記載のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、該送液ポンプは送液量を変更可能であり、試料の検出精度向上のために前記送液ポンプの送液量を変更する際、一時的に前記ポンプを流路から切り離して、前記送液ポンプにより送液される溶媒の流量を変更し、かつ、前記変更後の流量で送液される溶媒の圧力を分離カラムにかかる圧力と略同じ圧力に調整した後、再び流路に接続するための流量・圧力調整機構を有することを特徴とするグラジェント液体クロマトグラム測定装置。
【請求項３】 請求項１乃至２のいずれかに記載のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、該送液系と該分離検出系は分割と接続の切り替えが可能であり、前記切り替えを行うための切り替えバルブを有し、前記分離検出系には分離カラムを平衡化するためのカラム平衡用ポンプを有することを特徴とするグラジェント液体クロマトグラム測定装置。
【請求項４】 請求項３に記載のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、該送液系と該分離検出系が分割された状態に調整し、前記送液系では複数の該送液ポンプの送液量を調整しながら前記送液された溶媒を混合してグラジェント溶媒を作成させ、作成された前記グラジェント溶媒をグラジェント溶媒充填管に充填させるグラジェント溶媒充填行程、該送液系と該分離検出系が分割された状態に調整し、前記分離検出系では該カラム平衡用ポンプによって前記分離検出系を平衡化する分離検出系平衡化行程、前記各行程の後、該送液系と該分離検出系を接続させ、前記送液ポンプによってグラジェント溶媒の最終組成比の溶媒を送液させ、該試料注入機構によって前記分離カラムに試料を注入して該分離カラムで前記試料の成分を分離する試料分離行程、前記試料分離行程の後、該検出器で前記試料の成分の検出が開始された際に前記送液ポンプの送液量を適切な送液量に変更して成分の検出を行う検出行程、からなる各行程を、装置各部を自動制御して一括してコントロールしながらシーケンシャルに行うコントローラーを備えることを特徴とするグラジェント液体クロマトグラム測定装置。
【請求項５】 請求項１乃至４のいずれかに記載のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、分離された成分を検出するための検出器として質量分析計が用いられており、該分離カラムによって分離された成分の全量が前記質量分析計に導入されるように構成されていることを特徴とするグラジェント液体クロマトグラム測定装置。
【請求項６】 請求項５に記載の質量分析計を用いたグラジェント液体クロマトグラム測定装置を用いた測定方法であって、該送液系と該分離検出系が分割された状態で、前記送液系では複数の該送液ポンプの送液量を調整しながら前記送液された溶媒を混合してグラジェント溶媒が作成され、作成された前記グラジェント溶媒をグラジェント溶媒充填管に充填を行うグラジェント溶媒充填行程と、該送液系と該分離検出系が分割された状態で、前記分離検出系では該カラム平衡用ポンプによって前記分離検出系を平衡化する分離検出系平衡化行程と、前記各行程の後、該送液系と該分離検出系を接続し、前記送液ポンプによってグラジェント溶媒の最終組成比の溶媒を送液し、該試料注入機構によって前記分離カラムに試料を注入して該分離カラムで前記試料の成分を分離する試料分離行程と、前記試料分離行程の後、該質量分析計で前記試料の目的成分の検出が開始された際に前記送液ポンプの送液量を１０μｌ／ｍｉｎ以下の範囲に変更して成分の検出を行う検出行程と、からなる各行程によって測定を行うことを特徴とする測定方法。
【請求項７】 請求項６に記載の測定方法を用いて、質量分析計によって該試料の分離成分から質量スペクトルを測定することを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は液体クロマトグラム測定装置、特に迅速で、かつ精度の高い測定が行い得る液体クロマトグラム測定装置の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば、タンパク、ペプチドなどは、あらかじめこれらをいくつかの部位(フラグメント)に切断した後、カラムでこれらのフラグメントを分離し、ピークとしてＵＶ検出器などを用いて検出していた。さらに、これらのフラグメントの分子量や構造、アミノ酸配列を同定するために、質量分析計で特定の分子量のピークとして検出したり、このピーク検出時に質量スペクトルを測定することがあった。このようなフラグメントを分離、溶出するためには、移動相の組成を時間的に変化させて溶出するグラジェント溶出が用いられている。
【０００３】また一般的に前記タンパクやペプチドなどの試料は微量であり、かつ濃度の低いことが多いが、前記従来技術のような一般的な高圧液体クロマトグラフシステムでは流量を１.０ｍｌ／ｍｉｎ程度で送液し、カラムとして内径４.６ｍｍ程度のものが用いられていたが、この高圧液体クロマトグラフシステムで分析を行うには、サンプル量の不足や、検出感度の不足が問題となってしまっていた。
【０００４】従って、微量の試料の分析に対応し、検出感度を上昇させるため、高圧液体クロマトグラフシステムのスケールをダウンサイズしたミクロ高圧液体クロマトグラフシステムを用いていた。従来用いられていたミクロ高圧液体クロマトグラフシステムにおいて、グラジェント溶出法が可能な装置としては、流量が５０〜１００μｌ／ｍｉｎで送液し、カラムとしては内径０.５〜２.０ｍｍのものが一般的であった。
【０００５】また、グラジェント溶媒を使用してクロマトグラムの測定を行い得る装置に関する技術としては特公昭５２−８０８７６号公報や、特公昭５４−２０１５７号公報などに記載された技術が存在した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記特公昭５２−８０８７６号公報に記載された技術はグラジェント溶媒を作成するのに別の装置を用いて溶媒の濃度を変化させるか、或いは測定者があらかじめグラジェント溶媒を作成しておく必要があった。またグラジェント溶液を作成するポンプに低圧ポンプを使用し、測定時には高圧ポンプを使用するため、測定時にグラジェント溶媒の圧力に変化が生じてしまうものであった。また特公昭５４−２０１５７号公報に記載された技術はグラジェント溶媒を作成したのち、連続した操作で測定を行うことが困難であった。そのためグラジェント溶媒の作成から試料の分離、分離成分の検出までを一連の動作としてグラジェント溶媒の精度を落とさずに測定を行い得る測定装置の開発が待たれていた。
【０００７】さらに従来の技術では、測定時間を短縮するためにカラムで試料の分離を行う際には比較的速いスピードで送液を行い、成分を検出器によって検出する行程では送液の速度が遅くして検出精度を高いものとするという手段がとられていたが、成分の検出の際に送液スピードを変化させると、それに伴ってカラムにかかる圧力が変化してしまい、測定結果の精度に影響が出てしまっていた。しかし従来では送液スピードを変化させた際に圧力を調整し得る装置は存在しなかった。
【０００８】またグラジェント溶出では２溶媒グラジェントの場合、２つのポンプを用いてそれぞれのポンプの流量比で溶媒組成を作成する方法が一般的に用いられている。この場合、例えば１：９９の組成比の場合、１％の組成比となるポンプについては、少なくとも設定トータル流量の１／１００で正確な送液ができるようなポンプでなければ、正確な組成比を得ることができないことは言うまでもないが、例えば質量分析計に全量導入できるような流量でのグラジェントを行う場合、数μｌ／ｍｉｎから１０μｌ／ｍｉｎの１／１００の割合である０．１μｌ／ｍｉｎ〜０．０１μｌ／ｍｉｎ前後の流量精度を持つポンプが必要とされる。しかしμｌ／ｍｉｎオーダーで送液できるポンプは比較的容易に手にいれることができるものの、グラジェント溶出のために、０．１μｌ／ｍｉｎ〜０．０１μｌ／ｍｉｎ前後の流量精度を持ち、グラジェント溶出を行うことが可能なポンプは多くなく、かつ大変高価である上、μｌ／ｍｉｎオーダーで送液するためのポンプ操作にも大きな注意が必要であった。
【０００９】このため、比較的容易に手に入れることができる従来のミクロ高圧液体クロマトグラフシステムに用いられたポンプであっても容易な操作で、再現性があり、正確なグラジェントを得ることができるようなグラジェントの作成、送液ができる装置が望まれていた。
【００１０】また、質量分析計で検出を行う場合、質量分析計に導入できる溶媒の量としては１０μｌ／ｍｉｎ前後であり、さらにタンパク、ペプチドの分析によく用いられる飛行時間型質量分析計の場合は少なくとも５μｌ／ｍｉｎ以下の流量でないと適切な検出ができないものであった。このため従来の高圧液体クロマトグラム測定装置では、質量分析計に溶出液を導入する場合、カラムから溶出した後に流路を２つに分割し、２つの流路にかかる圧力差によって流量を調節して、適切な流量に調整された流路を質量分析計に接続し、導入する方法が一般的に用いられている。ところがこの方法では流路が分割されることにより溶出される目的成分も分割され、結果として濃度も分割比と同じように小さくなり、検出器による検出感度が低下してしまうものであった。特に、低流量で導入する飛行時間型質量分析計の場合はより大きな分割が必要となり、結果的に検出器による検出感度の低下が非常に大きくなってしまっていた。またグラジェント溶出の場合、溶媒の組成比が変化すると、圧力も変化してしまうため、流路で分割される分割比も変化してしまう。このため質量分析計に導入される流量も変化してしまうこととなる。
【００１１】このことからグラジェント溶出のときであっても一定流量で質量分析計へ導入し、さらに検出器による感度低下をなくすためにカラムにより溶出される目的成分の全量を質量分析計に導入し得る装置が望まれた。すなわち、質量分析計に全量を導入できるような流量で送液が可能、グラジェント溶出が可能、分離検出が可能というようなミクロ高圧液体クロマトグラフシステムが望まれていた。
【００１２】また質量分析計で質量スペクトルを測定する場合、さらにはタンデム質量分析計でＭＳ／ＭＳスペクトルを測定する場合、スペクトルの感度を上げるためにはスペクトル測定の積算回数を多くして測定を行う必要があった。しかし積算回数を多くすると測定に時間を要するため、質量スペクトルを測定するのに適切な流量であっても測定している間に目的成分ピークが通りすぎてしまうことがあった。このように目的成分が通りすぎてしまうため適切なスペクトルが測定されず、必ずしも感度上昇にはならなかった。そこで確実に感度上昇を達成するためにはスペクトル測定中に流量を小さくし、なるべく目的成分のピークが通過しないようにする必要があるが、送液を停止してしまうと質量分析計への試料の供給が停止するため測定することが不可能となる。そこで目的成分のピークが通過しないような流量で送液を行い、送液を停止しないで感度上昇を達成し得る装置の開発が望まれた。
【００１３】また質量分析計で計測を行いながら流量を小さくする場合では、例えば流量５μｌ／ｍｉｎから１μｌ／ｍｉｎに変更する場合を考えると、ただ単に流量を変更しただけでは、流量変更前にカラムや接続している配管等にかかっていた圧力から、変更された流量でかかることとなる圧力となるまでに、これらの圧力差から溶媒が流れてしまい、ピークが流出してしまう可能性がある。このため、流量を変更する場合、瞬時に変更後にかかると思われる圧力付近に変化させることが必要であった。さらに前記ＭＳスペクトルを測定するタイミングにあわせて、流量の変更と圧力の調節が必要であり、かつスペクトル測定後は元の条件に戻す必要もある。これら流量の変更、圧力調節の一連の操作を、シーケンシャルに操作する必要があるが、従来ではそれぞれの操作をオペレーターが行われなければならず、操作への注意と熟練が必要とされていた。
【００１４】さらに流量を変更した際に、分離のパターンが変化しないようにするため、送液流量あたりに変化するグラジェント量（グラジェントの傾き）が、流量変更後であっても変更前の傾きと同じような割合になるようにしなければならない。一般的に従来使用されているミクロ高圧液体クロマトグラフシステムのグラジェント方法では、時間あたりに変化させる組成比を設定することによってポンプの送液量を調節してグラジェントが実行されていた。この場合、グラジェントの途中で流量を変更すると、容量あたりのグラジェントの傾きが変わってしまい、その結果、得られるクロマトグラムのパターンも変化してしまっていた。よって前記ＭＳスペクトルを測定するために流量変更した場合であってもグラジェントの傾きは変化しないように調整する必要がある。
【００１５】このようにスペクトル測定開始の信号を受けて流量変更と圧力調整を行い、スペクトル測定が終了したら元の流量に戻すようなコントローラを備え、ランダムなＭＳスペクトルのタイミングにあわせていつでもスペクトル測定と同期して、流量、圧力を変更できかつグラジェントの傾きは変化させないような装置が必要であった。
【００１６】以上のように溶出される目的成分の検出精度の向上ために、μｌ／ｍｉｎオーダーで分析することができるミクロ高圧液体クロマトグラフシステムが必要とされており、このような装置は容易に操作でき、かつ、再現性があり、精度のあるグラジェントを得ることができることも必要とされていた。そして質量分析計を検出器として使用する際には目的成分の全量を質量分析計へ導入し得る、廉価で簡単なシステムでの実現が望まれていたが、このような装置は従来存在しなかった。また質量分析計で質量スペクトル測定を行うとき、そのタイミングに同期して流量、圧力、グラジェントの傾きの調整を行うことができる装置も存在しなかった。
【００１７】本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は溶出される目的成分の検出精度を向上するために、μｌ／ｍｉｎオーダーで分析できること、前記分析は再現性があり、かつ、精度の高いグラジェントを得る事ができること、廉価で操作が容易であること、流量を変化させても精度の高い測定結果を得る事ができること、質量分析計を検出器として使用する際には目的成分の全量を質量分析計へ導入可能であること、及び質量スペクトル測定を行うときはそのタイミングに同期して流量、圧力、グラジェントの傾きの調整が行うことができるグラジェント液体クロマトグラム測定装置、および測定方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するために、本発明にかかるグラジェント液体クロマトグラム測定装置は、グラジェント溶媒を用いてクロマトグラムを測定することが可能な装置であって、前記装置は、異なる複数の溶媒の混合量を変化させて作成されるグラジェント溶媒を作成するために、前記複数の溶媒各１種の送液量を調整しながら送液するための少なくとも各溶媒１種につき１つずつ備えられた複数の送液用ポンプと、前記送液用ポンプから送液されて混合されることによって作成された少なくとも１回の測定に用いられるグラジェント溶媒の全容量を収納可能なグラジェント溶媒充填管を備える送液系と、試料を分離するための分離カラムと、前記分離カラムに試料を注入するための試料注入機構と、前記分離カラムによって分離された成分を検出するための検出器とを備える分離検出系からなることを特徴とする。
【００１９】また本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、該送液ポンプは送液量を変更可能であり、試料の検出精度向上のために前記送液ポンプの送液量を変更する際、一時的に前記ポンプを流路から切り離して、前記送液ポンプにより送液される溶媒の流量を変更し、かつ、前記変更後の流量で送液される溶媒の圧力を分離カラムにかかる圧力と略同じ圧力に調整した後、再び流路に接続するための流量・圧力調整機構を有することが好適である。
【００２０】また本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、該送液系と該分離検出系は分割と接続の切り替えが可能であり、前記切り替えを行うための切り替えバルブを有し、前記分離検出系には分離カラムを平衡化するためのカラム平衡用ポンプを有することが好適である。
【００２１】また本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、該送液系と該分離検出系が分割された状態に調整し、前記送液系では複数の該送液ポンプの送液量を調整しながら前記送液された溶媒を混合してグラジェント溶媒を作成させ、作成された前記グラジェント溶媒をグラジェント溶媒充填管に充填させるグラジェント溶媒充填行程、該送液系と該分離検出系が分割された状態に調整し、前記分離検出系では該カラム平衡用ポンプによって前記分離検出系を平衡化する分離検出系平衡化行程、前記各行程の後、該送液系と該分離検出系を接続させ、前記送液ポンプによってグラジェント溶媒の最終組成比の溶媒を送液させ、該試料注入機構によって前記分離カラムに試料を注入して該分離カラムで前記試料の成分を分離する試料分離行程、前記試料分離行程の後、該検出器で前記試料の成分の検出が開始された際に前記送液ポンプの送液量を適切な送液量に変更して成分の検出を行う検出行程からなる各行程を、装置各部を自動制御して一括してコントロールしながらシーケンシャルに行うコントローラーを備えることが好適である。
【００２２】また本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、分離された成分を検出するための検出器として質量分析計が用いられており、該分離カラムによって分離された成分の全量が前記質量分析計に導入されるように構成されていることが好適である。
【００２３】また本発明における測定方法は、前記質量分析計を用いたグラジェント液体クロマトグラム測定装置を用いた測定方法であって、該送液系と該分離検出系が分割された状態で、前記送液系では複数の該送液ポンプの送液量を調整しながら前記送液された溶媒を混合してグラジェント溶媒が作成され、作成された前記グラジェント溶媒をグラジェント溶媒充填管に充填を行うグラジェント溶媒充填行程と、該送液系と該分離検出系が分割された状態で、前記分離検出系では該カラム平衡用ポンプによって前記分離検出系を平衡化する分離検出系平衡化行程と、前記各行程の後、該送液系と該分離検出系を接続し、前記送液ポンプによってグラジェント溶媒の最終組成比の溶媒を送液し、該試料注入機構によって前記分離カラムに試料を注入して該分離カラムで前記試料の成分を分離する試料分離行程と、前記試料分離行程の後、該質量分析計で前記試料の目的成分の検出が開始された際に前記送液ポンプの送液量を１０μｌ／ｍｉｎ以下の範囲に変更して成分の検出を行う検出行程とからなる各行程によって測定を行うことを特徴とする。また本発明の測定方法を用いて、質量分析計によって該試料の分離成分から質量スペクトルを測定することが好適である。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施形態を用いて本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置を詳しく説明する。
【００２５】図１に本発明におけるグラジェント液体クロマトグラム測定装置の概略構成図を示す。同図に示すように本発明におけるグラジェント液体クロマトグラム測定装置２は、グラジェント溶媒を用いてクロマトグラムを測定することが可能な装置であって、前記装置２は、異なる複数の溶媒Ａ、Ｂの混合量を変化させて作成されるグラジェント溶媒を作成するために、前記複数の溶媒Ａ、Ｂ各１種の送液量を調整しながら送液するための少なくとも各溶媒１種につき１つずつ備えられた複数の送液用ポンプ４、６と、前記送液用ポンプ４、６から送液されて混合されることによって作成された少なくとも１回の測定に用いられるグラジェント溶媒の全容量を収納可能なグラジェント溶媒充填管８を備える送液系１０と、前記グラジェント溶媒の初期組成比と同じ組成比の溶媒を送液するためのカラム平衡用ポンプ１２と、試料を分離するための分離カラム１６と、前記分離カラム１６に試料を注入するための試料注入機構１４と、前記分離カラム１６によって分離された成分を検出するための検出器として質量分析計１８とを備える分離検出系２０からなっている。そして前記分離カラム１６によって分離された成分の全量が質量分析計１８に導入されるように構成されている。
【００２６】ポンプ４とポンプ６はグラジェント溶媒を作成するとき、および、試料を分析するときにカラム１６に送液するために用いられるポンプである。本実施形態ではこのポンプ４によって溶媒Ａが送液され、ポンプ６によって溶媒Ｂが送液されるように構成されており、両ポンプの流量比を変化させることによりグラジェント溶媒が作成される。ポンプ４、６によって送液された各溶媒Ａ、Ｂは配管を通り、ミキサー２２によって混合され、バルブ２４、２６を経てグラジェント溶媒充填管８に充填される。グラジェント溶媒充填管８の容量はあらかじめ決められており、少なくとも１回の測定に必要なグラジェント溶媒をポンプ４、６によって作成し、それら全てがグラジェント溶媒充填管８に充填されるのである。
【００２７】背圧チューブ３０はグラジェント溶媒作成時に、試料分析時と同じ程度の圧力がかかるようにするために接続されている。この背圧チューブ３０によってグラジェント溶媒充填管８に充填されたグラジェント溶媒に試料分析時と同じ程度の圧力がかかってグラジェント溶媒充填管８に充填されることとなる。背圧チューブ３０に接続されているシリンジ３４はグラジェント溶媒作成時に流量を測定するために接続されており、流量の測定を行わないときにはシリンジ３４は接続せず、この部分より出てくる溶媒は廃液する。
【００２８】ポンプ１２は測定初期におけるグラジェント溶媒と同じ組成比の溶媒を送液するように構成されており、ポンプ４、６によってグラジェント溶媒が作成され、グラジェント溶媒充填管８に充填する間に分離カラムに測定初期におけるグラジェント溶媒と同じ組成比の溶媒を送液し続け、分離カラムの平衡化を行うために用いられる。本実施形態ではグラジェント溶媒として測定初期には溶媒Ａ１００％であり、次第に溶媒Ｂの濃度が高くなり、最終的に溶媒Ｂ１００％となるようなグラジェント溶媒を用いることとしたため、ポンプ１２によって送液される溶媒は溶媒Ａとなっている。このポンプ１２は測定中は必要がなくなるため測定においては流路系から分離できるように構成されている。
【００２９】バルブ２６、２８は２連６方バルブであり、グラジェント溶媒充填管８の前後に接続されている。そしてこれらの両方、もしくは一方を切り換えることによって、送液系１０と分離検出系２０の分割、接続を行うことができる。このためポンプ４、６によって作成、送液されたグラジェント溶媒のグラジェント溶媒充填管８への充填、またはグラジェント溶媒をカラム１６へ送液するための流路の切り替えを行うことが可能である。なお、このように送液系１０と分離検出系２０の分割、接続が行い得るものであればここで使用した２連６方バルブのみに限られるものではない。
【００３０】試料は、バルブ２８と分離カラム１６の間に取り付けられたインジェクタ等からなる試料注入機構１４によりカラムに導入される。このような試料注入機構１４としては従来周知のものを適用することが可能である。即ち、インジェクタや、試料の濃縮などの前処理を行う場合には、このためのバルブ、および装置等を用いることができるため、その目的に合わせて好適なものを使用するのがよい。
【００３１】分離カラム１６の後ろにはＨＰＬＣ検出器３２と質量分析計１８が接続されており、この検出器によって分離成分の分析を行うことが可能である。そして本実施形態では分離カラムの後ろに接続される検出器のフローセル部分はカラム１６から分離、溶出した試料のピークが下流に接続された質量分析計１８に導入されるときにピークが広がらないように細いチューブでできている。なお、このような細いチューブを用いなくともピークが広がらないように構成されていればよく、このフローセル部分に関する限定は特に無い。
【００３２】なおここに示したように、必ずしも質量検出計とＨＰＬＣ検出器の２つを用いる必要性はないが、本発明のように質量検出計とともにＵＶ検出器などの一般に液体クロマトグラフに用いられる検出器を用いてもよいし、質量分析計の変わりにこれらを用いることも可能である。
【００３３】バルブ２４は２連３方バルブであり、質量分析計１８でスペクトル測定を行う際に、このバルブのポートｂとｃが接続されるように所定時間切り替えて圧力を開放することができる。このときの開放圧力はバルブ２４のポートｃに接続された背圧チューブ３６により調整可能であり、ポートを切り替えて圧力調整を行いながらポンプ４、６の流量調整を行うことができる。このように本実施形態におけるグラジェント液体クロマトグラム測定装置ではポンプ４、６、バルブ２４、背圧チューブ３６よりなる流量・圧力調整機構３８を有している。
【００３４】本発明の装置は、このようにあらかじめ測定に用いられるグラジェント溶媒全量を作成し、それをグラジェント溶媒充填管に充填しておくことによって、一般的なＨＰＬＣポンプを用いて精度の高いグラジェント溶媒が作成することができ、かつ再現性を高めることが可能となる。さらに送液ポンプ４、６によって流量を変化させた場合であってもグラジェント溶液の傾きが変化してしまうことをなくすことができるとともに、圧力の変化を極力抑えることができるため、測定精度に影響を与え難い。またグラジェント溶媒に注入された試料を分離後、その全量を質量分析計に導入するため、質量分析計を検出器として用いたときに検出感度の向上を実現することが可能となる。また、一般的なＨＰＬＣポンプを用いるため、操作も容易であり、価格も廉価とすることができる。
【００３５】また一般的なＨＰＬＣポンプからなる送液ポンプ４、６は測定時における微小な流量であると送液量の正確さが落ちてしまう。しかしこのようにあらかじめグラジェント溶媒を作成し、グラジェント溶媒充填管に充填しておく構成であると、グラジェント溶媒作成時には正確な送液量が十分確保できる流量で作成することが可能である。
【００３６】なお図１に示したポンプ４、６、１２、バルブ２４、２６、２８、質量分析計１８、ＨＰＬＣ検出器３２、インジェクタ１４は、図２に示すようにコントローラ４０と接続されており、コントローラによって一括制御できるとともに検出器による検出信号を受信するように構成されている。以下、本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置を用いて実際に測定を行った際にどのように測定を行うのかを説明しながら、本発明をさらに詳しく説明する。
【００３７】本発明ではいくつかの行程によって測定が行われる。即ち、該送液系と該分離検出系が分割された状態で、前記送液系では複数の該送液ポンプの送液量を調整しながら前記送液された溶媒を混合してグラジェント溶媒が作成され、作成された前記グラジェント溶媒をグラジェント溶媒充填管に充填を行うグラジェント溶媒充填行程、該送液系と該分離検出系が分割された状態で、前記分離検出系では該カラム平衡用ポンプによって前記分離検出系を平衡化する分離検出系平衡化行程、前記各行程の後、該送液系と該分離検出系を接続し、前記送液ポンプによってグラジェント溶媒の最終組成比の溶媒を作成しながら送液し、該試料注入機構によって前記分離カラムに試料を注入して該分離カラムで前記試料の成分を分離する試料分離行程、前記分離行程の後、該検出器で前記試料の成分の検出が開始された際に前記送液ポンプの送液量を適切な送液量に変更して成分の検出を行う検出行程からなる各行程によって測定が行われる。
【００３８】図１に記載した本発明の一実施形態で、グラジェント溶媒充填行程、分離検出系平衡化行程を行っている動作説明図を図３に示す。なお同図において図１と同じ構成要素に対応する部分には同一の符号を付して説明を省略する。図３に示すように、グラジェント溶媒充填行程、分離検出系平衡化行程ではバルブ２６はポートａとｆ、ｂとｃ、ｄとｅを接続し、バルブ２８はポートａとｂ、ｃとｄ、ｅとｆを接続する。このような接続によってバルブ２８によって送液系と分離検出系は分割された状態となっている。
【００３９】このとき送液系は、ポンプ４、６によって送液された溶媒が、ミキサー２２部分で合流し、ここで均一に混合された後、バルブ２４のポートｂからａを通り、さらにバルブ２６のポートａからｆを経て、グラジェント溶媒充填管８に送液される。そしてこのグラジェント溶媒充填管８の出口はバルブ２６のポートｅからｄを通り、背圧チューブ３０を経て、流量測定用のシリンジ３４に送液されるか、シリンジ３４を用いないときは廃液されるような流路に設定されている。
【００４０】グラジェント溶媒充填行程では、まずポンプ４、６によって、グラジェント溶媒充填管８の中を初期溶媒で置換洗浄する。そしてその後、グラジェント溶媒作成時には、トータル流量に対して、ポンプ４、６の送液量がグラジェント溶媒の組成比となるような流量で送液することによりグラジェント溶媒が作成される。例えばトータル流量４０μｌ／ｍｉｎで１００％Ａ溶媒から、１０分で直線的に１００％Ｂ溶媒に変化させてグラジェント溶媒を作成する場合は、ポンプ４によって送液を行い、溶媒Ａでグラジェント溶媒充填管８を置換、洗浄した後、ポンプ４は４０μｌ／ｍｉｎから１０分で０．０μｌ／ｍｉｎまで直線的に流量を変化させ、逆にポンプ６は０．０μｌ／ｍｉｎから１０分で４０μｌ／ｍｉｎまで直線的に流量を変化させることでグラジェント溶媒が作成されるのである。
【００４１】作成されたグラジェント溶媒は、その先頭がグラジェント溶媒充填管８のバルブ２６のポートｄに近いところに達するまでグラジェント溶液の最終組成溶媒で送液される。本実施形態において前述した例では最終組成溶媒は溶媒Ｂ１００％であるからポンプ６のみを稼動させ送液する。グラジェント溶媒充填行程はこのようにして行われるのである。
【００４２】なお、グラジェント溶媒の先頭がバルブ２６のポートｄに近いところに達するまでの時間はミキサー２２、バルブ２４、２６、グラジェント溶媒充填管８、およびこれらを接続する配管の内部容量の合計と、ポンプ４、６のトータル流量によって決められる。流量が同じであればその時間は一定であるので、流量から時間を目安にしてもよいし、背圧チューブ３０の先端にシリンジ３４を接続して廃液の容量を測定し、それによってグラジェント溶媒の先頭位置を割り出してもよい。このようなシリンジによる容量測定を行わないのであれば、背圧チューブ３０から流出する溶媒は廃液してよい。
【００４３】また、グラジェント溶媒充填管８の溶媒置換、洗浄時のポンプ４、６の流量は、時間短縮のために流路系の耐圧が許す限り、カラムに送液する流量よりかなり早い流量であってもかまわない。さらに、グラジェント溶媒作成時のポンプ４、６の流量も、グラジェント溶媒が正確に作成できるような流量でよく、カラムに送液する流量よりかなり早い流量でもかまわない。
【００４４】また背圧チューブ３０はグラジェント溶媒作成充填時に、分離カラムで試料を分析するときにかかる圧力と略同じ圧力となるように長さを調整しておくのが好適である。このように構成することにより、試料を測定するときに圧力の変化があまりないため、速やかにグラジェント溶媒が分離カラム１６に送液され、試料の分離が可能となる。
【００４５】なおここではポンプ４、６のトータル流量を４０μ／ｍｉｎと設定したが、グラジェント溶媒を作成し、充填する本行程ではこの流量に関しては特に限定は無い。このとき分離検出系において、ポンプ１２から送液された溶媒は、バルブ２８のポートｆからｅを通り、試料注入機構１４を経て、分離カラム１６に至り、その溶出液はＨＰＬＣ検出器３２および質量分析計１８へ導入されるような流路に設定されている。
【００４６】そして分離検出系平衡化行程では、ポンプ１２によって初期溶媒が送液されている。前述の例においては初期溶媒は溶媒Ａ１００％であるので溶媒Ａがポンプ１２によって送液される。この分離検出系平衡化行程では、ポンプ１２の流量は分離カラム１６の適切な流量で送液して各流路を平衡化するのである。なお、分離検出系平衡化行程は、グラジェント溶媒充填行程を行っている間に行うことが好適である。これによりグラジェント溶媒充填行程の終了とともに次の行程に移行することが可能となる。
【００４７】前記各行程が終了したら、装置の送液系と分離検出系を接続し、試料の分離を行う。図１に記載した本発明の一実施形態で、試料分離行程を行っている動作説明図を図４に示す。なお同図において図１と同じ構成要素に対応する部分には同一の符号を付して説明を省略する。
【００４８】図４に示すように、グラジェント溶媒充填行程および分離検出系平衡化行程が終了したら、バルブ２８のポートａとｆ、ｂとｃ、ｄとｅが接続するように切り替え、送液系と分離検出系を接続する。これによってポンプ４、６は引き続きグラジェント溶媒の最終組成比の溶媒を送液し続けているからグラジェント溶媒充填管８に充填されたグラジェント溶媒は分離検出系に送液されるようになる。バルブ２８の切り替えと同時に試料を試料注入機構１４によって注入し、試料の注入とともにＨＰＬＣ検出器３２、質量分析計１８の信号取り込みを開始させ、データ信号の取り込みを開始する。
【００４９】なお前述のように、この試料分離行程ではポンプ４、６の流量を使用する分離カラム１６の適切な流量であり、かつ質量分析計１８に全量導入できるような流量で送液されることが好適である。試料はグラジェント溶媒に溶解され、グラジェント溶媒とともに送液される。そして分離カラム１６によって分離されるのである。
【００５０】この試料分離行程でのポンプ１２の流路は、バルブ２８のポートｆからａを通り、短い接続配管を経て、バルブ２８のポートｂからｃを通った後、接続配管を経てバルブ２６のポートｅからｄを通って背圧チューブ３０を経て、シリンジ３４に接続されるか、または廃液されるようになっている。試料の測定を行っている間はポンプ１２によって送液されるグラジェント溶媒の初期組成比溶媒は直接分析に関係しないため、送液を停止してもよいが、接続されている配管の置換、洗浄のため、さらには試料の測定が終了した後に次の試料を測定するために分離カラム１６を再び平衡化する場合に、速やかに溶媒が流れるように、平衡化する時の流量で送液しておくことが望ましい。
【００５１】試料分離行程が終了し、質量分析計において試料分析中に目的成分のピークが検出されたら、測定は検出行程に移行する。検出行程では装置の流路系自体は図４に示したものと同じ構成で行うことができる。但し、送液ポンプ４、６によって送液されている最終組成比のグラジェント溶媒の流量を質量分析計の検出感度が向上されるように目的ピークの質量スペクトルを測定している間だけ、流量を小さくして成分検出、特に質量分析計による質量スペクトルの測定を行うのである。
【００５２】なお前述のようにポンプの流量を小さくすると送液量の正確さが落ちてしまうが、本発明の装置ではあらかじめ正確なグラジェント溶媒を作成しておき、グラジェント溶媒充填管に充填しておくことが可能であるため、測定時に送液量の正確さが落ちた流量で送液を行ったとしてもグラジェント溶液の正確さが保たれることとなる。
【００５３】この検出行程において本実施形態においては、送液ポンプ４、６によって送液されている最終組成比のグラジェント溶媒の流量を変更し、変更した後、直ちに変更流量での圧力が分離カラムかかる圧力と略同じとするために図１に記載した流量・圧力調整機構３８を使用する。
【００５４】図１に記載した本発明の一実施形態で、検出行程での流量・圧力調整機構の動作説明図を図５に示す。なお同図において図１と同じ構成要素に対応する部分には同一の符号を付して説明を省略する。
【００５５】目的成分が質量検出計で検出され、質量スペクトルを測定し始めたときに、流量・圧力調整機構３８を構成する図５に示すバルブ２４は、所定時間ポートｂとｃが接続される。これと同時にポンプ４および６の送液量を小さくし、流量を調整する。このときの流量は１０μｌ／ｍｉｎ以下、さらには１〜２μｌ／ｍｉｎ或いは、ポンプの最小流量に変更することが好適である。これより流量が大きいと質量スペクトルの測定感度の上昇が望めなくなってしまうためである。また所定時間とは目安として０．５〜３秒程度であることが好適である。これより長いとカラムの圧力が大きく変化してしまうためである。一般的には流量変更後の圧力と同じ圧力となるだけの時間でよい。
【００５６】バルブ２４に接続されている背圧チューブ３６は、バルブ２４を所定時間開放して、ポンプ４、６による流量変更し、再び所定流路に接続された際に、ポンプ４、６によって送液される溶媒の圧力が、分離カラムにかかる圧力と同じ程度になるように調整されている。
【００５７】このようにバルブ２４によって一時的にポンプが流路系から切り離された後に、ポンプの送液量が変更され、背圧チューブ３６によって分離カラム１６にかかる圧力と同じ程度の圧力に調整された後、再び所定流路に接続されるため、速やかに分離カラムに相当の圧力がかかり、流量の変更されたグラジェント溶媒が送液されるようになる。そして、質量分析計による質量スペクトルの測定が終了したら、ポンプ４、６の流量は元の分析流量に戻すのである。
【００５８】このような行程によって試料の分析を行うことにより、目的成分が質量分析計により検出され、スペクトル測定が行われるときであっても、目的成分のピークが通りすぎてしまうことなく質量分析計へ導入されるため、スペクトルスキャン回数を多くすることができ、検出感度の上昇を実現することができる。このため本発明の質量分析計を用いたグラジェント液体クロマトグラム測定装置において、質量分析計によって該試料の分離成分から質量スペクトルを測定することが好適である。
【００５９】また前述のように本発明の装置では流量・圧力調整機構を有すると、質量分析計で目的成分の測定を行う際に、測定に適した流量に変更を行っても、流量変更後の圧力をすばやくカラムにかかる圧力と略同じとすることができる。よって検出器として質量分析計を用いたものでなくとも、流量を小さくして検出を行い検出感度の向上を図ることが可能である。
【００６０】このようにして、試料の測定が終了した後に、さらに別の試料を測定する場合には、図３に示すような状態に流路を戻し、グラジェント溶媒充填管の置換、洗浄を行った後に、再び各行程繰り返すことによって測定を行うことができる。なお、本実施形態においてはバルブ２６は図３から図５に示す過程で切り替えを行わなかったが、このバルブ２６のポートａとｂ、ｃとｄ、ｅとｆを接続すると、ポンプ４、６からミキサー２２、バルブ２４を通り、バルブ２６のポートａからｂに接続され廃液されるような流路となる。このように接続することよってポンプ４、６、ミキサー２２、バルブ２４までを新しい溶媒で置換するときに流量を上げて短時間に置換作業を行うことができるようになる。
【００６１】また本実施形態のように該送液系と該分離検出系の分割と接続の切り替えを切り替えバルブによって行うことで簡単な操作で、かつ前記各行程を容易に行うことが出来るようになる。また本発明において、図１、図２に示したコントローラ４０によってポンプ４、６、１２、バルブ２４、２６、２８、質量分析計１８、ＨＰＬＣ検出器３２、および試料注入機構１４を一括して自動制御することによって、グラジェント溶媒充填行程、分離検出系平衡化行程、試料分離行程、検出行程の各行程における操作や作業を自動化することもできる。
【００６２】このように自動化すると操作が非常に簡単となり、かつ、質量分析計でスペクトル測定を行うときに、そのタイミングに同期して、グラジェントの傾きを一定にしたまま流量、圧力を変更することができる。
【００６３】なお本発明を説明するために本発明の一実施形態を用いて説明を行ったが、本発明はここに記載した装置のみに限られるものでは無い。例えば前記説明で例としてあげたグラジェント溶媒は初期組成比が溶媒Ａ１００％であり、最終組成比が溶媒Ｂ１００％であるため、ポンプ４、６の２つのみを用いたが、最終組成比溶媒が溶媒Ａ：溶媒Ｂが１：９９となるような片方のポンプの送液量が非常に小さくなる場合などにおいて、スペクトル測定の際に流量を小さくしたときに、ポンプの最小流量より小さい送液が必要とされることも考えられる。このような場合、あらかじめ最終組成比溶媒や初期組成比溶媒を作成しておき、最終組成比溶媒送液用ポンプや初期組成比溶媒送液用ポンプなどを備えておくと、流量を小さくしたときに、このポンプによって送液を行うことができ、スペクトル測定の際に流量を小さくしたときであっても、最終組成比を作成しながら送液を行うポンプの最小流量を下まわる送液量となるような事態を避けることができる。このように本発明は、必要に応じて適宜改良を加えて使用することが可能である。
【００６４】
【実施例】前述の図１に示した本発明の一実施形態において、コントローラによって各動作を自動制御するように構成された装置を用いて、実際に測定を行ってみることとした。
【００６５】実験１初めに、水１００％の溶媒と０．０１％アセトンを含むアセトニトリルを用いて、初期組成比が水１００％から１０分で最終組成比０．０１％アセトンを含むアセトニトリル１００％となるようなグラジェント溶媒を作成して、そのグラジェント溶媒が正しく作成されているかを調べた。図１に示すポンプ４によって水１００％溶媒をポンプ６によって０．０１％アセトンを含むアセトニトリルをトータル流量が４０μｌ／ｍｉｎとなるように送液し、水１００％から１０分で０．０１％アセトンを含むアセトニトリル１００％となるグラジェント溶媒を作成し、グラジェント溶媒充填管８に充填させた。グラジェント溶媒充填管８には容量４９０μｌのものを使用した。
【００６６】グラジェント溶媒の充填が完了したら、バルブ２８を切り替えて、送液系１０と分離検出系２０を接続し、送液量を５μｌ／ｍｉｎに変更して、ＨＰＬＣ検出器３２として用いたＵＶ検出器２６０ｎｍで検出を行い、ベースラインの変化を表したクロマトグラムを測定した。アセトンは２６０ｎｍ付近に吸収を持つため、アセトニトリル溶媒の比率が高くなるとベースラインが上昇してくる。ただし、水とアセトニトリル中の吸光係数が異なるため、比率を直線的に変化させた場合ベースラインは上に凸になるはずである。
【００６７】図６にグラジェント溶媒のベースラインの変化を検出したクロマトグラムを示す。同図に示すようにグラジェント溶媒のベースラインの変化を検出したクロマトグラムは、理論どおりに上に凸の曲線となるベースラインが得られている。このことからグラジェント溶媒はグラジェント溶媒充填管中に正しく作成され、充填されており、測定においても正しいグラジェントの傾きが保たれていることがわかる。
【００６８】実験２続いて、前記実験と同様の装置を用いて、実際にタンパクを分析してみた。溶媒としては溶媒Ａとしてテトラフルオロ酢酸を含む水を、溶媒Ｂとしてテトラフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを用いた。グラジェント溶媒充填行程では、ポンプ４、６によってグラジェント溶媒の初期組成比が溶媒Ａ１００％で、１０分で溶媒Ｂ１００％ととなる比率が直線的に変化するグラジェント溶媒をトータル流量４０μｌ／ｍｉｎで作成し、容量が４９０μｌのグラジェント溶媒充填管に充填した。
【００６９】分離検出系ではカラムとしてオクタデシルシランをシリカに修飾した充填剤を充填した内径０．３ｍｍ、長さ１５ｃｍの逆相カラムを使用した。そして前記グラジェント溶媒充填行程と平行して、ポンプ１２によって溶媒Ａを分離検出系に１０μｌ／ｍｉｎで送液し、分離検出系平衡化行程を行った。
【００７０】前記グラジェント溶媒充填行程と分離検出系平衡化行程を開始してから、あらかじめ設定されていた所定時間過ぎると、コントローラがグラジェント溶媒の先頭がバルブ２８の直前に来たものと判断し、バルブ２８を図４に示すような流路系に切り替え、同時にコントローラはポンプ４、６の流量を質量分析計に溶媒および分離された成分の全量が導入できる流量として５μｌ／ｍｉｎに変更した。そして試料を試料注入機構１４であるインジェクタによって注入し、ＨＰＬＣ検出器３２であるＵＶ検出器と質量検出計１８を作動させ、その検出信号を受信し、記録を開始して、試料分離行程に移行した。ＵＶ検出器は２１０ｎｍで検出するように設定した。
【００７１】しばらくすると逆相カラムで分離された試料のタンパクは各フラグメントに分離され、ＵＶ検出器で検出された。検出されたクロマトグラムを図７に示す。さらに、目的成分のピークが質量分析計で検出されると、コントローラは検出行程に移行し、図５に示したバルブ２４を所定時間背圧チューブ３６に接続するように切り替えて圧力を開放し、同時にポンプの流量を１μｌ／ｍｉｎに変更し、圧力を流量変更後にカラムにかかる圧力と同じ程度に調整して再び接続し、質量分析計１８でトータルイオンクロマトグラム、ＭＳ／ＭＳスペクトルの測定を行った。このとき得られたトータルイオンクロマトグラムを図８（ａ）に、また図８（ａ）において３．５６分のピーク（図８（ａ）において矢印で示したピーク）を図９（ａ）に示す。
【００７２】測定が終了したらコントローラはポンプの流量を元の５μｌ／ｍｉｎに戻して、実験を終了させた。図７に示した得られたクロマトグラムを参照すると、実際の試料を用いても良好なグラジェント溶出、および分離が達成されているのが確認できた。また、図８（ａ）および図９（ａ）に示す測定結果から、質量分析計による測定が良好に行われていることが確認できた。
【００７３】比較実験１前記実験２と同様の装置で同様の実験を行い、実験２において質量分析計で測定を行う際にも流量を変更せずに測定を行って、実験２で得られた結果と比較することとした。実験２と同様、試料としてはタンパクを、溶媒としては溶媒Ａとしてテトラフルオロ酢酸を含む水を、溶媒Ｂとしてテトラフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを用いた。
【００７４】グラジェント溶媒充填行程では、ポンプ４、６によってグラジェント溶媒の初期組成比が溶媒Ａ１００％で、１０分で溶媒Ｂ１００％ととなる比率が直線的に変化するグラジェント溶媒をトータル流量４０μｌ／ｍｉｎで作成し、容量が４９０μｌのグラジェント溶媒充填管に充填した。分離検出系ではカラムとしてオクタデシルシランをシリカに修飾した充填剤を充填した内径０．３ｍｍ、長さ１５ｃｍの逆相カラムを使用した。そして前記グラジェント溶媒充填行程と平行して、ポンプ１２によって溶媒Ａを分離検出系に１０μｌ／ｍｉｎで送液し、分離検出系平衡化行程を行った。
【００７５】前記グラジェント溶媒充填行程と分離検出系平衡化行程を開始してから、あらかじめ設定されていた所定時間過ぎると、コントローラがグラジェント溶媒の先頭がバルブ２８の直前に来たものと判断し、バルブ２８を図４に示すような流路系に切り替え、同時にコントローラはポンプ４、６の流量を質量分析計に溶媒および分離された成分の全量が導入できる流量として５μｌ／ｍｉｎに変更した。そして試料を試料注入機構１４であるインジェクタによって注入し、ＨＰＬＣ検出器３２であるＵＶ検出器と質量検出計１８を作動させ、その検出信号を受信し、記録を開始して、試料分離行程に移行した。ＵＶ検出器は２１０ｎｍで検出するように設定した。
【００７６】しばらくすると逆相カラムで分離された試料のタンパクは各フラグメントに分離され、ＵＶ検出器で検出された。検出されたクロマトグラムを図１０に示す。さらに、目的成分のピークが質量分析計で検出されると、コントローラは検出行程に移行したものの、流量の変更は行わずに、質量分析計１８でトータルイオンクロマトグラム、ＭＳ／ＭＳスペクトルの測定を行った。このとき得られたトータルイオンクロマトグラムを図８（ｂ）に、また図８（ｂ）において０．６５分のピーク（図８（ｂ）において矢印で示したピーク）を図９（ｂ）に示す。
【００７７】図７および図１０に示したクロマトグラムを比較すると、実験２ではスペクトル測定時にバルブ２４によって圧力の開放、および流量の変更を行うため、保持時間が長くなり、測定時のピーク形状は異なっているが、クロマトグラムのパターンはほとんど同じであり、スペクトル測定時に流量の変更や圧力の調整を行っても、それ以後の試料の分離、溶出、検出には影響はせず、良好な測定結果が得られることがわかる。
【００７８】さらに図８に示したトータルイオンクロマトグラムの矢印で示した同一の目的成分のＭＳ／ＭＳスペクトルを比較した図９では、実験２で得られた図９（ａ）の測定結果はＳ／Ｎ比で２倍感度上昇していることが確認できる。これによって、ピークが質量分析計で確認されたとき、圧力開放、および流量調整を行うことによって、ピーク時間を長く取ることができ、スペクトル測定の積算回数を多くして測定することができるため、流量の調整を行わない場合と比較して、検出感度の上昇が得られることがわかる。
【００７９】このように本発明の装置は、ＭＳ／ＭＳスペクトル測定時に、流量を小さくし、ピーク溶出を遅くすることで、スペクトル測定時間を多くとることができ、結果、スペクトルの感度を上昇することができる。しかも、本発明のようにグラジェント溶媒充填管にあらかじめグラジェント溶媒を作成し充填しておく方式では、単にポンプ流量を変える事で、同時にグラジェント変化率も変化するため、前述のように流量を変化させても簡単な方法で一定の変化率を持つグラジェント溶出が可能であり、また流量を元に戻した後でも、その後の分離、溶出に影響を与えることなく測定を行うことができる。
【００８０】以上説明したように、本発明の装置によれば、グラジェント溶媒の作成から試料の分離検出までの一連の操作を一つの装置によって行うことが可能であり、かつ、送液ポンプの流量の変更が測定結果に影響を与えない。また分離された目的成分の全量を質量分析計へ導入するために、μｌ／ｍｉｎオーダーで分析することができる。
【００８１】さらに再現性があり、かつ、精度のあるグラジェントを容易に得る事ができるグラジェント方法が可能であり、簡単なシステムおよび容易な操作でこのグラジェント分析を達成することができ、かつグラジェント方法を実行することができる。さらには質量分析計で、スペクトル測定を行うとき、そのタイミングに同期して、流量、圧力、グラジェントの傾きの変更を行い、測定の感動を上昇することができる。
【００８２】
【発明の効果】本発明のグラジェント液体クロマトグラム測定装置及び測定方法によれば、精度の高い測定を行うことができる。
【出願人】 【識別番号】０００２３２６８９
【氏名又は名称】日本分光株式会社
【出願日】 平成１２年８月２９日（２０００．８．２９）
【代理人】 【識別番号】１０００９２９０１
【弁理士】
【氏名又は名称】岩橋 祐司
【公開番号】 特開２００２−７１６５７（Ｐ２００２−７１６５７Ａ）
【公開日】 平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【出願番号】 特願２０００−２５９４４８（Ｐ２０００−２５９４４８）