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【発明の名称】 ＨＢＶ核酸配列の増幅法および検出方法
【発明者】 【氏名】ダニエル・ルイス・カシィアン

【氏名】ティモシー・ジェイ・フルツ
【要約】 【課題】ＨＢＶ核酸配列の増幅法、検出方法、および該増幅法に用いるキットを提供する。

【解決手段】増幅オリゴヌクレオチドを用いて自動触媒的にＨＢＶ核酸標的配列を増幅させ、ＨＢＶ核酸標的配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド検出プローブを用いて該標的配列を検出する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 試料中のＨＢＶ核酸を検出する方法であって、ａ) 該試料に、5'-GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCG-3'もしくはそれと相補的な配列を含むかまたはその中に含まれるオリゴヌクレオチド検出プローブを加え（ここで、該オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション条件下で該ＨＢＶ核酸とハイブリダイズして検出可能なプローブ／標的二本鎖を形成する）、ｂ) 該試料中に該ＨＢＶ核酸が存在する指標として該プローブ／標的二本鎖を検出する工程を包含する方法。
【請求項２】 さらに、5'-CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG-3'、5'-CCCGAGATTG AGATCTTCTG CGAC-3'、およびそれらの相補物からなる群から選ばれる配列を含むかまたはそのなかに含まれる増幅オリゴヌクレオチドを用いて該ＨＢＶ核酸を増幅する工程を包含する請求項１記載の方法。
【請求項３】 試料中のＨＢＶ核酸を増幅する方法であって、ａ）該試料に、核酸増幅条件下で5'-CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG-3'、5'-CCCGAGATTG AGATCTTCTG CGAC-3'、およびそれらの相補物からなる群から選ばれる配列を含むかまたはその中に含まれる１またはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドを加え（ここで、該増幅オリゴヌクレオチドは該ＨＢＶ核酸と結合し、伸張することができる）、ｂ）該ＨＢＶ核酸を増幅する工程を包含する方法。
【請求項４】 該試料に、5'-CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG-3'、5'-CCCGAGATTG AGATCTTCTG CGAC-3'、およびそれらの相補物を含むかまたはその中に含まれる増幅オリゴヌクレオチド対を加えることを包含する請求項３記載の方法。
【請求項５】 該試料に、5'-CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG-3'および5'-AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC GAGATTGAGA TCTTCTGCGA C-3'からなるかまたはその中に含まれる増幅オリゴヌクレオチド対を加えることを包含する請求項３記載の方法。
【請求項６】 5'-CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG-3'、5'-AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC GAGATTGAGA TCTTCTGCGA C-3'、5'-CCCGAGATTG AGATCTTCTG CGAC-3'、およびそれらの相補物からなる群から選ばれる１またはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドを含有するＨＢＶ核酸を増幅するためのキット。
【請求項７】 5'-CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGG-3'および5'-AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC GAGATTGAGA TCTTCTGCGA C-3'からなるかまたはその中に含まれる増幅オリゴヌクレオチド対を含有する請求項６記載のキット。
【請求項８】 さらに、5'-GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCG-3'からなるかまたはその中に含まれる検出プローブを含有する請求項７記載のキット。
【発明の詳細な説明】【０００１】本出願は１９８９年７月１１日出願の出願番号第３７９５０１号の継続出願である。
【発明の属する技術分野】本発明は、単独でまたは核酸のホモジーニアスまたはヘテロジーニアスな混合物の大きなまたは小さな成分として存在し得る「標的配列」または特定の核酸配列のコピー数を増加させる方法に関するものである。この核酸の混合物は、診断用の検査、環境検査、学術研究、クローニングのような別の操作のための試薬または材料の調製、またはその他の目的のために採取される試料中に見いだされるものであり得る。特定の核酸配列の選択的増幅は、特異性を維持し、様々な研究方法の感受性、簡便性、正確さおよび信頼性を増し、かつ種々の目的のための特定のオリゴヌクレオチドの十分な供給を可能にしつつ、診断上のおよび環境に関わる検定の感受性を増すという点で貴重である。本発明は、その実施の際の簡便性の故に、とりわけ環境および診断用検査における使用に好適である。
【０００２】
【従来の技術】特定の核酸配列の検出および／または定量は、微生物の同定および分類、感染症の診断、遺伝的異常の発見および性格決定、癌に伴う遺伝子の変化の同定、遺伝的易罹患性の研究、および種々の型の処置に対する応答の測定のためにますます重要になりつつある技術である。さらにこのような方法は、食物、環境からの試料、種、および特定の微生物の存在が監視される必要のあるその他の型の物質中で微生物を検出および定量する際の使用へと用途が広がることがわかった。その他、犯罪の容疑者の同定、父親捜しの論争の解決、家系図および系統発生樹の作成、および様々な生命形態の分類を助けるために核酸配列の関連性の測定が用いられる、法医学、人類学、考古学および生物学における適用性が見いだされている。特定の核酸配列の検出および定量のための一般的方法は核酸のハイブリダイゼーションである。この方法は、相補的または本質的に相補的な配列を含む二本の核酸鎖が適当な条件の下で特異的に結合して二本鎖構造を形成する能力に基づくものである。特定の核酸配列（「標的配列」として知られる）を検出および／または定量するために、その標的配列に対し相補的な配列を含む標識オリゴヌクレオチド（「プローブ」として知られる）を調製する。このプローブを、標的配列の含有が疑われる試料と混合し、ハイブリッド形成のために適当な条件を作りだす。試料中に標的配列が存在すれば、プローブは標的配列とハイブリダイズする。次いでこのプローブ−標的ハイブリッドを様々な手段のうちの一つを用いて一本鎖プローブから分離する。このハイブリッドに付随した標識の量を測定する。【０００３】核酸ハイブリダイゼーション検定の感度は、主としてプローブの特異活性、ハイブリダイゼーション反応の割合および程度、ハイブリッド形成および非ハイブリッド形成プローブの分離方法の挙動、および標識の検出される感度によって制限を受ける。最良の条件下において上記のような直接ハイブリダイゼーション法は約１ｘ１０5ないし１ｘ１０6の標的分子を検出することができる。最も鋭敏な方法は、日常の臨床および環境検査に必要とされる速さ、簡便性、および経済性というような多くの特徴を欠く場合がある。そのうえ、その感度は多くの望ましい適用に対して十分でないことがある。感染症は、血液または他の試料１０ｍｌにつきわずか１個の病原性微生物に伴って起こり得る。法医鑑識官は犯罪現場から微量の組織しか得られないということもある。研究者は、生体の遺伝子材料中または一群の細胞のメッセンジャーＲＮＡ群中に存在する全配列の中にごく小さな断片として存在する特定の遺伝子配列を検出および／または定量する必要があるかも知れない。この型の検定の様々な構成因子および操作工程間の相互作用の結果として、感度および特異性の間には殆ど常に逆の関係が存在する。即ち、その検定の感度を高めるための工程（例えばプローブの特異活性を高める）を取り入れた結果、偽陽性の試験結果の比率がより高くなり得る。感度および特異性のつながりは、ハイブリダイゼーション検定の感度を高める上での重大な障壁であった。この問題に対する一つの解決は、増幅方法を用いて標的配列の存在量を特異的に増加させることである。試料の残りの配列にコードされている情報のかなりの部分の増幅を必要とすることなくただ一個の標的配列部分を増幅することにより、感度が向上し、一方同時に特異性は低下しない。例えば長さ２５塩基の核酸配列は、この配列中の２５の位置の各々が４種の異なるヌクレオチドのうちの１個によって占められているため、４25分の１または１０15分の１の確率で存在する可能性がある。
【０００４】「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」と呼ばれる核酸配列の特異的増幅法はミュリス等によって記載されている（米国特許第４６８３１９５号、４６８３２０２号および４８００１５９号ならびに欧州特許出願第８６３０２２９８．４号、８６３０２２９９．２号および８７３００２０３．４号ならびにメソッズ・イン・エンザイモロジー第１５５巻、１９８７、３３５−３５０頁参照）。この方法は、鋳型として相補的配列の各鎖を用いる、同時に起こるプライマー依存核酸合成の反復サイクルを使用している。増幅される配列は、合成を開始させるプライマー分子の位置によって規定される。プライマーは標的配列またはその相補体の３'末端部分に対して相補的であり、かつ核酸合成を開始させるためにはこの部位と結合せねばならない。伸長産物の合成後、次の合成工程の前にこの鎖を通常熱変性により分離する。ＰＣＲ法の場合、相補的配列の両方の鎖が合成される。ＰＣＲにおいてＰＣＲ反応の各サイクルの終わりに新たに合成される鎖を分離するのに用いられる鎖の分離工程は、しばしば熱変性である。その結果、熱安定性酵素が必要となるか、または熱変性工程とＤＮＡ合成の次のサイクルの開始の間に新たな酵素が添加されねばならないかのいずれかとなる。幾つかの異なる且つ極端な反応温度のサイクルを反復する必要があるということは、ＰＣＲ法の不利な点である。ＰＣＲを簡便にするためには高価なプログラム可能な温度サイクル機器が必要である。
【０００５】ＰＣＲ反応に使用されるプライマーの１個にプロモーター配列を組み込み、次いで数サイクルのＰＣＲ法により増幅した後、この二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＲＮＡの転写のための鋳型として使用することにより、ＰＣＲ法がＲＮＡ転写と組み合わせられた（例えばムラカワ等、ＤＮＡ第７巻２８７−２９５頁（１９８８）参照）。特定の核酸配列を増幅するその他の方法は、プライマーの使用によりプロモーター配列を含む中間体二本鎖ＤＮＡ分子を供給するための一連のプライマーハイブリダイゼーション、伸長および変性工程を含む。この二本鎖ＤＮＡを標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させるのに使用する。得られたＲＮＡコピーをさらにコピーを生成させるための標的配列として使用し、多数のサイクルを実施することができる（例えばバーグ等、ＷＯ８９／１０５０およびジンジェラス等、ＷＯ８８／１０３１５参照）。特定の配列の比較的大量のＤＮＡをインビトロで化学的に合成する方法は当業者に良く知られており、この方法によるＤＮＡの生成は今や常套である。しかしながらこれらの方法は時間がかかり、また長さ約１００塩基よりずっと大きなオリゴヌクレオチドの合成には容易に用いることができない。さらに、合成すべきＤＮＡの全塩基配列がわかっていなければならない。これらの方法は、一度にただ１種の配列しか合成できない高価な機器を必要とする。この機器の操作にはかなりの訓練と専門知識が必要である。ＲＮＡの化学合成法は開発がより困難であった。
【０００６】核酸は、微生物の遺伝子材料中に特定の核酸配列をクローニングまたは挿入し、その結果この微生物が複製を行なう時に挿入された配列が複製されることを含む技術によって合成することができる。適当なプロモーター配列の下流に隣接してこの配列が挿入されれば、この配列のＲＮＡコピーまたはこの配列によりコードされる蛋白生成物が生成し得る。クローニングは事実上無制限の量の特定の核酸配列を産み出せるが、含まれる操作の数のため、これは診断用、環境、または法医学用の検査における使用には適していない。クローニング技術の使用にはかなりの訓練と専門知識を要する。１個の配列のクローニングには数人月またはそれ以上の労力が費やされ得る。ＲＮＡ指向ポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼの結合のための認識配列を有する組み替え一本鎖ＲＮＡ分子を用いて、比較的大量の特定のＲＮＡを作ることができる（例えばクレーマー等の米国特許第４７８６６００号参照）。特定の配列を異なった分子のＤＮＡコピー中に挿入し、これを発現ベクターにクローニングし、それをＲＮＡに転写し、次いでＱβレプリカーゼをもって複製するために、多くの工程が必要である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は標的（ターゲット）核酸配列の多数のコピーを合成する新規な自触（自動触媒）的（即ち、温度、ｐＨ、またはイオン強度のような反応条件を修飾する必要なしに、１つのサイクルの生成物を次のサイクルに使用して自動的に循環することができる）方法を目的とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的の３'末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によりＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含むプライミング配列の５'側配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、（ｂ）ＲＮＡ標的に対し相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物を与える鋳型として該標的を使用する伸長反応において第一プライマーを伸長し、（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成（分解）する酵素を用いてＤＮＡ伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、プライマーまたはスプライスの鋳型を含み、そしてオリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下でＤＮＡプライマー伸長産物の３'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する第二のオリゴヌクレオチドで処理し（ただし、もし第一のオリゴヌクレオチドがプロモーターを持たなければ、第二のオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む複合体形成配列の５'側配列を有するスプライスの鋳型である）、（ｅ）ＤＮＡ伸長反応において、第二のオリゴヌクレオチドまたは第一プライマー伸長産物のいずれかの３'末端を伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして（ｆ）この鋳型を用い、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、ことを含む。オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーは、標的配列のコピーを多数自触的に合成するために使用できる。
【０００９】本発明の一側面において、概括的方法は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的の３'末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、（ｂ）鋳型として該標的を使用する伸長反応において第一プライマーを伸長して、ＲＮＡ標的に対し相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物を得、（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成（分解）する酵素を用いて第一のＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下でＤＮＡプライマー伸長産物の３'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する第二プライマーで処理し、（ｅ）第二のＤＮＡプライマー伸長産物を与えるＤＮＡ伸長反応において第二プライマーの３'末端を伸長し、これによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして（ｆ）この鋳型を用いて、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させる、ことを含む。オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡコピーは標的配列のコピーを多数自触的に合成するために使用することができる。この側面は、さらに、（ｇ）工程（ｆ）からのＲＮＡコピーを、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第二プライマーによって処理し、（ｈ）ＲＮＡコピーを鋳型として用いるＤＮＡ伸長反応において第二プライマーの３'末端を伸長して第二のＤＮＡプライマー伸長産物を得、（ｉ）ＲＮＡコピーを選択的に減成する酵素を用いて第二のＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡコピーから分離し、（ｊ）第二のＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が生成しＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、第一プライマーによって処理し、（ｋ）ＤＮＡ伸長反応において第二プライマー伸長産物の３'末端を伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、そして、（ｌ）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のコピーを多数生成させる、ことを含む。工程（ｌ）、工程（ｇ）ないし（ｋ）のＲＮＡコピーの使用は自触的に反復されて標的配列のコピーを多数合成する。工程（ｋ）においてスプライスの鋳型として挙動する第一プライマーもまた工程（ｋ）のＤＮＡ伸長反応において伸長され得る。
【００１０】本発明に係る概括的方法のもう１つの側面は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を、標的配列の３'末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する第一プライマーで処理し、（ｂ）鋳型として該標的を使用する伸長反応においてプライマーの３'末端を伸長して、ＲＮＡ標的に対し相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得、（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に減成する酵素を用いてＤＮＡ伸長産物をＲＮＡ標的から分離し、（ｄ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＤＮＡプライマー伸長産物を、プライマー伸長産物の３'末端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、およびＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る配列、を有するスプライスの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチドで処理し、（ｅ）ＤＮＡプライマー伸長産物の３'末端を伸長してこれにプロモーターに対し相補的な配列を加え、それによりＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成し、（ｆ）この鋳型を用い、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のＲＮＡコピーを多数生成させ、そして、（ｇ）工程（ｆ）のＲＮＡコピーを用いて工程（ａ）ないし（ｆ）を自触的に反復させて標的配列を増幅する、ことからなる方法を提供する。所望により、工程（ｄ）のスプライスの鋳型をプライマーとしても機能させ、これを工程（ｅ）において第一のプライマー伸長産物を鋳型として使用して伸長し、第二プライマー伸長産物を得ることもできる。さらに、本発明の別の側面において、増幅させたい配列がＤＮＡとして存在する場合、適当な「予備操作」を使用するとＲＮＡコピーが生成し、次いでこれを本発明の「概括的方法」に従って増幅することができる。したがって別の側面においては本発明は、増幅すべき存在するコピーの数を増加させるばかりでなく、増幅のためのＤＮＡ配列のＲＮＡコピーを提供し得る、本発明の増幅方法に関連して使用するための「予備操作」を目的とするものである。
【００１１】本発明は、試料中の特定の標的核酸配列のコピー数を増加させる方法を目的とするものである。１つの側面において本発明は、それ自身追加の生成物の生成に使用されることができ、その結果、例えば温度循環のような反応条件の操作を必要とせずに自触的反応を引き起こす生成物を産生する酵素的ハイブリッド−分離工程を伴う、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）の共同作用を含む。「予備操作」を含む本発明方法の幾つかの態様においては、「予備操作」の最初の工程を除く全ての工程を１種類の温度で実施する。本発明方法は、臨床上の、環境の、法医学用の、および類似の試料における特定の核酸標的配列を検出および／または定量する検定の構成因子として、または、様々な使用のための特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡのコピーを多数生成させるために使用できる。さらにこれらの方法は、クローニングのためのＤＮＡ標的配列のＤＮＡコピーを多数生成させるため、またはプローブを産み出すため、または配列決定のためのＲＮＡおよびＤＮＡコピーを生成させるためにも使用できる。
【００１２】典型的な検定の一例の場合、増幅すべき試料を、緩衝液、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三燐酸、プライマーおよび／またはスプライスの鋳型、ジチオトレイトール、およびスペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合する。次いで所望によりこの反応物を１００℃付近で２分間インキュベートして二次構造を変性させる。室温まで冷却した後、もし標的が、確定した３'末端の無いＤＮＡ標的ならば、逆転写酵素を加え反応混合物を４２℃で１２分間インキュベートする。反応物を、今回はプライマー伸長産物をＤＮＡ鋳型から分離するために、再度１００℃付近で変性させる。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮアーゼＨを加え、反応物を３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで、生成物を変性させ、プローブ溶液を加え、６０℃で２０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解する溶液を加え、反応物を６０℃で６分間インキュベートし、そして残留する化学ルミネセンスをルミノメーターで測定することにより、この反応物を検定することができる（例えばアーノルド等、ＰＣＴ ＵＳ８８／０２７４６号（１９８８年９月２１日出願、１９８９年３月２９日公告）参照。この内容は引用して本明細書の一部とし、「ＨＰＡ」と呼称する）。本発明方法の生成物は当業者に知られる他の多くの検定系で使用することができる。もし標的が確定した３'末端を有する、または標的がＲＮＡであるならば、典型的な検定は、標的を前記の緩衝液濃縮物と混合し、二次構造を変性させることを含む。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮアーゼＨを加え、この混合物を３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで反応物を前記のごとく検定し得る。
【００１３】本発明方法およびこの中で用いられる材料は、診断操作における使用のための診断キットの一部として組み入れることができる。
定義本明細書中使用される以下の語は、特に別途記載のない限り以下の意義を有する。
１．鋳型「鋳型」は、核酸ポリメラーゼにより複製される核酸分子である。鋳型はそのポリメラーゼにより、一本鎖、二本鎖または部分的二本鎖であり得る。合成されたコピーは鋳型に対し、または二本鎖もしくは部分的二本鎖の鋳型の少なくとも一本の鎖に対し相補的である。ＲＮＡおよびＤＮＡの両者は常に５'から３'の方向へと合成され、二本鎖核酸の二本の鎖は常に二本の鎖の５'末端がその二本鎖の反対の端にあるように並んでいる（そしてその場合必然的に３'末端もまた同様である）。
【００１４】２．プライマー、スプライスの鋳型「プライマー」は、鋳型と複合体を形成（水素結合またはハイブリダイゼーションによる）してＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型複合体を与える、鋳型に対し相補的なオリゴヌクレオチドであって、これはＤＮＡ合成の過程で、鋳型に対し相補的な３'末端に連なった共有結合により結合した塩基の添加により、伸長する。この結果がプライマー伸長産物である。事実上、既知の全てのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）はＤＮＡ合成の開始のためにオリゴヌクレオチドの一本鎖鋳型への結合（プライミング）を必要とするが、これに対してＲＮＡの複製および転写（ＤＮＡからＲＮＡの複製）は一般にプライマーを必要としない。適当な状況下ではプライマーがスプライスの鋳型としても働き得る（以下の「スプライスの鋳型」の定義を参照されたい）。「スプライスの鋳型」は一本鎖の核酸と複合体を作るオリゴヌクレオチドであって、特定の配列を付加するために標的核酸の３'末端を伸長する鋳型として使用される。スプライスの鋳型は標的核酸分子の３'末端に対し十分相補的であり、この３'末端はスプライスの鋳型と複合体を作らせるために伸長させる。次いでＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼを使用して、スプライスの鋳型の５'から相補領域に至る配列を鋳型として用いて標的核酸分子を伸長する。伸長した分子の伸長産物は、スプライスの鋳型の５'末端の配列に相補的な特異的配列を３'末端に有する。もしスプライスの鋳型の３'末端がブロックされておらず、且つ標的核酸に対し相補的であれば、これはプライマーとしても働き、鋳型として標的核酸分子を用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。スプライスの鋳型の３'末端は、３'末端のジデオキシヌクレオチドの存在または標的に対し非相補的３'末端配列の存在を含む種々の形で、または当業者に知られるその他の形でブロックできる。プライマーまたはスプライスの鋳型のいずれかが一本鎖の核酸と複合体を形成し、ＤＮＡポリメラーゼのためのプライミング機能を果たすことができる。
【００１５】３．標的核酸、標的配列「標的核酸」は増幅されるべき「標的配列」を有し、一本鎖または二本鎖のいずれかであることができ、標的配列の外に増幅されるべきでない他の配列を含むことがある。「標的配列」という語は増幅されるべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を意味する。「標的配列」は、本発明の工程の最中にオリゴヌクレオチド（プライマーおよび／またはスプライスの鋳型）が複合体を形成する複合体形成配列を含む。標的核酸が本来一本鎖である場合、「標的配列」という語は標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的な配列をも意味することになろう。「標的核酸」が本来二本鎖である場合、「標的配列」という語は（＋）および（−）鎖の両者を意味する。
【００１６】４．プロモーター／プロモーター配列「プロモーター配列」は、その核酸に結合し、特定の位置でＲＮＡの転写を開始させる信号としてＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）により認識される特定の核酸配列である。結合のためには、このような転写酵素は一般にプロモーター配列およびその相補体を含む部分において二本鎖であるＤＮＡが必要であり、鋳型部分（転写されるべき配列）は二本鎖である必要がない。個々のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、転写を進める効率の点で著しく異なる様々な異なったプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためにプロモーター配列に結合するとき、そのプロモーター配列は転写される配列の一部ではない。したがってこれにより生成するＲＮＡ転写物は、その配列を含まないであろう。
【００１７】５．ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ「ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例として大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼがある。既知のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼはすべて合成の開始に相補的プライマーを必要とする。適当な条件下ではＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成できることが知られている。
【００１８】６．ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）
「ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、プロモーター配列（通常二本鎖）を有する二本鎖または部分的二本鎖のＤＮＡ分子から多数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。このＲＮＡ分子（「転写物」）はプロモーターのすぐ下流の特定の位置から始まって５'→３'の方向へ合成される。転写酵素の例には大腸菌およびバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがある。
【００１９】７．ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）
「ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」はＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。知られている全ての逆転写酵素はＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを作り出す能力をも有する。したがってこれらはＲＮＡ−およびＤＮＡ−依存性のＤＮＡポリメラーゼである。合成を開始するためにはＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型の両者にプライマーが必要である。
【００２０】８．ＲＮアーゼＨ「ＲＮアーゼＨ」はＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を減成させる酵素である。ＲＮアーゼＨはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。殆どの逆転写酵素は普通それらのポリメラーゼ活性に加えてＲＮアーゼＨ活性を有する。しかし、付随するポリメラーゼ活性のないＲＮアーゼＨの他の供給源も利用できる。減成の結果ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からＲＮＡが分離し得る。これとは別にＲＮアーゼＨはＲＮＡ部分が融解または酵素にＲＮＡ部分の巻戻しをさせるように、様々な位置で単にＲＮＡを切断することもできる。
【００２１】９．プラス／マイナス鎖核酸合成の議論は、核酸二本鎖の二本の相補的鎖を命名する語を採用することにより著しく単純化且つ明確化する。伝統的に、蛋白または構造的ＲＮＡを生成するために使用される配列をコードする鎖は「プラス」鎖、そしてその相補体は「マイナス」鎖と称した。現在では、多くの場合両方の鎖が機能的であり、よって一方を「プラス」とし他方を「マイナス」とする命名の割り振りは任意であることがわかっている。にもかかわらずこの語は核酸の配列の方向を指定するのに非常に有用であるので、本明細書においてこの目的のためにこれを用いる。
【００２２】１０．ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」という語は、ワトソン・クリックの塩基対形成により複合体を形成するに十分相補的なヌクレオチド配列間の複合体形成を意味する。プライマー（またはスプライスの鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」する時、このような複合体（またはハイブリッド）はＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を開始するのに要するプライミング機能を果たすのに十分安定である。
【００２３】１１．プライマー配列本明細書中で言及するプライマーの配列を以下に開示する。
ＨＢＶ領域２プライマー(+)： 5'CACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGG3'(-)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGAGATTGAG ATCTTCTGCGAC3'プローブ(+)： 5'GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCG3'ＨＩＶ領域１プライマー(+)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGGGACTTTCC GCTGGGGACTTTCC3'(-)： 5'GTCTAACCAGAGAGACCCAGTACAGGC3'プローブ配列：5'GCAGCTGCTTATATGCAGGATCTGAGGG3'ＨＩＶ領域２プライマー(+)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAATGGCA GTATTCATCCACA3'(-)： 5'CCCTTCACCTTTCCAGAG3'プローブ配列：(-)： 5'CTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTACCCC3'ＨＩＶ領域３プライマー(+)： 5'CTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTG3'(-)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCCCCCGCTT AATACTGACGCT3'プローブ：(+)： 5'GACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGG3'ＨＩＶ領域４プライマー(+)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGACCATCAATGAGGAA GCTGCAGAATG3'(-)： 5'CCATCCTATTTGTTCCTGAAGGGTAC3'プローブ：(-)： 5'CTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCC3'ＨＩＶ領域５プライマー(+)： 5'GGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAG3'(-)： 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCTCCTT CTGATAATGCTG3'プローブ：5'GAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCATG3'ＢＣＬ−２ 染色体転移主要ブレイクポイントt（１４；１８）プライマー(-)： 5'GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTGAGGAGACGGTGACC3'(+)： 5'TATGGTGGTTTGACCTTTAG3'プローブ：5'GGCTTTCTCATGGCTGTCCTTCAG3'5'GGTCTTCCTGAAATGCAGTGGTCG3'ＣＭＬ 染色体転移t（９；２２）プライマー(-)： 5'GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC3'(+)： 5'GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC3'プローブ：5'GCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGG3'【００２４】１２．特異性核酸配列の特性であって、これは配列および検定条件により標的および非標的配列を識別する能力を意味する。
【００２５】本発明によれば、特定の核酸標的配列の検出および／または定量用の検定における使用のため、または様々な用途の特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの多数のコピーを生成するための、特定の核酸標的配列の増幅のための新規な方法および組成物が提供される。
Ｉ．概括的方法好ましい側面において、本発明はＲＮＡ標的配列のＤＮＡおよびＲＮＡコピーを多数合成する自触的増幅方法を提供する。標的核酸は、増幅されるべき標的配列を含む。標的配列は、どちらかの端がプライマー、スプライスの鋳型、および／または天然の標的核酸の末端によって規定される標的核酸の領域であって、（＋）および（−）の両鎖を含む。ある側面においてこの方法は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、標的配列の３'末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によりＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む５'から複合体形成配列に至る配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理する事からなる。第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、５'からプライミング配列に至る他の配列を有することもある。第一プライマーの３'末端は適当なＤＮＡポリメラーゼにより、ＲＮＡを鋳型として用いる伸長反応において伸長され、ＲＮＡ鋳型に対し相補的な第一のＤＮＡプライマー伸長産物が得られる。この第一プライマー伸長産物を、ＲＮＡ鋳型を選択的に減成させる酵素を用いてＲＮＡ鋳型から分離（少なくとも部分的に）する。好適な酵素はＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に選択的に働く酵素であって、ＲＮアーゼＨを含む酵素を包含する。幾つかの逆転写酵素はＲＮアーゼＨ活性を含むが、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性のＲＮアーゼＨを添加するのが好ましい。
【００２６】オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、一本鎖の第一プライマー伸長産物を、第一プライマー伸長産物中に含まれる標的配列の３'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する第二プライマーまたはスプライスの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチドで処理する。第一プライマーがプロモーターを持たないときは、第二のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'から複合体形成領域の配列を有するスプライスの鋳型である。所望によりこのスプライスの鋳型はその３'末端においてブロックされ得る。第二のオリゴヌクレオチドおよび／またはプライマー伸長産物の３'末端はＤＮＡ伸長反応において伸長してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成する。作られたＲＮＡコピーまたは転写物は、さらに操作をすることなく自触的に増幅できる。オリゴヌクレオチドがスプライスの鋳型として機能する場合、そのプライマー機能は必要ない。したがって、このスプライスの鋳型の３'末端はブロックされていてもいなくてもよい。得られる反応混合物の構成因子（即ち、確定した３'末端を有する第一プライマー伸長産物を生成させるＲＮＡ標的、第一プライマー、およびブロックされたまたはブロックされていないスプライスの鋳型）は大量のＲＮＡおよびＤＮＡを自触的に合成するよう機能する。
【００２７】本発明の一側面において、第一および第二のオリゴマーは共にプライマーである。第一プライマーはＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る配列を有し、また他の配列をも含み得る。第二プライマーもまたＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含み得る５'から複合体形成配列に至る配列を含み、所望により他の配列を含む。両方のプライマーがプロモーター配列を有する場合、クローニングのような他の目的のための第二のプロモーターを導入する意図でない限り、両方の配列が同じＲＮＡポリメラーゼにより認識されるのが好ましい。第二プライマーの３'端は、適当なＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応において伸長され、第一プライマー伸長産物に対し相補的な第二のＤＮＡプライマー伸長産物を生成する。第一プライマーが標的配列の一方の端を規定し、第二プライマーはここで多端を規定することに留意されたい。第二の伸長反応の二本鎖生成物は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの生成のための好適な鋳型である。もし第二プライマーもまたプロモーター配列を有するときは、二本鎖鋳型の両方の鎖に相補的な転写物が自触反応中に生成するであろう。この時点でＲＮＡ転写物は標的核酸とは異なる末端を持ち、しかしながら第一プライマーと第二プライマーの間の配列は損なわれずに残っている。こうして生成したＲＮＡ転写物は、さらに操作を行なうことなく上の系を自動的に再循環させることができる。したがってこの反応は自触的である。もし第二プライマーの複合体形成配列が第一プライマー伸長産物の３'末端と複合体を作るならば、第二プライマーはスプライスの鋳型として働き、第一プライマー伸長産物は伸長して５'からプライミング配列に至る第二プライマーの任意の配列を第一プライマー伸長産物に付加することができる。（例えば第５および７図参照）もし第二プライマーがスプライスの鋳型として働き、且つ５'から複合体形成配列に至るプロモーター配列を含むならば、プロモーター配列を付加する第一プライマー伸長産物の伸長はＲＮＡポリメラーゼのためのさらなる鋳型を産み、これが転写されていずれかの鎖のＲＮＡコピーを生成することができる。（第５および７図参照）両方のプライマーにプロモーターが含まれていることにより、合成される標的配列のコピー数が増加する。
【００２８】本発明の概括的方法のもう一つの側面は、プライマーを含む第一のオリゴヌクレオチド、およびスプライスの鋳型を含みそれ自身プライマーとして働くことのできるまたはできない（プライマー伸長反応においてそれ自体が伸長しないという点において）第二のオリゴヌクレオチドの使用を含む。この概括的方法の側面は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、標的配列の３'末端部分に対してこれと複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーで処理することからなる。この第一プライマーは、プロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る他の配列を有していてもよい。第一プライマーの３'端を、適当なＤＮＡポリメラーゼにより、ＲＮＡを鋳型とする伸長反応で伸長して、このＲＮＡ鋳型に対し相補的な第一プライマー伸長産物を得る。第一プライマー伸長産物を、ＲＮＡ鋳型を選択的に減成させる酵素を用いてＲＮＡ鋳型から分離する。好適な酵素はＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に選択的に働くものであって、ＲＮアーゼＨ活性を含む酵素を包含する。幾つかの逆転写酵素はＲＮアーゼＨ活性を含むが、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性のＲＮアーゼＨを添加するのが好ましい。オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、一本鎖の第一プライマー伸長産物を、プライマー伸長産物の３'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、およびＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る配列、を有するスプライスの鋳型で処理する。スプライスの鋳型の３'末端は、ブロックされている（例えばジデオキシヌクレオチドの添加により）か、または標的核酸に対し非相補的である（その結果これはプライマーとして機能しない）か、または別法によりブロックされていないか、のいずれかである。第一プライマー伸長産物の３'末端は適当なＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸長反応において伸長され、第一プライマー伸長産物の３'末端にプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配列に対し相補的な配列が付加される。もし３'末端がブロックされていなければ、スプライスの鋳型が伸長して第一プライマー伸長産物に対して相補的な第二プライマー伸長産物が得られる。スプライスの鋳型を伴う伸長反応の生成物（ブロックされていようとなかろうと）は、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ合成のための鋳型として機能することができる。上に述べたように、このように生成したＲＮＡ転写物はさらに操作を行なうことなく自動的に前記の系を再循環させることができる。即ちこの反応は自触的である。
【００２９】幾つかの態様においては、増幅すべき標的配列は、使用するプライマー（またはスプライスの鋳型）に対して相補的な特定の配列の位置によって両端が規定される。他の態様においては、標的配列は、使用するプライマー分子に対し相補的な特定の配列の位置が一個、そして特異的制限エンドヌクレアーゼにより、または他の適当な手段により切断される、天然３'末端を含み得る特定の配列の位置により、反対の端が規定される。他の態様においては、標的配列は、１またはそれ以上の特異的制限エンドヌクレアーゼにより切断される特定の配列の位置により、両端が規定される。本発明の好ましい態様においては、ＲＮＡ標的配列を決定し、次いでＲＮアーゼＨの減成がどこで二本鎖からＲＮＡ部分の切断または除去を起こすのかを決定する。ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素中に存在するＲＮアーゼＨ、大腸菌ＲＮアーゼＨまたは他の供給源およびこれらの組合せによって分析を行ない、標的配列のＲＮアーゼ減成の効果を決定する。プライマーの組を選択するにあたり、プライマーのうち１個を、反応混合物中に存在するＲＮアーゼＨにより実質上減成されないＲＮＡの部分とハイブリダイズするように選択するのが好ましい。もし実質的な減成が起こると、プライマーの領域におけるＲＮＡ鎖の切断により、ＤＮＡ合成の開始が阻害されプライマーの伸長が妨げられ得る。したがって、ＲＮＡがＲＮアーゼＨの作用を受ける場合、プライマー伸長産物の生成を妨げる実質的減成の無いように配置されたＲＮＡ標的の配列とハイブリダイズするプライマーを選択することが好ましい。
【００３０】プロモーター−プライマーのハイブリダイゼーションの部位は、プロモーター−プライマーがハイブリダイズするＤＮＡ鎖の部分にハイブリダイズしたＲＮＡ鎖部分を除去するに十分なＲＮＡ鎖の減成が起こるように選択する。典型的には、ＲＮアーゼＨ減成によりＲＮＡの一部分のみがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖から除去され、このＲＮＡ鎖の実質的部分は二本鎖に残る。ＲＮＡ合成のためのプロモーター含有二本鎖生成物の形成を第２２〜２５図に示す。第２２〜２５図に示すように、標的ＲＮＡ鎖は、反応混合物中に存在するＲＮアーゼＨにより実質上減成されないＲＮＡ鎖の領域とハイブリダイズするよう選択されたプライマーとハイブリダイズする。次いでこのプライマーを伸長してＲＮＡ鎖に対し相補的なＤＮＡ鎖を生成する。この後、反応混合物中に存在するＲＮアーゼＨによりＲＮＡ鎖を様々な位置で切断または減成する。この切断または減成は、この時点でまたは反応工程中の他の時点で起こり得ることを理解されたい。次いで重要な切断または減成が起こる領域でこのＲＮＡフラグメントをＤＮＡ鎖から分離する。次にこのプロモーター−プライマーを、ＲＮＡ鎖が実質的に減成されＤＮＡ鎖から分離されたその３'末端でＤＮＡ鎖にハイブリダイズする。次いでこのＤＮＡ鎖を伸長して二本鎖ＤＮＡプロモーター配列を作り、これによりＲＮＡ合成用の鋳型を生成する。この鋳型は二本鎖ＤＮＡプロモーター配列を含むことがわかる。この鋳型をＲＮＡポリメラーゼで処理するとＲＮＡの多重鎖ができる。
【００３１】ＲＮアーゼＨで引き起こされるＲＮＡの減成の正確な性質はわかっていないが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖上のＲＮアーゼＨ減成の結果、ハイブリッドからＲＮＡの小片が分離する事がわかった。さらに、ＲＮアーゼＨ減成の後に、小フラグメントの除去された領域でＤＮＡと結合するであろうプロモーター−プライマーを選択できるという事もわかった。描かれた第１〜１５図および第１６〜２０図にはＲＮアーゼＨ減成の後に残り得るＲＮＡは示していない。これらの図は一般にＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖からのＲＮＡの完全な除去を示しているが、好ましい条件下では第２１図に示すように部分的脱離のみが起こることが理解されるべきである。第１図を参照することにより、第１〜１５図のＲＮＡ鎖の実体部分が減成されずに残り、その結果第二プライマーのハイブリダイゼーションまたはプロモーター配列に対し相補的なＤＮＡ鎖を作るためのハイブリダイズされた第二プライマーの伸長が妨げられると、提唱される機構は起こらないであろう事が理解できる。しかしながら本出願において発見され開示される合成の原理に基づいて、当業者は本発明の教示に従い、常套的改良を施してＲＮＡの増幅のための効果的且つ効率的な方法を提供することができる。本明細書中の記載および第１〜１５図からわかるように、本発明は選択可能な変法を包含している。
【００３２】第１図は、標的核酸が３'から標的配列に至る余分の配列を有する場合の本発明に係る方法を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは、３'から標的配列の末端に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）の標的配列の３'末端部分と複合体を作る、５'からその複合体形成配列に至るプロモーターを有する第一プライマーを含む。第二のオリゴヌクレオチドは第二プライマーを含み、これは、第一プライマー伸長産物の３'末端と位置を同じくして第一プライマー伸長産物の３'末端部分と複合体を作る。工程（１）において第一プライマーは３'から標的配列に至る余分の配列のためにスプライスの鋳型としては働かない。しかしながら工程（１０）においては、第二プライマー伸長産物が３'から標的配列に至る余分の配列を持たないため、第一プライマーはスプライスの鋳型として働くことができる。第２図は、標的核酸（ＲＮＡ）が５'および３'の両方から標的配列に至る余分の配列を有する場合の本発明に係る方法を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１図に示す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは、３'から標的配列に至る余分の配列を有する第一プライマー伸長産物の標的配列の３'末端部分と複合体を作るプライマーを含む。
【００３３】第３図は、確定した５'および３'末端を持ち、したがって５'または３'のいずれから標的配列に至る余分の配列も持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１図および第２図に示す通りであるが、これは標的核酸の３'末端と複合体を作るため、工程１においてプライマーおよびスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドは第１図に示す通りである。第４図は、確定した３'端を持ち、したがって３'から標的配列に至る余分の配列は持たないが、５'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第３図に示す通りであり、プライマーおよびスプライスの鋳型の両者として機能する。第二のオリゴヌクレオチドは第２図に示す通りである。第５図は、確定した５'端を持つが３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１図に示す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは第二プライマーを含み、これは第一プライマー伸長産物の３'末端と複合体を作るので、スプライスの鋳型をも含む。第二のオリゴヌクレオチドはさらに５'からその複合体形成配列に至るプロモーターをも有する。
【００３４】第６図は５'および３'の両者から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第１図に示す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは、第一プライマー伸長産物が３'から標的配列に至る余分の配列を有するため工程（４）でスプライスの鋳型として働けない外は、第５図に示す通りである。第７図は、確定した５'および３'端の両者を持ち、標的配列以外に配列を持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第３図に示す通りであり、第二のオリゴヌクレオチドは第５図に示す通りである。この標的は余分の配列を持たないので、両方のオリゴヌクレオチドがスプライスの鋳型としても働く。第８図は、３'から標的配列に至る配列の無い確定した３'端を持ち、５'から標的配列に至る余分の配列を持つ標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第３図および第７図に示す通りであり、プライマーおよびスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドは第６図に示す通りである。第９図は、確定した５'末端を持ち５'から標的配列に至る余分の配列を持たないが、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプロモーターなしのプライマーを含んでいる。第二のオリゴヌクレオチドは、５'から複合体形成配列に至るプロモーターを有する、ブロックされていないスプライスの鋳型を含む。
【００３５】第１０図は、確定した５'および３'端の両者を持ち、標的配列以外に配列を持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプロモーターなしのプライマーを含んでいる。第二のオリゴヌクレオチドは第９図に示す通りである。第１１図は、５'から標的配列に至る余分の配列を持たない確定した５'末端を持ち、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第二のオリゴヌクレオチドは５'からその複合体形成配列に至るプロモーターを有するスプライスの鋳型を含むが、これはその３'末端がブロックされている。第二のオリゴヌクレオチドはプライマーとして働くことはできない。第１２図は、確定した５'および３'端を持ち、標的配列以外に余分の配列を持たない標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドはプライマーおよびスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオチドはブロックされたスプライスの鋳型であり、第１１図に示す通りである。
【００３６】第１３図は、確定した５'末端を持ち、したがって５'から標的配列に至る余分の配列を持たないが、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第９図に示すプライマーである。第二のオリゴヌクレオチドは、第１１図および第１２図に示す、プロモーターを有するブロックされたスプライスの鋳型である。第１４図は、標的配列以外に余分の配列を持たない確定した５'および３'配列の両者を持つ標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは、第１０図に示すように、プロモーターなしのプライマーを含む。第二のオリゴヌクレオチドは、第１１図、第１２図および第１３図に示すように、プロモーターを有するブロックされたスプライスの鋳型を含む。第１５図は、５'から標的配列に至る余分の配列を持たない確定した５'末端を持ち、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＲＮＡ）を描いている。１個のオリゴヌクレオチドが第一のおよび第二のオリゴヌクレオチドの両方に使用される。このオリゴヌクレオチドは、工程（１）に示すように標的配列の３'末端部分と複合体を作る３'プライマー配列、および、工程（４）に示すようにプライマー伸長産物の３'末端と複合体を作るプロモーターを持つ５'スプライスの鋳型の配列を有する。
【００３７】要約すると本発明方法は、温度、イオン強度およびｐＨのような反応条件の反復操作をすることなく標的核酸配列の多数のコピーを自触的に合成するための方法を提供するものであって、この方法は、（ａ）反応混合物中に、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸；２個のオリゴヌクレオチドプライマー、即ちＲＮＡ標的配列（例えば（＋）鎖）の３'末端部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第一のオリゴヌクレオチド、および相補体（例えば（−）鎖）の標的配列の３'末端部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を有する第二のオリゴヌクレオチド（ここで、第一のオリゴヌクレオチドは、所望によりプロモーターを含む５'から複合体形成配列に至る配列を有する第一プライマーを含み、第二のオリゴヌクレオチドはプライマーまたはスプライスの鋳型を有する。但し、もし第一のオリゴヌクレオチドがプロモーターを持たない場合は、第二のオリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む５'からプライミング配列に至る配列を有するスプライスの鋳型である。）；ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に減成する酵素活性（例えばＲＮアーゼＨ）；およびプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、を混合することからなる。反応混合物の構成因子は順次または一度に合することができる。反応混合物をオリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条件下で、そしてＤＮＡプライミングおよび核酸合成条件（リボヌクレオチド三燐酸およびデオキシリボヌクレオチド三燐酸を含む）のもとで標的配列の多数のコピーが作られるに十分な一定時間インキュベートする。この反応は、構成因子である酵素のような反応因子の安定性を維持するのに好適な条件の下で、そして増幅反応過程の間反応条件の修飾または操作を要することなく、有利に起こる。したがってこの反応は、実質的に等温の条件下で起こり得、実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む。
【００３８】この反応は、第一のＤＮＡ伸長反応により生成するＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離する変性工程を必要としない。こうした工程は、反応混合物の温度の実質的上昇（一般に周囲温度ないし約８０℃から約１０５℃まで）、そのイオン強度の減少（一般に１０Ｘまたはこれ以上）、またはｐＨの変化（通常ｐＨを１０またはこれ以上に上げる）によるような反応条件の操作を必要とする。このような反応条件の操作はしばしば酵素活性に有害に作用して余分の酵素の添加を要し、また、これをさらなる核酸合成に好適な条件に戻すためさらに反応混合物の操作が必要にもなる。好適なＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素を包含する。特に好適なＤＮＡポリメラーゼはＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を包含する。本発明方法に使用されるプライマーおよび／またはスプライスの鋳型への組み込みに好適なプロモーターまたはプロモーター配列は、その配列を認識し且つこれに結合するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識され、転写の工程を開始させ、これによりＲＮＡ転写物を生成させる核酸配列（天然に存在するか、合成により作られるか、または制限消化の産物のいずれか）である。この配列は所望によりＲＮＡポリメラーゼのための実際の認識部位を越えて伸長しているヌクレオチド塩基を含んでよく、これが安定性または減成工程に対する感受性の増加または転写効率の向上を与え得る。開始配列を認識できる既知の且つ利用可能なポリメラーゼのあるプロモーター配列は、使用にとりわけ好適である。典型的な既知の且つ有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６由来のもののように、ある種のバクテリオファージポリメラーゼにより認識されるもの、または大腸菌由来のプロモーターを包含する。
【００３９】本発明方法での使用に好適ないくつかの逆転写酵素は、例えばＡＭＶ逆転写酵素のようにＲＮアーゼＨ活性を有するが、大腸菌ＲＮアーゼＨのような外性ＲＮアーゼＨを添加するのが好ましい。実施例に示すように、外性ＲＮアーゼＨの添加が必要でなくとも、ある条件下ではＡＭＶ逆転写酵素中に存在するＲＮアーゼＨ活性が、反応混合物中に存在する因子によって阻害されることがある。このような状況においては外性ＲＮアーゼの添加が望ましい。比較的大量の異種ＤＮＡが反応混合物中に存在する場合、ＡＭＶ逆転写酵素の本来のＲＮアーゼＨ活性は多少阻害され（例えば実施例８参照）、したがって、生成する標的配列のコピー数はその結果減少する。標的配列が、存在するＤＮＡのうちわずかな部分しか含まない場合（例えば試料が有意な量の異種ＤＮＡを含有するとき）、外性ＲＮアーゼＨを添加するのが特に好ましい。このような好ましいＲＮアーゼＨの１つは大腸菌ＲＮアーゼＨである。このような外性ＲＮアーゼＨの添加が大量のＤＮＡにより引き起こされる阻害を克服することが示された（例えば実施例８参照）。
【００４０】これらの方法により生成したＲＮＡ転写物は、前記の機作により標的配列のさらなるコピーを生成する鋳型として働くことができる。この系は自触的であり、本発明方法による増幅は、温度、ｐＨ、イオン強度などのような反応条件を繰り返し修飾または変化させる必要なしに自触的に起こる。この方法は高価な温度循環装置を要せず、増幅反応工程の最中に酵素または他の試薬を何回も添加する必要もない。本発明の方法は、臨床上、環境の、法医学、および類似の試料中の特定の核酸標的配列を検出および／または定量するため、または種々の用途のために特定の標的配列のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの多数のコピーを生成させるための検定の一因子として使用できる。【００４１】典型的な検定においては、増幅すべき試料を、緩衝液、塩、マグネシウム、三燐酸、プライマーおよび／またはスプライスの鋳型、ジチオトレイトール、およびスペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合する。この反応物を所望により１００℃付近で２分間インキュベートして核酸中の二次構造を変性させる。冷却後、もし標的が確定した３'末端を持たないＤＮＡ標的ならば、逆転写酵素を加え、反応混合物を約４２℃で１２分間インキュベートする。今回はＤＮＡ鋳型からプライマー伸長産物を分離するために反応物を１００℃付近で再度変性させる。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮアーゼＨを加え、反応物を３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで生成物を変性させ、プローブ溶液を加え、６０℃で２０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプローブの標識を選択的に加水分解する溶液を加え、反応物を６０℃で６分間インキュベートし、そしてルミノメーターで残っている化学ルミネセンスの標識を測定することにより、反応物を検定することができる。上記に引用したＨＰＡ適用の方法をここに記載してある。溶液内プローブハイブリダイゼーションの代わりに、生成物を測定する幾つかの他の方法を用いることができる。標的が確定した３'末端を持ち、且つ一方のオリゴヌクレオチドが、３'末端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、および５'から複合体配列に至るプロモーター配列を有するスプライスの鋳型である場合、または標的がＲＮＡである場合、典型的な検定は、標的を前記の緩衝液濃縮物と混合し二次構造を変性させることを含む。冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、および所望ならばＲＮアーゼＨを加え、混合物を３７℃で２ないし４時間インキュベートする。次いで反応物を前記のように検定することができる。
【００４２】ＩＩ．予備操作以下の記載は、所望により本発明の好ましい方法と共に使用できる予備操作の幾つかの態様である。幾つかの標的核酸は自触的増幅に先立ち修飾を要するため、これらの操作を用いて修飾を行なう。標的核酸（および標的配列）が本来ＤＮＡである場合、これらの操作を用いて概括的方法で使用するための標的配列のＲＮＡコピーを作ることができる。これらの予備操作は自身反復でき、故にそれ自身増幅方法として使用できることが理解されるべきである。
予備操作Ｉこの方法は、確定した３'末端を有する１本（一本鎖）のＤＮＡからなる標的核酸の標的配列のＲＮＡコピーを与えるものである。予備操作Ｉは２個の核酸構成因子、即ち標的核酸分子およびオリゴヌクレオチドスプライスの鋳型を使用する。この操作は確定した３'端を有するＤＮＡ標的核酸を要する。もし本来の３'末端が未知または何らかの理由で不十分な場合は、制限ヌクレアーゼの使用、別の配列へのライゲーション、または他の何らかの手段によって新たな確定３'末端を作り出すことができる。以下の記述において、（第１６図ないし第１８図参照）標的核酸は自由裁量により「マイナス」の意義を有するものとする。したがってスプライスの鋳型は標的に対しこれと複合体を作るに十分相補的であるような「プラス」の意義を有することになる。このスプライスの鋳型は標的の３'末端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有する。さらにスプライスの鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む５'から複合体形成配列に至る配列を有する。スプライスの鋳型は所望により、５'からプロモーターに至る、プロモーターおよび複合体形成配列の間、および／または３'から複合体形成配列に至る、他の配列を有していてよい。スプライスの鋳型はさらに３'末端でブロックされるよう修飾されていてもよく、その結果これは伸長反応において余分のヌクレオチドを添加しても伸長できず、またスプライスの鋳型として働くのに加えてプライマーとして働くことができなくなる。
【００４３】予備操作Ｉは２種の酵素活性、即ちＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用する。標的核酸を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られＤＮＡ合成が開始し得る条件下でスプライスの鋳型で処理する。適当なＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ伸長反応においては、５'から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配列に対し相補的な配列を標的ＤＮＡの３'末端に付加する。スプライスの鋳型は、もし３'末端でブロックされていなければＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとしても働き、伸長してプライマー伸長産物を与える。この伸長反応の産物、即ち二本鎖または部分的二本鎖のいずれかである標的／スプライスの鋳型複合体は、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ転写物の合成のための鋳型として働く。次いでＲＮＡ転写物を、概括的方法用に使用、または以下のごとくＲＮＡのＤＮＡコピーの生成に使用することができる：標的配列を含むＲＮＡ転写物（「プラス」意義を有する）を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が形成されＤＮＡ合成が開始し得る条件下で、ＲＮＡ転写物の標的配列の３'端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列を有するプライマー（名目上「マイナス」意義を有する）で処理する。次いでこのプライマーを、標的配列を有するＤＮＡプライマー伸長産物を作り出す鋳型としてＲＮＡ転写物を用いるＤＮＡ伸長反応で伸長させる。ＤＮＡ標的配列を、ＲＮＡの変性または減成のいずれかによりＲＮＡ転写物から分離し、スプライスの鋳型で始まるサイクルを反復させる。所望によりプライマーは５'からプライミング配列に至る余分の配列をも有していてよい。さらにスプライスの鋳型もまた３'から複合体形成配列に至る余分の配列を有していてよい。ある態様において、上の方法を、３'からスプライスの鋳型を含む配列に至るプライマーを含む配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、１個のオリゴヌクレオチドを用いて実施することができる（例えば第１８図参照）。予備操作Ｉをさらに第１６図ないし第２０図を参考にして説明する。第１６図は、確定した３'末端を持ち、３'から標的配列に至る余分の配列を持たない標的核酸（ＤＮＡ）を示している。第一のオリゴヌクレオチドはプライマーおよびスプライスの鋳型の両者を含み、５'から複合体形成配列に至るプロモーターを有する。
【００４４】第１７図は第１６図に示されるような標的核酸（ＤＮＡ）を示している。第一のオリゴヌクレオチドは、３'端でブロックされ、したがってプライマーとして働くことのできないスプライスの鋳型を含んでいる。第１８図は第１６図および第１７図に示されるような標的ＤＮＡを示している。第１８図は、５'からその３'端のプライマー配列に至るスプライスの鋳型（プロモーターを有する）の配列を有する一個のオリゴヌクレオチドの使用を示している。即ちこのオリゴヌクレオチドは、工程（１）および（７）ではブロックされたスプライスの鋳型として、そして工程（４）ではプライマー（およびスプライスの鋳型）として働く。第１９図は、確定した５'端、ならびに、前述の複合体形成、プライマー伸長および分離工程（工程１および２）を受けて確定した３'末端を有する相補的ＤＮＡ標的を作り出す、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＤＮＡ）を示している。工程（１）および（７）のオリゴヌクレオチドは、最初の標的ＤＮＡの標的配列（ここでは名目上（＋））の３'末端部分と複合体を作るプライマーを含む。他のオリゴヌクレオチド（工程（４）および（１０））は、最初の標的に対する相補体の３'端と複合体を作る、ブロックされていないスプライスの鋳型を含む。第２０図は、確定した５'端、ならびに、前述の複合体形成、伸長および分離工程（工程（１）および（２））を受けて確定した３'末端を有する相補的ＤＮＡ標的を作り出す、３'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸（ＤＮＡ）を示している。工程（１）および（７）のオリゴヌクレオチドは、最初の標的ＤＮＡの標的配列（ここでは名目上（＋））の３'末端部分と複合体を作るプライマーを含む。工程（４）および（１０）のオリゴヌクレオチドは、最初の標的に対する相補体の標的配列の３'末端部分と複合体を作るブロックされたスプライスの鋳型を含む。
【００４５】スプライスの鋳型は、標的／スプライスの鋳型複合体が形成されＤＮＡ合成が開始し得るような複合体形成条件下で、標的核酸の３'末端と複合体を作る。（工程１）適当なＤＮＡポリメラーゼを用いて標的核酸の３'末端を伸長し、５'から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配列に対し相補的な配列を付加する。もしスプライスの鋳型の３'末端がブロックされておらず、標的核酸に対し十分相補的であるならば、このスプライスの鋳型はプライマーとして働き、その結果スプライスの鋳型の３'末端もまた伸長され得る。（第１６図）得られた標的／スプライスの鋳型複合体は部分的または完全に二本鎖である。（第１６図対第１７および１８図参照）最小限この二本鎖領域は標的核酸と複合体を形成したプロモーター配列およびプライミング配列を含む。工程２の鋳型は適当なＲＮＡポリメラーゼにより転写される。このＲＮＡポリメラーゼは各鋳型につき約５−１０００のＲＮＡコピーを生成する。第１６図ないし１８図において、生成したＲＮＡは名目上「プラス」意義であり、プロモーターの３'端から標的核酸の５'端に至る配列を含む。
【００４６】工程３のＲＮＡ産物は概括的方法にしたがって標的配列を自触的に増幅させるために使用でき、または、別法として、このＲＮＡ中の標的配列の３'末端部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を３'末端に持ち、且つ所望により５'から複合体形成配列に至る他の配列を含むプライマーと複合体を形成且つプライミングする条件下で処理することができる。このプライマーを、プライマー伸長反応において、ＲＮＡを鋳型として使用してＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより、伸長する。これにより少なくとも部分的に二本鎖の生成物が作られ、そしてこれは例えばＲＮアーゼＨによる（工程５）ＲＮＡ部分の減成または変性のような他のなんらかの方法によって、さらなる合成のために少なくとも部分的に一本鎖としなければならない。工程６で生成したＤＮＡは工程１のための標的分子として使用でき、前記のごとくスプライスの鋳型で処理して、より多くのＲＮＡおよびＤＮＡを生産させる。これらの工程を、所望の増幅レベルが生成するまで循環させることができる。スプライスの鋳型およびプライマーの適当な選択により、この新たな標的分子（工程６）が最初の分子とは異なる末端を持つことができることにも留意されたい。さらに、もしＲＮＡ由来のプライマー伸長産物が５'から複合体形成配列に至るプロモーター配列を有するならば、「プラス」意義の複合体形成配列を持ち、所望により５'から複合体形成配列に至る他の配列をも有する第二プライマーを、伸長したプライマー産物の複製に使用してＲＮＡポリメラーゼのための二本鎖鋳型を生成することができる。このように作られた鋳型はＲＮＡポリメラーゼが「マイナス」意義のＲＮＡを作ることを可能にし、このＲＮＡを、概括的方法を用いて増幅、または本明細書中の操作を用いてさらに増幅することができる。
【００４７】予備操作ＩＩ予備操作ＩＩは、自触的反応種を生み出す方法の点で予備操作Ｉと異なる。ＤＮＡ標的核酸は確定した３'末端を持つ必要が無い。ある側面においては、スプライスの鋳型の代わりに５'から複合体形成配列に至るプロモーター配列を含んでいるプライマーを使用して、このプロモーター配列をＲＮＡポリメラーゼのための鋳型へと導入する。このプライマーは、標的配列の３'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、および、５'から複合体形成配列に至るＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む配列を有する。このプライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させてプライマー伸長産物を得る。通常熱変性により鎖を分離した後、標的分子と同じ意義の第二のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、第一プライマー伸長産物に対するＤＮＡ相補物を合成する。第二プライマーは、プロモーターを含み得る５'から複合体形成領域に至る余分の配列を持ち得る。第二プライマー中にプロモーター配列が含まれることにより増幅が促進される。第二プライマーはスプライスの鋳型でもあり得る。
【００４８】予備操作ＩＩを第２１図を参考にしてさらに説明する。第２１図は、５'および３'の両方から標的配列に至る余分の配列を有する標的ＤＮＡを示している。第一プライマーはその３'末端に複合体形成配列、そしてプロモーター配列を含む５'から複合体形成配列に至る配列を持ち、標的と十分複合体を形成してプライミング機能を発揮しＤＮＡ合成を開始させる。適当なＤＮＡポリメラーゼがこのプライマーを伸長してプライマー伸長産物を与える。この鎖を変性または他の手段により分離して、プライマー伸長産物を含む一本鎖のプロモーターを生成する。第一プライマー伸長産物の標的配列の３'末端部分に対し十分相補的な複合体形成配列をその３'末端に持ち、そして所望により、プロモーター配列を含み得る５'から複合体形成配列に至る他の配列を持つ、第二プライマーを使用する。第二プライマーは工程３からのプライマー伸長産物と十分複合体形成してプライミング機能を発揮しＤＮＡ合成を開始させる。ＤＮＡポリメラーゼは第二プライマーを伸長させて第二プライマー伸長産物を与える。得られた二本鎖ＤＮＡ分子はこの時点でＲＮＡポリメラーゼのための鋳型として働き、概括的方法のためのＲＮＡ転写物を産むことができる。第２１図に示すように、生成されたＲＮＡ分子は名目上「プラス」意義であり、本発明に係る概括的方法を用いて増幅することができる。第二プライマーの複合体形成配列が工程３からの第一プライマー伸長産物の３'末端に対し相補的であり、第二プライマーが５'から複合体形成配列に至るプロモーター配列を含んでいる場合、第二プライマーはスプライスの鋳型として働き、その結果工程３からの第一プライマー伸長産物の３'末端がさらに伸長してプロモーター配列を付加し、両意義のＲＮＡ転写物を生成するＲＮＡポリメラーゼのための鋳型ができる。このようにして作られたＲＮＡ分子は概括的方法を用いて増幅することができる。
【００４９】本発明の他の側面においては、第二プライマーがスプライスの鋳型として働き、且つ５'から複合体形成配列に至るプロモーターを有し、その結果第一プライマーはプロモーターを有する必要が無い。この場合、工程２からの第一プライマー伸長産物はさらに伸長してプロモーター配列に対する相補体を生成し、こうして「マイナス」意義のＲＮＡを生産するための鋳型がＲＮＡポリメラーゼによって作られる。上記の工程を反復することにより、さらなる標的配列のＲＮＡおよびＤＮＡコピーを生産することができる。
【００５０】
【実施例】前述の方法に対する以下の実施例は本発明方法の機作および用途を説明するものである。これらは本発明を限定するものではなく、そのように解してはならない。１またはそれ以上の実施例において用いられる多くの物質は類似している。実施例の記載を単純にするために幾つかの物質を略記し、ここに説明する。「ｆｒａｇ１」と称する鋳型は、Ｂ型肝炎ゲノム由来のＤＮＡの一部分と相同性の二本鎖ＤＮＡセグメントである。これは制限ヌクレアーゼ消化によりプラスミドから切り取られ、クロマトグラフィー法によって残りの核酸から精製された。精製に続いてこのフラグメントは制限エンドヌクレアーゼで切断し、フェノール抽出を経て精製し、エタノール沈澱により所望の標的を得た。「Ｍ１３Ｌ（−）」と称する鋳型は、全配列のうちの小断片としてマイナス鎖標的配列を含む精製された一本鎖ＤＮＡ標的である。本明細書に記載される実施例においては幾つかの異なるプライマーおよびスプライスの鋳型を使用した。Ｔ７ｐｒｏ（＋）と称するオリゴヌクレオチドは、５'末端付近にＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、そして３'末端付近には、上記２種の鋳型に対するマイナス鎖標的配列の３'末端に対して相補的な配列を含む。さらにＴ７ｐｒｏ（＋）はその働きを促進するための他の配列情報をも含んでいる。Ｔ７ｐｒｏ（＋）の配列は、５’-ＡＡＴＴＴ ＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴ ＡＧＧＧＡ ＧＡＧＧＴ ＴＡＴＣＧ ＣＴＧＧＡ ＴＧＴＧＴ ＣＴＧＣＧ ＧＣＧＴ３'である。Ｔ７ｐｒｏに類似のもう一つのオリゴヌクレオチドはｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）である。これは、３'末端が末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてジデオキシヌクレオチドで伸長されている点でＴ７ｐｒｏ（＋）と異なる。Ｔ７ｐｒｏ（＋）と異なりｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）は、逆転写酵素によるＤＮＡ合成のためのプライマーとして働くことはできないが、スプライスの鋳型として働くことができる。
【００５１】ＨＢＶ（−）Ｐｒは、ｆｒａｇ１鋳型のプラス鎖とハイブリダイズしＭ１３Ｌ（−）の内部の配列と相同的なプライマーである。［ＨＢＶ（−）Ｐｒは３'からＴ７ｐｒｏ（＋）に対し相同的なプラス鎖配列に至る配列に対して相補的である。］ＨＢＶ（−）Ｐｒに相当する配列は、５'−ＧＡＧＧＡ ＣＡＡＡＣ ＧＧＧＣＡ ＡＣＡＴＡ ＣＣＴＴＧ−３'である。プロモーター領域を含むもう一つのオリゴヌクレオチドはＴ７ｐｒｏ（−）である。このプロモーター−プライマーはＴ７ｐｒｏ（＋）と同一の配列を含むが、マイナス標的に対して相補的な配列がプラス標的に対して相補的な配列で置き変わっている。Ｔ７ｐｒｏ（−）の３'末端はｆｒａｇ１のプラス鎖の３'末端に対して相補的である。Ｔ７ｐｒｏ（−）に相当する配列は、５'−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴ ＡＧＧＧＡ ＧＡＴＣＣ ＴＧＧＡＡＴＴＡＧＡ ＧＧＡＣＡ ＡＡＣＧＧ ＧＣ−３'である。ｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）と同様に、ｄｄＴ７ｐｒｏ（−）は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて３'末端をジデオキシヌクレオチドで伸長することによって作られた３'がブロックされたオリゴヌクレオチドである。ｄｄＴ７ｐｒｏ（−）はプライマーとして働くことはできないが、他の点ではＴ７ｐｒｏ（−）と類似している。
【００５２】これらの実施例で用いられる鋳型は、プライマーに対して相同的または相補的な領域および前記のスプライスの鋳型の間の実質的な配列を含む。オリゴヌクレオチド間の配列が本発明の結果として増幅されるのであるから、この配列の定量化は増幅を測定する特異的手段を提供する。この生成物は、オリゴヌクレオチドプライマーとスプライスの鋳型の間にコードされた配列に特異的なＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション技術によって検定するのが簡便である。以下に示す実施例では２個のプローブ、即ちプローブ（＋）およびプローブ（−）を使用する。プローブ（＋）はマイナス意義の生成物に対して相補的であり、プローブ（−）はプラス意義の生成物に対して相補的である。プローブ（＋）に相当する配列は５'−ＣＣＴＣＴ ＴＣＡＴＣ ＣＴＧＣＴ ＧＣＴＡＴ ＧＣＣＴＣ−３'であり、プローブ（−）に相当する配列は５'−ＧＡＧＧＣ ＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧ ＧＡＴＧＡ ＡＧＡＧＧ−３’である。本明細書中で使用されるプローブは化学ルミネセンスの標識で標識した。検定において、ハイブリダイズしたプローブ上の標識はルミノメーターで測定される光を放出する。
【００５３】以下の実施例において、相対的増幅を以下のように測定した。増幅反応混合物の試料（通常１０μｌ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）で５０μｌに希釈し、９５℃で２分間変性させた。氷上で冷却した後、およそ７５ｆｍｏｌのプローブ（＋）またはプローブ（−）、０．２Ｍ琥珀酸リチウム（ｐＨ５．２）、２１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２ｍＭＥＤＴＡ、および２ｍＭＥＧＴＡを含有するプローブ溶液５０μｌを試料に加え、混合した。次いで反応物を６０℃で２０分間インキュベートし冷却した。各ハイブリダイゼーション反応物に、飽和ほう酸ナトリウム溶液を塩酸でｐＨ８．５に調節し、次いでこのほう酸の最終濃度が０．８Ｍとなるよう希釈し、トリトンＸ−１００を最終濃度５％（ｖ／ｖ）まで加えることにより調製した溶液５００μｌを添加した。次にこの反応物を混合し、６０℃で６分間インキュベートして、ハイブリダイズしていないプローブの化学ルミネセンス標識を破壊した。このハイブリダイズしていないプローブの化学ルミネセンス標識の破壊方法は非常に特異的であって、ハイブリダイズしていないプローブのうちほんのわずかな部分のみに化学ルミネセンスが残るだけである。反応物を冷却し、残留する化学ルミネセンスを、１．５Ｍ水酸化ナトリウム２００μｌ、０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素を加えてルミノメーターで定量した。この検定において、ハイブリダイズしたプローブはルミノメーターで測定される光を放出する。ハイブリダイズしていないプローブの化学ルミネセンス標識を破壊する反応は１００％有効ではないため、一般に約３００ないし１３００相対光単位（ＲＬＵ）の範囲で存在する信号のバックグラウンドがある。同位体で標識したプローブとのハイブリダイゼーション、ブロッティング技術および電気泳動を使用する検定を含む他の多くの検定法もまた利用可能である。
【００５４】以下の実施例において使用される酵素は、セイカガク・アメリカ、Ｉｎｃ．の鳥の骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、ニュー・イングランド・バイオラブズまたはエピセンターのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズのモロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素および大腸菌ＲＮアーゼＨである。類似の活性を持つ他の酵素および他の供給源からの酵素もまた使用でき、また、異なったプロモーター特異性を有する他のＲＮＡポリメラーゼもまた使用に適している。別途記載のない限り以下の実施例において使用する反応条件は、容量１００μｌ中、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン三塩酸塩、１ｍＭｒＡＴＰ、１ｍＭｒＣＴＰ、１ｍＭｒＧＴＰ、１ｍＭｒＵＴＰ、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、０．１５μＭの各プライマーまたはスプライスの鋳型、および特記した量の鋳型および酵素である。これらの反応条件は必ずしも最適のものではなく、いくつかの系では記したように変更されている。これらのおよび他の標的配列のために他の配列が使用されており、使われているオリゴヌクレオチド配列は一例であってこれを限定する意図ではない。
【００５５】実施例１予備工程Ｉ本システムが機能することを説明するために、上記の４つのプロモーター含有オリゴヌクレオチドを各々別々に４ｆモルのターゲット（フラッグ１）を含有あるいは非含有の反応液に加えた。反応液を９５℃で２分間インキュベートしてターゲットを変性させ、ついで冷却して該オリゴヌクレオチドをターゲットにアニーリングさせた。逆転写酵素１３単位とＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加え、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。反応液の１０分の１をハイブリディゼーション法で検定した。表１に示した結果（相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ ＵｎｉｔあるいはＲＬＵ（ｓ）とｆモルで表示している）はブロックしたあるいはブロックしていないオリゴヌクレオチドがスプライス鋳型として作用し、生成物を生成することを示している。ターゲット非存在下の反応液で測定した信号はこのタイプのアッセイに於ける信号の典型的なバックグラウンドを示している。
【００５６】
【表１】

【００５７】実施例２予備工程Ｉのサイクリング増幅システムをｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒｏ（＋）でサイクルした。この実験で、標準反応液では４ａモルのフラッグＩ、ＨＢＶ（−）ＰｒおよびｄｄＴ７ｐｒｏ（＋）あるいはＴ７ｐｒｏ（＋）を混合し９５℃でインキュベートした。冷却後、逆転写酵素１３単位とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応物の１０分の１を測定のため除き、残りでサイクルを繰り返した。３回サイクルを繰り返した後、その１０μリットル部をハイブリディゼーション法にてプローブ（−）により測定した。表２に示した結果は生成物がブロックしたスプライス鋳型あるいは非ブロックしたスプライス鋳型いずれともサイクリングすることにより増幅することを示している。
【００５８】
【表２】

【００５９】実施例３予備工程Ｉの感度この実施例では非ブロックスプライス鋳型、Ｔ７ｐｒｏ（＋）とプライマー、ＨＢＶ（−）Ｐｒを用い増幅法の感度を調べた。予備工程Ｉの６サイクルを実施例２と同様にフラッグ１の量を減少しながら行った。増幅後、生成物を発明の詳細な説明の欄で述べたハイブリディゼーション法を用いて測定した。この方法を用いて４×１０-21モルのフラッグ１が検知され得た（表３参照）。
【００６０】
【表３】
予備工程Ｉの６サイクルを用いた感度ターゲット（モル） 検体（μｌ） 生成物（ＲＬＵ’ｓ）
４×１０-18 ５ ３２８３９０４×１０-19 ２０ １０５３６４４×１０-20 ２０ ３１６６４×１０-21 ２０ １９２７０ ２０ ８０６【００６１】実施例４予備工程Ｉを含む増幅下記実施例では、増幅されるターゲットはフラッグ１であった。反応液の最初のセットでは、ターゲットとスプライス鋳型の種々の組み合わせを９５℃で２分間インキュベートし、ついで冷却し逆転写酵素１３単位とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加えた。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートしついで５μｌ部の反応混合物を両プローブと測定して生成物を定量した。この測定の後、反応液を５μｌの反応液１および２、およびＴ（−）スプライス鋳型を用いて調製した。混合物を９５℃で２時間インキュベートし、冷却しついで逆転写酵素１３単位Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位を加えた。新しい反応物を混合し３７℃で２時間インキュベートした。その１０μｌ部を下記表４に示した時間で氷浴に除いた。生成物を前記のハイブリディゼーション方法を用い測定した。データは両スプライス鋳型がいずれもフラッグ１からＲＮＡを生成せしめたことを示している。データはまたＲＮＡとそのＲＮＡに相補のスプライス鋳型を含有した反応液中でより多くのマイナスおよびプラスセンス生成物が生成されたことを有意に示している。最後に、反応液１Ｂの反応速度論は生成物の幾何学的増加を示し、一方反応液２Ｂの速度論はもっと直線である。この違いは１Ｂ反応液での生成物はさらに生成物を生成する為の基質として作用していることを示し、つまりこの反応は自触反応である。
【００６２】
【表４】

【００６３】実施例５予備工程Ｉを含む増幅の反応速度論下記の実施例は本発明方法のこの態様の可能性を示す。フラッグ１の少量（１０ａモル）をＴ７ｐｒｏ（＋）、Ｔ７ｐｒｏ（−）およびＨＢＶ（−）Ｐｒの種々の組み合わせと反応に用いた。反応混合物を９５℃で２分間インキュベートしてＤＮＡターゲットを変性し、冷却しついで逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。混合後、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。その１５μｌ部を種々の時間で除き、０℃で測定まで保存した。反応生成物を定量するためにハイブリディゼーションアッセイを用いた。表５に示したデータは本発明が１つのスプライス鋳型と１つのプライマーを必要とすることを示している。しかしながら第２のスプライス，鋳型は有利である。１つのみのプライマーあるいはスプライス鋳型で得た結果は本アッセイの測定限界以下であった。先の実施例のように、反応速度論は幾何学的であり自触反応を示唆している。
【００６４】
【表５】

我々の次の研究は先行技術の方法より実質的に優れている、５．０時間以上にわたる生成物合成の継続を示した。我々はさらに感度の向上をも示した。
【００６５】実施例６予備工程ＩＩを含む増幅この実施例ではプライマーの種々の組み合わせを用いて決定した末端のないＤＮＡターゲットの５００ａモルを増幅する。ターゲットは先に引用したＭ１３Ｌ（−）であった。反応物調製にあたって、サンプルを９５℃で２分間インキュベートし、冷却しついで逆転写素１３単位を加えた。反応物をついで４２℃で１２分間インキュベートした。次に、反応物を再び９５℃で２分間インキュベートし冷却した。逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で２分間インキュベートした。反応物の１０μｌ部をプローブ（＋）およびプローブ（−）と測定した。表６に示した結果は大量の核酸の合成が２つのプライマーを用いた時のみ起こることを示している。また２つのプロモータープライマーが１つのプロモータープライマーと１つのプライマーに比べて有利なことを示している。反応液４および５における低レベル合成は元の鋳型から約１コピーのＤＮＡの合成に符合する。本システムを初期９５℃変性工程を要し、この工程は二重鎖ターゲットあるいは一本鎖ターゲットの二重鎖領域を変性し同時にまた不活性の望まれないヌクレアーゼやプロテアーゼ活性をも変性する。
【００６６】
【表６】
予備工程IIシステム反応 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ M13L(-) − − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋T7pro(+) ＋ ＋ − ＋ − ＋ ＋T7pro(-) ＋ − − − ＋ ＋ −HBV(-)Pr − ＋ − − − − ＋フ゜ローフ゛ 相対光単位(RLU's)フ゜ローフ゛(+) 862 744 762 1089 2577 96221 30501 フ゜ローフ゛(-) 473 420 483 3038 1080 15171 14863 【００６７】実施例７ＲＮＡｓｅ Ｈの作用外因性ＲＮＡｓｅ Ｈの添加が本発明の自触反応システムでの増幅を向上し得ることを示すために、いくつかの反応物を種々の量のターゲット、Ｍ１３Ｌ（−）および外因性ＲＮＡｓｅＨを０あるいは２単位用いて調製した。用いた外因性ＲＮＡｓｅ ＨはＥ.ｃｏｌｉ.由来であった。すべての反応物はＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒｏ（−）と調製した。反応物を９５℃変性処理に処し、冷却し逆転写酵素を加えた。４２℃で１２分間インキュベート後、反応物を再び９５℃で変性した。冷却後、逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび必要な場合は（表７参照）ＲＮＡｓｅ Ｈを加え、３７℃で３時間インキュベートした。その１０μｌ部を各反応混合物からハイブリディゼーション法によるアッセイのために１時間毎に除いた。表７のデータは外因性ＲＮＡｓｅ Ｈが有意に反応速度を促進し本発明の感度を上昇させることを示している。６００ＲＬＵ’ｓ以下の信号は典型的なバックグラウンドレベルとみなした。
【００６８】
【表７】

【００６９】実施例８外因性ＤＮＡの作用外因性ＤＮＡの添加が有意に本自触増幅システムを阻害し得ることを示した。外因性ＲＮＡｓｅ Ｈの添加の有利性をさらに示すために、増幅反応液を２μｇの子牛胸腺ＤＮＡの添加あるいは不添加で調製しこの阻害を示した。子牛胸腺ＤＮＡ添加の反応液では、逆転写酵素を２濃度で用い、さらにＡＭＶ ＲＮＡｓｅＨがこの阻害を克服するかどうかを調べた。また、Ｅ．ｃｏｌｉ．由来のＲＮＡｓｅ Ｈを同様の理由によりいくつかの反応液に加えた。反応液は標準反応液とは各リボヌクレオチドの濃度が２．５ｍＭまで上昇し、塩化マグネシウムの濃度が１２．８ｍＭまで上昇している点において異なる。反応液をターゲットとして１００ａモルのＭ１３Ｌ（−）を、およびＴ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒｏ（−）を用いて調製した。９５℃で２分間変性後、反応液を冷却し逆転写酵素を１３単位あるいは３９単位加え、さらに反応物を３７℃で１２分間インキュベートした。反応液を再び９５℃で変性し冷却しついで逆転写酵素１３単位あるいは３９単位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００単位あるいは３００単位およびＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈを０単位あるいは２単位加えた。３７℃で１時間インキュベート後、各反応液の１０μｌ部をハイブリディゼーションアッセイを用いて測定した。表８に示した結果は子牛胸腺ＤＮＡが外因性ＤＮＡの無い反応システムに比べ反応を９０％阻害し、逆転写酵素の追加（ＲＮＡｓｅ Ｈを伴う）は生成物増幅を有意に影響しないことを示した。さらにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの追加は生成物収量に有意な影響を示すが、それは外因性ＲＮＡｓｅ Ｈの追加による増加にほとんど関係しなかった。阻害が除去されるだけではなくまた増幅も子牛胸腺ＤＮＡとＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの無い反応に関係して５倍以上も増加した。高濃度のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈとの反応でみられた信号はハイブリディゼーションアッセイで用いたプローブ量を飽和していた。これらのサンプルを正確に定量するために、増幅生成物は測定の前に希釈する必要があった。
【００７０】
【表８】
外因性ＤＮＡによる増幅阻害に対するＲＮＡｓｅ Ｈの効果 逆転写酵素 T7 RNA E.coli. ターケ゛ット 外因性 相対 酵素 ホ゜リメラーセ゛ RNAse H DNA DNA 光 (単位) (単位) (単位) (aモル) (μg) 単位 13 100 0 0 0 458 13 100 0 100 0 55305 13 100 0 100 2 3003 39 100 0 100 2 2786 13 300 0 100 2 5734 39 300 0 100 2 6831 13 100 4 100 2 278666 39 100 4 100 2 334649 13 300 4 100 2 359101 39 300 4 100 2 375043 【００７１】実施例９総括方法による増幅このシステムは初期転写と変性を要しない。つまりターゲットのＤＮＡ補体が作られ元のターゲットはＲＮＡｓｅ Ｈで除かれる。ＤＮＡは次に第２プライマーあるいはプロモータープライマーにアニーリングしＤＮＡ合成を通してＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を作る。ＲＮＡｓｅ Ｈが活性でない場合は、始めに生成したＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドはＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を生成することなく反応を終結させるであろう。本発明方法を説明する試みの中で、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとターゲット核酸を含有したプラスミドを用い他の配列の中にターゲット配列を含有した大量の一本鎖ＲＮＡ転写体を生成した。２つの同様な反応液もまた調製した。つまりＲＮＡポリメラーゼ不含のプラスミド含有を１つ、他方はプラスミド不含でＲＮＡポリメラーゼ含有の反応液である。これらの反応液の希釈物を生成物定量のため測定した。３反応液すべての等希釈物を２つのプロモータープライマー、Ｔ７ｐｒｏ（＋）およびＴ７ｐｒｏ（−）含有の増幅反応物を調製するために用いた。表９の反応液１は６０ａモルのＲＮＡと０．６ａモルの原料プラスミドを含有していた。反応液２は０．６ａモルの原料プラスミドを含有していたがＲＮＡは含有していなかった。反応液３はターゲットを全く含有しなかった。各反応液は９５℃で変性せず、かわりに逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え３７℃で４時間インキュベートした。ハイブリディゼーション法による後のアッセイのために１時間毎に反応液の１部を除いた。表９に示したように、プラスミドとプラスミドから調製したＲＮＡを含有した反応液は大きなハイブリディゼーション信号を示した。つまりプラスミドのみを含有した反応液はＴ７ＲＮＡポリメラーゼがプラスミドからＲＮＡをつくることができるので重要な生成物を生成し、これは総括方法により両センスの核酸をさらに生成すめために利用できた。最後にターゲットを含有しない対照（反応液３）は何も生成しなかった。
【００７２】
【表９】
予備工程IV反応速度論 時間 反応液 １ ２ ３ １ ２ ３ （時間） フ゜ローフ゛(+)のRLU's フ゜ローフ゛(-)のRLU's 2 9695 1890 886 7979 1074 434 3 22266 2819 824 15018 1487 491 4 33863 4571 828 16540 2310 556 反応液１：プラスミド＋ＲＮＡ 反応液２：プラスミド 反応液３：ターゲット無し【００７３】実施例１０総括方法による増幅下記の実験は他の初期化方法が本発明において第１プライマーの伸展と決定した末端の無いＤＮＡターゲットの変性工程の必要性を緩和しうることが可能かどうかを決定するために行った。この実験では既知量のターゲットを表１０に示したように第１逆転写酵素の存在下あるいは非存在下で増幅した。一度にすべての酵素を加える増幅時間は４時間であった。使用したターゲットは正常生理食塩水に希釈したＭ１３（＋）であった。Ｔ７ｐｒｏ（＋）とＴ７ｐｒｏ（−）を使用した。２５μｌの各希釈液に２５μｌの０．１Ｎ ＫＯＨを加えた。サンプルを９８℃で１０分間インキュベートしついで冷却した。各サンプルを１００μｌにして、最終濃度を５０ｍＭトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩基、４０ｍＭグルタミン酸、２５ｍＭ水酸化カリウム、１２．８ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭスペルミジン三塩酸塩、２．５ｍＭ各リボヌクレオチドトリホスフェート、０．２ｍＭ各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、および０．１５μＭ各プライマーとした。標準プロトコール管に１３単位の逆転写酵素を入れ４２℃で１２分間、ついに９５℃で２分間インキュベートし冷却した。ついですべての試験管に１３単位の逆転写酵素、１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび０．５単位のＲＮＡｓｅ Ｈを加えた。反応液を３７℃で４時間インキュベートしその１０μｌ部をケミルミネッセンスプローブアッセイにて測定した。表１０の結果は短縮プロトコールを用いた場合にいくらかの増幅は明らかであることを示している。観察された増幅のレベルは有意に標準プロトコールを用いた場合よりも低度であるが、これは同程度に有効になるように開発され得るし、あるいは有意なレベルのターゲット核酸が存在する場合には有用になり得る。
【００７４】
【表１０】
第１プライマー伸展のない増幅ターゲット モル プロトコール ＲＬＵ’ｓ Ｍ１３(＋) ３．８Ｅ−１７ 標準 ２２９５４５１ 〃 ３．８Ｅ−１９ 〃 ２３７４４４３ 〃 ３．８Ｅ−２１ 〃 ２３０２２７ 無 ０ 〃 ３０３７Ｍ１３(＋) ３．８Ｅ−１７ 短縮 ２４７５５７４ 〃 ３．８Ｅ−１９ 〃 ２７２０９ 〃 ３．８Ｅ−２１ 〃 １７１４４ 無 ０ 〃 １６７９これらのデータのもっとも予想される説明はＴ７ＲＮＡポリメラーゼが完全には特異的ではないということである。ターゲット領域の少数のＲＮＡコピーを生じる低レベルのでたらめなＲＮＡ合成が存在する。これらのコピーは標準方法により増幅される。
【００７５】我々の初期の研究はある種のプライマーセットとターゲットで外因性ＲＮＡｓｅ Ｈなしで優れた増幅を示した。反応のメカニズムを明らかにする我々の次の研究で、広範囲のターゲットに本方法を有効的に適用することが可能になった。我々はここに増幅に外因性ＲＮＡｓｅ Ｈを用い、また逆転写酵素を伴うＲＮＡｓｅ Ｈ活性に呼応する方法を開示しその権利を主張する。我々はＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅは常に増幅を改良するわけではないので日常的に添加されるべきではないことを発見した。我々はＲＮＡｓｅ Ｈのいくつかの形態はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのどこを切断するかについての特異的な配列であることを確定した。増幅反応において、我々は完全な長さの生成物ＤＮＡ中のプロモーター含有プライマーを検出しなかった。２つのプロモータープライマーを用いた態様ではプロモータープライマーのうちただひとつのみが完全な長さの生成物ＤＮＡに測定可能な限りにおいてとり込まれている。本分野の技術者により自明なすべての他のメカニズムは両プライマーを含有する完全な長さの生成ＤＮＡを示唆している。これらの発見はＲＮＡｓｅ Ｈが増幅の間に合成された主要ＲＮＡ種を十分には分解していないという可能性に因ると思われる。これらの発見に基づいて、ＲＮＡｓｅ Ｈ配列特異性に関する我々の発見を組み入れた新しい増幅メカニズムがここに提示される。新規で有用なプロモータープライマー設計標準を開示する。さらには、ターゲット核酸配列の複数コピーを合成する新規な方法をここに主張し、これは１）選択されたＲＮＡｓｅ Ｈによる分解にさらされた後にプライマー伸展生成物を形成する能力を残すように位置しているＲＮＡターゲットの部分と複合化するＲＮＡターゲット配列の部分に相補であるプライマーを選択し；
２）すべてのメッセンジャーＲＮＡが実質的にＲＮＡｓｅ Ｈの分解を通して二重鎖から除かれる領域においてＤＮＡと複合化するプライマーの伸展により得られるＤＮＡの部分に相関であるプロモータープライマーを選択し；
３）ＲＮＡターゲットとプライマー、プロモータープライマー、ＲＮＡｓｅＨ、逆転写酵素をコンバインし、ＲＮＡの複数コピーとそのＲＮＡに相補のＤＮＡの複数コピーを形成することを特徴とする。ここで開示の新規な方法はＲＮＡターゲット配列と同じ極性(あるいはセンス)のＤＮＡの実質的に等数のコピーを作らない。
【００７６】この工程は新規なターゲットサイトのための優れたプロモータープライマーとプライマーの設計を可能にする方法を提供する。我々はプロモータープライマーとプライマーのそのような組み合わせおよびそのための設計標準をここに開示し主張する。ここで開示のメカニズムはＲＮＡ鎖の転写のための新規な反応中間体を包含する。この中間体は二重鎖ＤＮＡプロモーター領域を含むＲＮＡとＤＮＡの二重鎖複合体である。我々の知る限りこのようにものはかつて文献に記載された事はない。実にどの先行技術システムも、特にグアテリ、Ｊ．Ｃ．らの８７ＰＮＡＳ １８７４〜１８７８（１９９０）もまたジンゲラス、Ｔ．Ｒ．らのＰＣＴ出願番号８８／１０３１５号のいずれもＲＮＡｓｅ Ｈ分解サイトの位置に基づいてプライマーとプロモータープライマー配列を適切に選択していない。このように、本方法は新規でありどの先行開示に対しても自明なものではない。ＲＮＡｓｅ Ｈ配列特異性の重要さと反応メカニズムの理解の認識は本ターゲット増幅法を広範囲のターゲット配列に有効的に適用ための鍵である。さらに、従来同業者はＲＮＡｓｅ Ｈは十分にまた組織的にＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を分解しているとしていた。
【００７７】Ｉ：増幅法のメカニズム増幅効率を両先行方法と調べると使用したプライマーセットでのわずかな変動を伴う増幅効率に大きな変異が明らかとなった。先行技術が一般に受け入れている反応方法は我々の見るところでは、なぜ１つのプライマーセットが他よりずっと優れて作用するのか合理的な説明をしていない。先行技術方法を用いて増幅法を改良する試みでは満足出来る結果が得られなかった。ＤＮＡ鎖を初期化する能力での差がプライマーセット効率でみられた差の原因かどうか知るためにプライミングの有効性を調べた。プライミング効率と総体的増幅の間に相関性はみられなかった。プライマーセットの自己相補構造と交差相補構造を形成する能力の分析によりプライマー効率に於ける差はこれらのファクターに単に原因があるのではないと判明した。我々はまたＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの添加が均一に増幅を改良するのではないことを発見した。ここで提示するたデータが示すように、得られた結果はターゲットからターゲットで、またプライマーセットからプライマーセットで変化する。添加するＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの量は非常に重要であり狭い特定の範囲内に保たなければならない。与えられたターゲットとプライマーセットと共に、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの添加は逆転写酵素がトリ骨髄芽球細胞症ウイルス（ＡＭＶ）由来のものでありモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）でない場合には有利である。これらの結論を示すデータを下記に記す。初期の研究ではＡＭＶ逆転写酵素はウイルス複製の間に形成されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを消化する時に比較的大きなフラグメントを残すことが示唆された。これらのフラグメントはプライマーとして第２ＤＮＡ鎖の合成を初期化する。我々はＡＭＶとＭＭＬＶ ＲＮＡｓｅ Ｈ活性の配列特異性の証拠があるという発見をここに報告するものである。
【００７８】反応メカニズムを明確にするために、個々のプライマーの末端を32Ｐで標識し、各プライマーのＤＮＡ生成物へのとり込むをポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べた。一般的に受け入れられている先行技術メカニズムによれば、両プライマーは完全な長さのＤＮＡ生成物にとり込まれていることになる。しかしながら我々の実験では増幅の間に合成された主要ＲＮＡ種に相補するプライマーのみが完全な長さの生成物にとり込まれていた。主要ＲＮＡ鎖と同じ極性を持つプライマーは決して完全な長さのＤＮＡ生成物にとり込まれなかった。事実、それは全く小さいままで残った。これらの結果は多数の異なるターゲットとプライマーセットで確認された。プライマーの一つの伸展を検出出来なかったことから、完全な二重鎖ＤＮＡ中間体は増幅の間に蓄積しないこと、また自触増幅には要しないことが示唆された。これらの観察はＲＮＡｓｅ Ｈの可能な配列特異性を考慮した本発明の増幅システムのメカニズムを示唆する。本メカニズムを大まかに図４に示す。実験により酵素がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを特殊な切片に切断することが判明した。さらに、切断サイトの位置は特異な領域にあることが判明した。メカニズムを確認するために、我々のＴ７ｐｒｏ+／Ｔ７ｐｒｏ-ターゲットとプライマーセットの組み合わせから生じたプラス鎖ＲＮＡを含有したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを調製した。32Ｐ標識ＲＮＡをメッセンジャーＤＮＡにハイブリッドし、ＡＭＶ逆転写酵素（付随するＲＮＡｓｅ Ｈ活性を含有している）とインキュベートし反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した（図２６）。フラグメントの大きさから数個の小さな切片が生成しこれらは１つあるいは両方の末端の近くを切断して生成したことが判明した。分子の内部部分は切断されなかった。この実験は酵素が使用した反応条件下で配列あるいは構造特異性を持つことを示している。結果は図２２〜２５の反応メカニズムと完全に一致する。
【００７９】切断サイトがどこで起こるかを決定するためにさらに実験を行った。複数切断サイトはプロモーター含有プライマーと一致する領域にあり他のプライマーを結合する領域には無いことが望ましい。ＲＮＡ末端を個々に標識し消化生成物を分析することにより、使用した条件下で切断はＲＮＡの５’末端のみに検出されることが判明した。これは図４のメカニズムと一致する。ＡＭＶおよびＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮＡｓｅ Ｈ活性が切断する配列を調べるために配列決定実験を行った。特異的に各々の酵素で切断されることにより配列は識別される。予測通り、２つの酵素の配列特異性は異なりこれはあるプライマーセットは一つの酵素とまた別のプライマーはもう一つの酵素とより機能することを説明すると思われる。我々の反応条件下でＭＭＬＶ酵素で得た配列特異性は文献に記載の別の反応条件下でのものと一致しない。これは特異性は反応条件により影響され得ることを示唆している。増幅メカニズムに於けるＲＮＡｓｅ Ｈの役割の詳細に調べるとｃＤＮＡコピーからの転写を指示するプロモーターの完全な除去は必要でなく、あるいは新規の転写活性鋳型の形成に望ましいという我々の発見に達した。つまりいくつかの適用に於いては、もしＲＮＡｓｅ Ｈがプロモータープライマーが第１鎖ｃＤＮＡ生成物にアニーリングする上でさらにサイトに選択的であれば、またもし他のプライマーが転写物にアニーリングするのにもっと阻害しなければ、逆転写酵素固有のＲＮＡｓｅ Ｈ由来の非常に低レベルのＲＮＡｓｅ Ｈ活性でさえ効果的な増幅に十分であろう。
【００８０】Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈはレトロウイルス酵素よりも伝えられるように特異的でないので、特にもしこのプライマー、ターゲット、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈ、および酵素活性に影響を及ぼす成分の濃度が慎重に釣り合っていない場合には、非プロモーター含有プライマーが結合している領域に割って入るかもしれない。我々の見るところ、これらの結果はＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの使用を商業的な分野での適用に適しなくしている。逆転写酵素ＲＮＡｓｅ Ｈが所望の領域で切断しない場合や適した条件下で切断しない場合には、異なる特異性を持つ他のＲＮＡｓｅ Ｈ活性の添加は有効である。例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素での研究により、この酵素はＡＭＶ酵素よりもサンプルＤＮＡによる阻害に敏感でないことが判明した。多くのシステムに於いてこれは最良の様式である。新しいプライマーセットが設計され、模型と我々が今までに得たＲＮＡｓｅＨ配列特異性情報に基づいて開示される。メカニズムや配列特異性の知識がない以前に設計されたもので得たものよりも、有意に優れた合成がこれらのプライマーセットから得られた。ここに記載の本発明は特異的なターゲット領域の為の機能的なプライマーセットの設計を可能にする。我々が開示する新しいメカニズムはＲＮＡ鎖の転写の為の新規な反応中間体を包含する。この中間体はＲＮＡとＤＮＡの二重鎖複合体であり、これはまた二重鎖ＤＮＡプロモーター領域を包含する。我々の知識ではこの反応は述べた通りどの先行技術とも異なる。反応メカニズムを理解することはこれらのターゲット増幅工程を使用する上で重要である。ＲＮＡｓｅ Ｈ配列特異性の重要性を認識することは本ターゲット増幅法を広範囲のターゲット配列に有効的に適用する上での鍵である。一方、プロモータープライマー設計の実験的研究は困難で経費がかかり、また成功の頻度も低くて本発明をこの分野での貴重な進歩とする。
【００８１】Ａ．ＲＮＡｓｅ Ｈ活性濃度の狭範囲Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈを用いた増幅システムは、先に述べたように大量の合成が特殊なターゲットとプライマーセットで得られるために当初は好ましい態様とみなされていた。またＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ ＨはサンプルＤＮＡによる阻害を克服するのを助長する上で有用であると発見された。しかしながら、反応の分析によりＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの添加は多くの場合に増幅に不利益であることが判明した。さらに過剰量あるいは過小量のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの存在は有害なのでその添加量は狭い範囲内だ注意深く調整されなければならない。本方法を実用的に商業上適用するにあたっては、特に酵素が保存にあたって完全に安定でないかも知れないためにこれは重大な障害である。さらにＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの使用によりこのシステムに過大な経費と煩雑さが加わる。経費は多くの商業的適用にとっては禁制である。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの使用はアッセイをさらに複雑にし、その代わりに研究開発経費を上昇せしめこのアッセイを広範囲の商業的適用にとって繊細すぎるものとしてしまう。このようにアッセイメカニズムに対する我々の説明は技術的に実行可能（ターゲットサイトへの適用性）でまたより安価でより丈夫な工程である点において広範囲の使用に適した方法に帰着した。初期の実験でＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの添加が増幅上昇を起こすことが判明したので、血清やヒトＤＮＡを含有したサンプルでの増幅システムの実行に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの効果をいくつかの実験で調べた。
【００８２】実施例１１Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈ濃度の最適化血清での最適増幅に必要なＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈ量を決定するために実験を行った。下記の実験はＴ７ｐｒｏ+／Ｔ７ｐｒｏ-プライマー対での０、０．２５、０．５および１単位のＲＮＡｓｅ Ｈ存在下で増幅を比べた。ＨＢＶ-ヒト血清のレベルまで希釈したＨＢＶ＋血漿あるいはＨＢＶ-血清を単独で調べた。１０μｌの血清を当量の０．１Ｎ ＫＯＨに加え蒸発を防ぐために油層で覆った。サンプルを混合し９５℃で加熱し室温まで放冷した。サンプルを９０μｌの反応容積にして最終濃度を５０ｍＭトリス酢酸ｐＨ７．６、２０．８ｍＭＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレトール、２ｍＭスペルミジン塩酸塩、０．１５μＭ各プライマー、６．２５ｍＭ ＧＴＰ、６．２５ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＵＴＰ、２．５ｍＭ ＣＴＰ、０．２ｍＭの各ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、および１３単位のＡＭＶ逆転写酵素とした。サンプルを混合し３７℃で１２分間加熱しついで９５℃まで加熱してさらに室温まで冷却した。１３単位のＲＴと１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え反応混合物を３７℃で３時間インキュベートする。２５μｌの各反応混合物を測定した。データよりＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの濃度はこのシステムの各反応毎に０．２５単位のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈ付近を中心とした狭い最適範囲にあることが判明した。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈは使用が困難ではあるけれどもいくらかのＲＮＡｓｅＨ活性の添加はこの実験で有用である。
【００８３】
【表１１】
ターゲット(モル) ＲＮＡse Ｈ（単位） 実測ＲＬＵ ５×１０-20 ０ ５６７８０９ ５×１０-22 １８０４１ ５×１０-23 ２９３８ ０ １６３４ ５×１０-20 ０．２５ １１５３３６６ ５×１０-22 ７３２１０９ ５×１０-23 ５５６６ ０ １４２３ ５×１０-20 ０．５ １００１９０４ ５×１０-22 ２９５９６ ５×１０-23 １７９３ ０ １８９８ ５×１０-20 １．０ ６１０４８５ ５×１０-22 １３０２６ ５×１０-23 ４０６２ ０ １６６２【００８４】実施例１２つぎにＨＩＶプライマー対の最適増幅に必要なＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈの量を８μｇのヒトＤＮＡを含有した溶解産物の存在下または非存在下で測定した。２×１０-18モルのウイルスターゲットが各反応混合物に存在した。ＤＮＡターゲットは５０ｐモルの各プライマーと４０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２０．８ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭスペルミジン塩酸塩および表１１に示したヌクレオチドトリホスフェートの存在下混合し、９５℃まで加熱し室温まで冷却した。１３単位の逆転写酵素を加え反応混合物を４２℃まで１２分間加熱し、９５℃まで加熱し再び室温まで冷却した。１３単位のＡＭＶ逆転写酵素と１００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え３７℃で３．５時間加熱した後測定した。
【表１２】
溶解産物 ＲＮＡｓｅ Ｈ ＲＬＵ− ０ 単位 ８,４００− ０．５ ２３９,０００− １．０ ４６８,０００− １．５ ４９８,０００− ２．０ ４３９,０００− ３．０ ２０,１００− ４．０ ５,８０６＋ ０ １,６６７＋ ０．５ ９２４＋ １．０ ６,６３５＋ １．５ ５７９＋ ２．０ １３,４００＋ ３．０ １７,８００＋ ４．０ ９,１５２これらの結果はＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈレベルは過剰量のＥ．ｃｏｌｉ．ＲＮＡｓｅ Ｈが増幅に有害なので注意深く調整されなければならないことを示している。さらに最適濃度は非特異ヒトＤＮＡの存在により変化し、ヒトＤＮＡによる阻害はすべてのＲＮＡｓｅ Ｈレベルで重大であった。
【００８５】実施例１３大腸菌ＲＮＡseＨの、ＨＩＶ領域２と称する第２領域の増幅への効果を調べた。以下のデータは大腸菌ＲＮＡseＨが狭い濃度範囲で増幅を促進することを証明している。ＨＩＶ領域２プライマーは表１２に関して述べたように、種々の濃度の大腸菌ＲＮＡseＨの存在下で増幅された。各反応混合物１０μlを分析し、必要に応じて希釈した。生成した標的（ターゲット）を定量するために、シグナルを標準曲線と比較した。
【表１３】
ＲＮＡseＨ 標的（pmol) 生成物(pmol) 増幅の観測値 - 0 0 0 - 1.67 × 10-10 2.14 1.3 × 1010 0.2 U 1.67 × 10-10 0.17 1.0 × 109 0.4 U 1.67 × 10-10 0.18 1.1 × 109 1.2 U 1.67 × 10-10 0.012 7.6 × 107 - 1.67 × 10-8 16.0 9.6 × 108 0.2 U 1.67 × 10-8 20.6 1.2 × 109 0.4 U 1.67 × 10-8 0.14 8.5 × 106 1.2 U 1.67 × 10-8 0.15 9.0 × 106【００８６】これらのデータは、ガテリら（Guatelli， 87 PNAS 1874-1878）の説とは逆に、大腸菌ＲＮＡseＨを加えなくとも増幅が達成され得ることを示している。本発明者らは幾つかの標的領域で大腸菌ＲＮＡseＨとＭＭＬＶ逆転写酵素とを用いて調べた。実施例１２に記載の条件下、ヒトＤＮＡ８μｇの存在下または非存在下、３時間の自己触媒工程の反応を行った。ＨＩＶ領域１、３および４からのプライマーセットを試験した。使用するウイルス性鋳型は、ハイブリダイゼーションアッセイでＲＬＵが直線領域にあるよう選択した。ＭＭＬＶ逆転写酵素を、開始時４００Ｕ、増幅期８００Ｕで用いた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼも含有させ、大腸菌ＲＮＡ １Ｕを指示の通り加えた。最上欄の＋ＲＮＡseＨ、−ＲＮＡseＨの項の下の値はアッセイ反応液１０μlに関して得たＲＬＵ値である。
【００８７】
【表１４】
標的領域 標的(mol) ヒトDNA +RNAseH -RNAseHHIV領域1 2 × 10-21 - 54,900 137,000HIV領域1 2 × 10-21 8 μg 15,100 13,800HIV領域3 2 × 10-20 - 96,100 391,000HIV領域3 2 × 10-20 8 μg 124,000 246,000HIV領域4 2 × 10-21 - 20,400 107,000HIV領域4 2 × 10-21 8 μg 56,000 8,800ＤＮＡの存在下、大腸菌ＲＮＡseＨは明らかにＨＩＶ領域４プライマーによる増幅を刺激した。試験した大多数の場合、ＭＭＬＶ逆転写酵素単独使用の場合の増幅は、少なくとも、ＭＭＬＶ逆転写酵素と大腸菌ＲＮＡseＨの併用時と同様に良好であった。ガテリら（Guatelli， 87 PNAS 1874-1878）の説とは逆に、効率的な増幅は大腸菌ＲＮＡseＨを必要としなかった。
【００８８】逆転写酵素の配列特異性本発明者らは、あるプライマーセットは、ＡＭＶ逆転写酵素と併用するとその作用が最良となるのに対し、他はＭＭＬＶ逆転写酵素との併用、またはいずれか１つの逆転写酵素に大腸菌ＲＮＡseＨを添加した時その作用が最良となることをも見いだした。プロモータープライマーおよびプライマーまたは大腸菌ＲＮＡseＨの起源を少し変化した場合の、増幅効率の変動の観測値は本発明機構を支持している。これらの発見を支持する詳細なデータを以下に記載する。ＭＭＬＶ逆転写酵素はクローン化されており、３００単位／μl以上の高濃度でＢＲＬ（Bethesda Research Labs)やＵ．Ｓ．Biochemicalsから購入することができる。注意すべき点は、ＭＭＬＶ逆転写酵素の天然の核酸鋳型に対するＤＮＡ合成活性は、ＡＭＶ逆転写酵素との比較で、約１０倍高い単位濃度で得られることである。単位活性における類似性の欠如は、ホモポリマー鋳型（単位活性アッセイに使用）を用いた場合と、ヘテロ重合核酸鋳型を用いた場合に酵素が異なる相対活性を示すことによる。本発明における増幅反応において、種々の濃度のＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて試験した。これらの結果の例を以下の表に示した。ＡＭＶ逆転写酵素試料の場合、開始段階で逆転写酵素を１４Ｕ用い、増幅段階で５６Ｕ用いた。開始段階および増幅段階におけるＭＭＬＶ逆転写酵素量を測定した。ＨＩＶ領域２プライマー各１５pmolを用い，ＮaＣlの代わりに２５mＭ ＫＣlを用いる外は、実施例１２記載のインキュベーション条件を用いた。Ｔ７ポリメラーゼ４００Ｕを増幅期間中に用いた。ヒトＤＮＡ８μｇの存在下または非存在下に行った結果を以下の表に示す。ＡＭＶまたはＭＭＬＶで示した欄は、それぞれＡＭＶ逆転写酵素またはＭＭＬＶ逆転写酵素による増幅作用の結果を示す。数字は開始、および自己触媒期間のそれぞれにおいて用いた値（単位）を示している。表中の値はＲＬＵである。増幅生成物は希釈されておらず、用いた条件下で約２５０，０００ＲＬＵを与えるに十分な濃度のハイブリダイゼーション標的でシグナルが飽和するので、＞２００，０００ＲＬＵの値では増幅程度が有意に低く見積もられているかもしれない。
【００８９】
【表１５】
ヒト AMV MMLV MMLV MMLV標的（mol） DNA 14/56 400/400 400/600 400/800 0 - 495 470 - 3,8001.6 × 10-22 - 278,000 77,000 - 5,6211.6 × 10-20 - 292,000 278,000 - 269,000 0 + 474 547 488 1,3521.6 × 10-20 + 10,200 62,700 205,000 149,000ヒトＤＮＡの非存在下におけるＭＭＬＶ逆転写酵素の指令による増幅の感度はＡＭＶ指令による増幅よりも有意に低いが、外因性ＤＮＡの存在下ではＭＭＬＶは非常に有効であった。
【００９０】ＨＩＶ領域２の高レベル増幅を観察した後、本発明者らはＡＭＶ逆転写酵素を用いてヒトＤＮＡの存在下、他の標的領域を試験した結果、これらの領域の最良の増幅には大腸菌ＲＮＡseＨがなお必要であることを見いだした。次いで、大腸菌ＲＮＡseＨの非存在下、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて各領域の増幅を試験し、ＡＭＶ逆転写酵素＋大腸菌ＲＮＡseＨを含有する反応での増幅と比較した。これらの結果の幾つかを以下の表に示した。実施例１２の記載に従ってＨＩＶ領域３および４プライマーを用いた（５０pmol／反応）。ＡＭＶ逆転写酵素を用いる反応では開始に際して１４Ｕ用い、増幅に際して逆転写酵素５６Ｕ＋大腸菌ＲＮＡseＨ１Ｕを用いた。ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いる反応では開始に際して４００Ｕ加え、増幅に際して８００Ｕを加えた。４時間の増幅インキュベーション期間中、全反応混合物中にＴ７ポリメラーゼ４００Ｕを存在させた。表中の値は増幅反応混合物１０μlを用いて行った、ホモジーニアスプロテクションアッセイで得たＲＬＵ値である。アッセイ前に反応混合物を希釈した場合もある。
【００９１】
【表１６】

ＨＩＶ領域２で観察されたように、ヒトＤＮＡの非存在下ではＭＭＬＶによる増幅はＡＭＶ逆転写酵素＋大腸菌ＲＮＡseＨによる増幅よりも有意に低いが、ＤＮＡの存在下ではＭＭＬＶによる増幅は少なくともＡＭＶ逆転写酵素＋ＲＮＡseＨ.４２によって達成される増幅と同じく良好であった。
【００９２】実施例１４ ＨＢＶゲノムの第２領域のためのプライマー以下の実験はＨＢＶゲノムの２つの領域に向けたプライマーセットを用いて行われた。データはプライマーセットがＡＭＶ ＲＴと同程度には増幅しないことを示している。実験はＨＢＶ陰性血清で希釈した陽性血漿を用い、実施例１１記載のごとくに行った。増幅反応混合物１０μlをハイブリダイゼーションアッセイに付した。
【００９３】
【表１７】

これらの結果を標準的なプロトコールを用いる追加実験で確認した。領域１プライマーはこれらの実験でも高いＲＬＵであり一致した結果を示した。
【００９４】対照的に、同じ２つのプライマー対の増幅にＭＭＬＶ酵素８００Ｕを用いると、 下記表に示すように反対の効果が認められた。
【表１８】
ＲＬＵ観測値標的（mol） 領域１ 領域２ 9.6 × 10-20 37,278 1,067,9519.6 × 10-22 1,858 40,826 0 1,010 1,646この実験では、各反応混合物中に血清５μlが含有されていた。このように、各プライマー対の増幅能力は増幅期間中存在する逆転写酵素の影響を受けた。鋳型配列の利用可能性等のファクター、プライマーの特異的ハイブリダイゼーション能力、およびＲＮＡ合成の効率に対する逆転写酵素の影響は有意でない。ＲＮＡseＨの特異性や活性、およびＤＮＡのポリマー化活性にも影響しないであろう。
【００９５】下記のデータは、適当な条件下でプロモーター−プライマーを組合せて用いると増幅が増大することを例示している。この実験は、全増幅反応をハイブリダイゼーション法で分析したことを除き、表１１の項で述べたと同様に行った。
【表１９】
標的分子 標的（mol） ＲＬＵ観測値 1200 2 × 10-21 1,094,177 120 2 × 10-22 442,137 12 2 × 10-23 24,053 1.2 2 × 10-24 8,654 0 0 1,828【００９６】実施例１５ ＡＭＶ逆転写酵素とＭＭＬＶ逆転写酵素の比較以下の実験はＭＭＬＶ（３００単位）またはＡＭＶ（３９単位）を用いてＣＭＬ患者の染色体に発見されたＢＣＬ−２染色体転座主要ヒト染色体ブレイクポイントｔ（１４；１８）のためのプライマーの増幅に関する比較実験である。各酵素について、大腸菌ＲＮＡseＨの作用を評価した。増幅は２４mＭ ＭgＣl2およびプライマー各５０pmolを用いる外は実施例１２記載の方法に従って増幅を行った。溶解液（リゼート）を含有する反応液には白血球由来のＤＮＡ４μｇが存在していた。全反応混合物はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ３００単位とインプット２本鎖ＤＮＡ標的１０amolを含有していた。【００９７】
【表２０】

結果はＭＭＬＶおよびＡＭＶ ＲＴが、特に大腸菌ＲＮＡseＨの非存在下では、同程度にこのプライマーセットを増幅しないことを示すものである。ＡＭＶ逆転写酵素を含有する反応混合物に大腸菌ＲＮＡseＨを加えると増幅が顕著に増大する。このことはこれらの反応ではＲＮＡse活性が制限されていることを示唆するものである。逆に、ＭＭＬＶ ＲＴを含有する反応混合物に大腸菌ＲＮＡseＨを加えても増幅は促進されなかった。これらのデータによっても、以前に、ＭＭＬＶ ＲＴには、大量の非特異的ヒトＤＮＡの存在下での有意な増幅を維持する能力があるという指摘が確認された。
【００９８】Ｃ．１つのプライマーは完全長さの生成物には取り込まれない本発明者らの最も重要な発見の１つは、主ＲＮＡ種と同じ極性を持つプライマーが検出可能な程度には完全長さの生成物に取り込まれないということであった。このことを証明するために、個々のプライマーを32Ｐで末端ラベルし、各プライマーのＤＮＡ生成物への導入をポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた。本発明者らは、当初、両プライマーが共に完全長さのＤＮＡ生成物に取り込まれると予測していた。しかしながら、プロモーターを含有するプライマーは完全長さのＤＮＡ生成物中に見い出すことができなかった。実際、それは非常に小さいままであった。これらの結果は多くの異なる標的およびプライマーセットによって確認された。本発明者らの方法を以下に説明する。自己触媒期間に蓄積されたｃＤＮＡの種を同定するためにプライマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで32Ｐラベルし、増幅反応混合物に打ち込んだ（スパイクした）。以下の実施例は、１つの極性のプライマーが増幅の間に優先的に蓄積され、その蓄積される鎖は常に、自己触媒中に合成された優勢なＲＮＡ種と相補的な鎖であることを示している。図２６は増幅期間中に32ＰラベルＨＩＶ領域２が取り込まれたという結果を示す。このプライマーセットから、（＋）センスの２１４塩基からなるＲＮＡが得られた。ＲＮＡに相補的なプライマーは、標的配列の存在下、２３５および２１４塩基の主バンドに取り込まれた（レーン３）。標的非存在下では完全長さの断片は見られなかった（レーン４）。２１４塩基の断片はＲＮＡと同長のｃＤＮＡを表しているが、２３５塩基断片はＲＮＡ＋Ｔ７プロモーター配列（２１塩基）を表している。逆に、このプロモータープライマーは標的存在下、または非存在下における完全長さＤＮＡ生成物には観察されなかった（それぞれレーン１および２）。
【００９９】図２６のレーン５−８は増幅期間中の32ＰラベルＨＢＶ領域１プライマーの導入結果を示している。これらはＴ７pro+およびＴ７pro-として知られている。このプライマーセットは２極性を有する１３２塩基ＲＮＡを産生し得るが（＋）鎖ＲＮＡが優勢である。優勢なＲＮＡに相補的なＴ７pro-は本発明で提供した機構の通り、１３２塩基および１５３塩基の断片に取り込まれた（レーン７、（＋）標的；レーン８、（−）標的）。１５３塩基断片はＴ７pro+のＲＮＡ＋Ｔ７プロモーター配列（２１塩基）を表している。逆に、32ＰラベルＴ７pro+プライマーはいずれの長さの断片にも取り込まれなかった（レーン５、（＋）標的；レーン６、（−）標的）。ゲル電気泳動で分析した反応混合物をＨＰＡによって分析し、優勢なＲＮＡと同じ極性のｃＤＮＡを別の方法でも検出できるかを調べた。作成された鎖の相対比率を決定するためにプラスおよびマイナス鎖プローブを用い、各反応混合物の一部をＲＮＡseＡで処理してＲＮＡとＤＮＡの比率を求めた。結果を以下に示す。
【０１００】
【表２１】
プローブの極性 プライマーセット ＲＬＵ ＲＬＵ 未処理 ＲＮＡseＡ（−） ＊ＨＩＶ領域２ 679,182 1,037 ＊ＨＩＶ領域２ 453,675 1,464（＋） ＊ＨＩＶ領域２ 32,922 1,094,249 ＊ＨＩＶ領域２ 39,494 655,595（−） ＊ＨＢＶ領域１ 567,110 4,854 ＨＢＶ領域１ 671,656 4,210（＋） ＊ＨＢＶ領域１ 56,550 303,160 ＨＢＶ領域１ 77,983 450,332＊＝32Ｐラベル(＋)鎖プライマー、その他、32Ｐラベル(−)鎖。
これらの結果は完全長さの生成物がプロモータープライマーで観察されない場合でも増幅が十分に作動していたことを示すものである。これらの結果は従来の研究において観察されたこと、即ち、１個のセンスプローブで観察されるシグナルの大多数はＲＮＡに由来していること、そして相補的な鎖シグナルは予測通りＤＮＡに由来する、ということに関連している。両極性のＲＮＡから作成されたＨＢＶ領域１プライマーセットについてさえ、このことは正しい。【０１０１】Ｄ．酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの特異的部位を切断するということを示す機構の確認上記の実験および観察結果に基づいて、ＲＮＡseＨ中にあり得る配列特異性を考慮した増幅システムを図２２〜２５に示した。この機構をサポートする上で重要な要素はＲＮＡseＨ配列特異性であることから、酵素が実際にＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを特異的な部位で切断するということを示す必要がある。しかもこの切断部位は、良好な増幅のためには、モデルにしたがって、特異領域内に存在していなければならない。この疑問を解くために、既知の標的とプライマーセットの組み合わせで生成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリドを調製した。ＲＮＡを32ＰでラベルしＡＭＶ逆転写酵素（その関連ＲＮＡseＨ活性を含有する）と一緒にインキュベーションし、反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。結果は、新規な反応機構と完全に一致していた。即ち、断片のサイズは、数個の小片が生成しこれらは１方または両方の端付近で切断されて生成したものであることを示していた。分子の内部領域は切断されていなかった。この実験で、用いた反応条件下で酵素が配列または構造特異性を有することを確認した。提供した機構においてはプロモーター含有プライマーが結合する領域で複数の切断が起きることを必要とするので、切断の起きる位置を決定するためにさらに実験を行った。個別にＲＮＡの末端ラベルし、消化生成物を分析することで、それらの切断がＲＮＡの５’末端においてのみ起きることが示された。これはまた提供した機構と一致することである。
【０１０２】実施例１６図２７は特異的ＲＮＡseＨ開裂部位における、ＡＭＶ、ＭＭＬＶおよび大腸菌切断由来のＲＮＡseＨ活性を示す。図中の矢印は完全長さＲＮＡの位置を示す。図２７ａは32Ｐで内部標識したＨＩＶ領域２を１本鎖配列とハイブリダイゼーションしＡＭＶ由来ＲＮＡseＨで４５分間（レーン２）、ＭＭＬＶ由来ＲＮＡseＨで５、１５、４５または１２０分間（レーン３−６）、または大腸菌由来ＲＮＡseＨで５分間（レーン７）ニックトランスレーションしたものである。生成した断片のサイズは各酵素によって異なり、酵素開裂の特異性およびこの鋳型についての特異性が酵素間で異なることを示している。最も急速な分解は大腸菌ＲＮＡseＨの存在下で観察され、この酵素の切断が、特異性においてより低いことあるいは活性がより高いことを示唆している。図２７ｂはＨＢＶ領域１ＲＮＡを合成標的配列とハイブリダイゼーションし、ＡＭＶ逆転写酵素由来のＲＮＡseＨで５、３０、６０または１２０分間（レーン２−５）または大腸菌由来ＲＮＡseＨで１、３、１５または６０分間（レーン６−９）、ニックトランスレーションした結果を示す。２個の酵素により異なるサイズの断片が生成し、開裂の特異性を示した。ＨＢＶ ＲＮＡの３’末端をラベルし、ＡＭＶ逆転写酵素でニックトランスレーションすると同じサイズの断片が観察され、開裂部位がＲＮＡの５’末端に近いことを示した。これらのデータは特異的な部位がＡＭＶ由来ＲＮＡseＨ、ＭＭＬＶ由来ＲＮＡseＨおよび大腸菌由来ＲＮＡseＨで開裂されること、およびこれら３酵素における部位の幾つかは異なっていることを示している。増幅される領域内に特異的な部位が存在することはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを開裂させ、能率的な自己触媒作用がもたらされる。切断部位情報を用いて設計されたプライマーは増幅効率を改善する。このことは、あるプライマーセットの増幅程度がＲＮＡseＨの供給源に依存して様々な程度に変化するという本発明者らの観察と一致している。
【０１０３】Ｅ．ＭＭＬＶ ＲＮＡseＨおよびＡＭＶ ＲＮＡseＨ切断部位の同定実施例１７ＡＭＶ ＲＮＡseＨによる消化部位を同定するためにＲＮＡを相補的配列とハイブリダイゼーションし、ＡＭＶ ＲＮＡseＨでニックトランスレーションした。変性後、配列決定すべき領域の３’末端に相補的なプライマーとハイブリダイゼーションし、サンガーの配列決定法に従い、ジデオキシヌクレオチドの存在下で伸長した。ｃＤＮＡ合成の終結、これはＲＮＡ開裂を示すが、はＨＢＶ ＲＮＡの以下の部位で観察された。
5' GGGAGAGGUUAUCGC*UGGA*UGUGUCUGCGGCGUUUUAUCA*UAUUCCUCUUCA*UCCUG・・・3'ＭＭＬＶ ＲＮＡseＨによる消化部位を同定するためにＲＮＡと相補配列とをハイブリダイゼーションし、ＭＭＬＶ ＲＮＡseＨでニックトランスレーションした。変性後、配列決定すべき領域の３'末端に相補的なプライマーとハイブリダイゼーションし、サンガーの配列決定法に従い、ジデオキシヌクレオチドの存在下で伸長した。ｃＤＮＡ合成の終結はＨＢＶ ＲＮＡの以下の部位で観察された。
5' GGGAGAGGUUAUCGC*UGGA*UGUGUCUGCGGC*GUUUUAUCA*UAUUCCUCUUCAUCCUGC*UGCUAUGCCUCA*UCUUC・・・-3'以下の部位は第２のＨＢＶ ＲＮＡ配列と同定された。
5' GGGAGACCCGAGAU*UGA*GAUCUUCUGCGACGCGGCGAU*UGA*GAUCUGCGUCU*GCGAGGCGAGGGAGU*UCU*UCUU*CUAGGGGACCUGCCUCGGUCCCGUC*GUCUA・・・3'以下の部位はＨＩＶ ＲＮＡ配列と同定された。
5' GGGAGACAAA*UGGCAGUA*UUCAUCCACAAUUUUAAAAGAAAAGGGGGGAUUGGGGGGUACAGUGCAGGGGAAAGAAUAGUAGACAUAAUAGC*AACAGACAUAC*AAACUAAAGAAUUACAAAAACAAAUUAC*AAAAAUUCAAAAUUUUCGGGUUUAUUACAGGGAC*AGC*AGAAA・・・3'大多数の開裂部位はＣＡまたはＵＧジヌクレオチドの近くに存在する。開裂部位の検出に用いた方法では開裂反応の間に蓄積された部位が同定されたにすぎない。使用した方法で認識された部位以外の部位でも開裂が起きると予測される。
【０１０４】Ｆ．増幅システムのためのプライマー種々のＲＮＡseＨ酵素が配列特異性を有するという知見に基づいて本発明者らは様々なプライマー／標的の組み合わせを試験しそれらの増幅システムにおける動向を適正化することを試みた。今日までに得られたデータは生成したＲＮＡ断片の各片のサイズが比較的大きく、断片はおそらく２本鎖から自然発生的に解離したものではないことを示唆している。このことは、ＡＭＶ逆転写酵素を用いて行ったＡＭＶ ＲＮＡまたはポリオウイルスＲＮＡの複写実験において、最初に合成されたｃＤＮＡ鎖からのｃＤＮＡの合成におけるプライムに、ＲＮＡseＨによって産生されたＲＮＡ断片を酵素が用いることが分かったことから、予想外なことではない。ＲＮＡseＨ酵素が配列特異性を有するならば、増幅反応は以下のごとくに進行するであろう（反応混合物中のＲＮＡ中間体から開始して）。増幅中に生成した主プライマー種に相補的なプライマーがＲＮＡの３’末端に結合する。反応混合物中のプライマー濃度は高いので、過剰のプライマーにより生成されたＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖は合成を開始し得る前にＲＮＡseＨ活性によって開裂されるであろう。従って、プライマー結合領域は、反応に用いるＲＮＡseＨが認識する配列を多数含有しないことが好ましい。切断部位が頻繁に存在するので、認識された切断部位を含まないＲＮＡ相補プライマーを実際に設計し得ない場合もあるかもしれない。そのような場合、プライマーの３’末端部位をＲＮＡとのアニーリングのために保持するために切断部位はできるだけ５’末端に近くすべきである。プライマーを適当なＤＮＡポリメラーゼで伸長すると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する第２プライマーの結合部位が現れるはずである。逆転写酵素によって仲介されるプライマーの結合と合成の開始のためには、プライマーがＤＮＡにハイブリダイズする際にヌクレーション（nucleation)とジッパーリング(zippering)が可能なようＲＮＡの一部を除去する、あるいは単にＲＮＡをニックし生成したＲＮＡを排除するだけで十分である。本発明者らのデータはかなり大きいＲＮＡ片が生成し、またプロモーター含有プライマーが完全長さのＤＮＡに取り込まれないことを示していることから、以下の事象が起きていると考えられる。
【０１０５】１. プロモーター−プライマー結合を可能ならしめるに十分なニックがＲＮＡに含まれている。適当な部位の１つのニックによって、単に、消失させるに十分な小さいＲＮＡ断片が生成しプライマー結合部位またはその一部が露出されるのか、または１つのニックが１またはそれ以上の酵素の巻戻し作用を促しＲＮＡ断片が追い出されるのかは、現時点では不明である。
２．逆転写酵素でｃＤＮＡ３’末端が伸長されプロモーター領域の２本鎖ＤＮＡが作られる。
３．このようにして生成した複合体からＲＮＡが合成される。この複合体はＲＮＡに結合したｃＤＮＡからなり、２本鎖ＤＮＡプロモーターを含有する。このように、反応物には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマーの結合部位の内部または近辺のどこかに、ＲＮＡseＨ活性が認識する配列が存在する必要がある。幾つかの適用例では、標的配列それ自身の内部にはＲＮＡseＨ認識部位のないことも望ましい。標的内の部位は開裂され２本鎖ｃＤＮＡ領域の合成のためのＲＮＡプライマーの生産に用いられるであろう。この酵素作用の可能性を消滅することが好ましい。
【０１０６】本発明者らが得たモデルおよびＲＮＡseＨ配列特異性情報に基づいて新規なプライマーセットが企画された。本発明者らの企画は以下の通りである。
Ｔ７プロモーター−プライマー用１）プライマー領域は１０塩基あたり１またはそれ以上の切断部位を有する。
２）プライマー領域はその５’末端の近くに切断部位を有する。
３）プライマー領域はその３’末端の近く、および可能なら３’末端の一部に切断部位を有する。
４）プライマーの長さは＞１８塩基である。
５）Ｔmest は約５５−６５℃である。
他のプライマー用１）プライマーはＲＮＡseＨ切断部位を殆ど持たないか、全く持たない。
２）プライマー内に存在する切断部位はすべて５’末端付近に存在する。
３）プライマーの長さは約１８−２８塩基である。
４）Ｔmestは５５−６５℃である。
明らかに、これらの基準および機構、ならびに配列特異性に関する知識に従って設計されたプライマーを用いて、より良好な合成が達成された。このことは本発明によれば、特異的な標的領域のための機能的なプライマーセットの製造が可能であることを示すものである。これらを以下により詳細に説明する。
【０１０７】実施例１８ＲＮＡseＨの特異性に関する発見を効率的なプロモーター−プライマーの組合せを設計するのに利用した。従来技術の方法はプロモーターを非選択的にプライマーに付加したものにすぎない。本発明者らは増幅産物の収率を高めるのに最適なプロモーター−プライマーの組み合わせを設計することができた。以下に示す実験はプロモーター−プライマー配列を少し変化させることで増幅効率が大きく変化することを示している。以下の例では同一領域からのプライマーを、ＲＮＡseＨ開裂部位およびＧＰ−III増幅効率に関して比較したものである。各試料について、被検プライマー以外は同一の試薬を用いて２回、増幅を行った。
【０１０８】１．非プロモータープライマー最初の例では、ＣＭＬ主要ｔ（１４；１８）ブレイクポイント増幅領域のための非プロモータープライマー部位を１５塩基移動することにより、４塩基認識配列と仮定して推定のＲＮＡseＨ切断部位内の数を４から１に、３塩基認識配列と仮定して５から２に減少した。２.５mm ＡＴＰ、１６.５mm ＭgＣl2、および５０mＭ ＫＣlを用いるほかは実施例１５と同様に反応させた。このプライマー配列における変化は増幅効率にとって極めて積極的な影響を及ぼした。第２の例では、４塩基認識部位と仮定される推定のＲＮＡseＨ部位のみを除去するためにＨＢＶ領域１の非プロモータープライマー内に意図的に不適合を配した。３塩基切断部位の場合は、当業者ならば、不適合により３’末端に最も近い切断部位が除去されたことが分かるであろう。この変化もまた、増幅効率に極めて積極的な影響を及ぼした。データは、プライマーの位置を変化する方法または不適合を導入する方法の２方法のいずれも増幅の促進に利用し得ることを示している。おそらく非プロモータープライマーからのＲＮＡseＨ切断部位の除去の方が、より能率的に自己触媒期間のｃＤＮＡ合成を開始させるであろう。
配列 ＲＬＵ例１ GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC 78,880 GACCAACTCGTGTGTGAAACTCCA 2,552,333例２ TCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGC 57,710 TCCTGGAATTAGAGGATAAACGGGC 518,695【０１０９】２．プロモーター−プライマー以下の例は同じ領域を起源とするが推定のＲＮＡseＨ切断部位の数が異なるプロモータープライマーを示す。最初の例ではＨＩＶ領域５のための２つのプロモータープライマーが１０塩基移動して４塩基認識部位と仮定して推定のＲＮＡseＨ切断部位を２から３に変化させるか、３塩基認識部位と仮定して３から５に変化させた。これは増幅効率に正の影響を及ぼした。第２の例では推定のＲＮＡseＨ切断部位を含有する配列を主要ブレイクポイントｔ（１４；１８）転座のためのプロモータープライマーの上流に挿入し、標的に対する１つの不適合を含有させてプライマー領域内に切断部位を生成させた。これも増幅効率に正の影響を及ぼした。これは増幅効率の上昇に、プロモータープライマーへのＲＮＡseＨ切断部位の挿入を利用することができることを示すものである。おそらく、ＲＮＡseＨ切断部位の挿入がＲＮＡ鎖の移動を助け、プロモーター領域の複製効率を増大し、その結果、能率的な自己触媒が達成される。
プライマー名称 ＲＬＵ 例３ Ａ ４５，４６６ Ｂ ９０８，１４７ 例４ Ｃ ６４，６０１ Ｄ ２，９４６，７０６上記プライマーの配列を以下に示す。
プライマーＡ：AATTTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATCTTGTGGGGTGGCTCCTTCT-3’プライマーＢ：AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCTCCTTCTGATAA TGCTG-3’プライマーＣ：ATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTG-3'プライマーＤ：TAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATCAGTTACAATCGCTGGTATCAACGCTGAGCAGACGCTGACCGTGGTCCCTTG-3'【０１１０】上記の例で、非プロモータープライマーからのＲＮＡseＨ切断部位の除去は、切断部位の除去が元の標的に不適合を導入するとしても、増幅効率を増大した。付加的なＲＮＡseＨ切断部位を含有させるためのプロモーター含有プライマーの設計もまた、それが切断部位の導入が元の標的に不適合を導入するとしても、増幅を増大した。推定のＲＮＡseＨ切断部位の数、分布、および位置が、一部では、特定のプライマーの有用性を決定する。意図的な不適合の導入またはプロモーターおよびプライマー間への配列の挿入による増幅の増大は増幅法における自明の改善ではない。本発明の好ましい実施態様では、ＲＮＡ標的配列を決定し、次いでＲＮＡseＨ分解が２本鎖からのＲＮＡ切片の切断または除去を起こす場所を決定する。ＡＭＶ�