| 【発明の名称】 |
生態環境系の変化又は差異の検出方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】杉森 美帆
【氏名】竹内 和久
|
| 【要約】 |
【課題】環境中の微生物の遺伝子塩基配列から、生態環境系の変化又は差異を検出する方法の提供。
【解決手段】環境中の微生物群から各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法により増幅させ、増幅した遺伝子を変性剤の濃度勾配を有するアクリルアミドゲル中で分離し、該遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータとデータベースに記録されたデータとを対比することを特徴とする生態環境系の変化又は差異の検出方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 環境中の微生物群から各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法により増幅させ、増幅した遺伝子を変性剤の濃度勾配を有するアクリルアミドゲル中で分離し、該遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータとデータベースに記録されたデータとを対比することを特徴とする生態環境系の変化又は差異の検出方法。
【請求項２】 生態環境系の汚染原因菌の検出方法である請求項１記載の生態環境系の変化又は差異の検出方法。
【請求項３】 アコヤガイの幼生斃死原因菌の検出方法である請求項１又は２記載の生態環境系の変化又は差異の検出方法。
【請求項４】 活性汚泥中の酸敗原因菌の検出方法である請求項１又は２記載の生態環境系の変化又は差異の検出方法。
|
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、環境中の微生物の遺伝子塩基配列から、生態環境系の変化又は差異を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】古来から人間は、医薬、食品等の分野に微生物を利用してきた。特に、近年のバイオテクノロジーの進歩は、社会生活を豊かで快適なものとしている。その一方、生活排水、工場排水等による富栄養化のため、赤潮が発生する等微生物による環境破壊が深刻な社会問題となっている。
【０００３】しかしながら、環境中の微生物は、培養が困難なものが多く、正確な群集構造の把握や、環境汚染原因菌の検出が困難な場合が多い。
【０００４】ところで、近年のDNAの構造解析技術の急速な進展に伴い、微生物(例えば、大腸菌、枯草菌、ラン藻、超好熱菌、酵母など)、植物(例えばイネ、シロイヌナズナなど)、哺乳動物(例えばヒト、マウスなど)などの多くの生物種について、全ゲノムの塩基配列を決定するためのゲノムプロジェクトが世界各国で展開されている。そこから得られる塩基配列情報は着実に増加し、各種生物由来のゲノム塩基配列データベースが急ピッチに整備されている。従って、微生物のゲノムについても、急速に塩基配列情報が蓄積することが予想され、その情報に基づいて環境浄化への応用が期待されている。
【０００５】本発明は、微生物が固有に有するDNAの構造を解析し、これをもとに生態環境系の変化又は差異を検出する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定部分の塩基配列はほとんどすべての微生物に共通であることから、該部分をプライマーとして１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅させ、増幅した遺伝子を変性剤の濃度勾配を有するアクリルアミドゲル中で分離し、該遺伝子の塩基配列を決定することによって、生態環境系の微生物群集構造を推定することができる。そして、かかる塩基配列のデータとデータベースに記録されたデータとを対比することによって、生態環境系の変化又は差異を検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、環境中の微生物群から各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法により増幅させ、増幅した遺伝子を変性剤の濃度勾配を有するアクリルアミドゲル中で分離し、該遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータとデータベースに記録されたデータとを対比することを特徴とする生態環境系の変化又は差異の検出方法を提供するものである。かかる構成をとることにより、培養が困難な環境中の微生物を容易に検出することができ、生態環境系の変化又は差異を容易に検出することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、まず環境中の微生物群から各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を抽出、精製する。環境は、海、河川、湖沼、土壌、森林はもちろん、人間が人為的に作りあげた環境であってもよい。環境から採取したサンプルを常法に従い、濾過、培養、遠心、溶解等することにより、１６Ｓ ｒＲＮＡを抽出する。DNA精製は、例えばDNA精製用カラム等を用いて常法に従って行うことができる。
【０００９】次いで、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅させる。１６Ｓ ｒＤＮＡの特定部分の塩基配列は、ほとんどすべての微生物に共通である。したがって、該特定の塩基配列をプライマーとして用いれば、上記環境から抽出、精製されたすべてのDNAを増幅することができる。かかるプライマーとしては、例えばフォワード側は配列番号１、リバース側は配列番号２で表されるものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。ＰＣＲ反応は、常法に従って行うことができる。本発明においては、上記ＰＣＲ法により増幅された遺伝子を、ＧＣクランプを用いてさらに増幅させてもよい。
【００１０】次いで、上記で得られた遺伝子を、変性剤濃度勾配電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、以下「ＤＧＧＥ」という）に付し、分離する。上記で得られた各遺伝子は、塩基配列の長さはほぼ同じで、プライマー部分は同じ塩基配列を有するが、それ以外の部分については配列が異なる。一般に、遺伝子の長さが同じであると、電気泳動でそれらの遺伝子を分離することはできない。しかしながら、変性剤の濃度勾配を有するＤＧＧＥを用いれば、異なる塩基配列の遺伝子を異なるバンドとして検出することができる。変性剤としては、例えば尿素、ホルムアミド等が挙げられる。試薬、ゲルの作製、試料の挿入と泳動、染色、検出は、常法に従って行うことができる。
【００１１】次いで、ゲル中からバンドを切り出し、各バンドについて塩基配列を決定する。すなわち、各バンドからDNAを例えばＴＥ中に溶出させ、ＰＣＲを行い、その後常法に従って塩基配列を決定することができる。
【００１２】このようにして得られた塩基配列のデータと、その環境の既知の塩基配列のデータベースとを対比する。これにより、その環境の微生物生態系の変化を検出することができる。あるいは、このようにして得られた塩基配列のデータと、他の環境の既知の塩基配列のデータベースとを対比する。これにより、その環境と他の環境の微生物生態系の差異を検出することができる。その環境又は他の環境の既知の塩基配列のデータベースは、予め該環境から微生物群をサンプリングし、上記と同様にして各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、かかる塩基配列データを蓄積しておけばよい。
【００１３】既知のデータベースにない塩基配列が検出された場合には、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等を用いてその塩基配列を有する微生物を推定することができる。そして、該塩基配列の一部を固定したDNAチップ又はプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、該微生物の存在を確認することができる。DNAチップは、１cm2ほどの固体表面に数百から数十万のDNAプローブをアレイ状に配置したものであり、これを用いればサンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを瞬時に判断することができる。
【００１４】本発明の方法は、生態環境系の汚染原因菌の検出に特に有効である。すなわち、その生態環境系に微生物に起因する汚染が生じた場合、そのような汚染が生じていない生態環境系と対比することにより、汚染原因菌を検出することができる。例えば、養殖中のアコヤガイの幼生が大量に斃死したとき、その原因が特定微生物の増殖によるものである場合には、該特定微生物を検出することができる。また、活性汚泥を利用したメタン発酵においては、酸敗がメタン発酵装置の安定運転を妨げる原因となっている。ここで、正常状態における塩基配列のデータベースを蓄積しておき、酸敗が発生したときの塩基配列のデータと対比することにより、酸敗関連微生物を検出することができる。メタン発酵装置運転中は、酸敗関連微生物の動向をＰＣＲ等でモニタリングし、検出された場合には発酵の負荷を減少させることで酸敗を防止し、安定運転を行うことが可能となる。
【００１５】
【実施例】次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】実施例１アコヤガイの幼生大量斃死原因菌の推定アコヤガイの幼生が大量に斃死した海水中の微生物の塩基配列データと、かかる事象が生じていない海水（正常海水）中の塩基配列データベースとを対比してアコヤガイ幼生の大量斃死原因菌を推定した。
（１）DNAの抽出ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いて行った。試薬、Ｂｕｆｆｅｒ等は、特に記載がないものについてはキット添付のものを用いた。
■試薬の調製試薬１；１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１２．１１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。ＨＣｌでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
試薬２；０．５ ＥＤＴＡＥＤＴＡＮａ2・２Ｈ2Ｏ １８．６１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
試薬３；ＴＥ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ０．５ ＥＤＴＡ ２００μＬ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。
混合後オートクレーブ処理。
【００１７】■操作アコヤガイ幼生大量斃死海水及び正常海水１Ｌをヌクレポアフィルター（口径０．２μｍ、直径４７ｍｍ）で濾過した。次いでフィルターを５０ｍＬ遠心管（Ｎａｌｇｅ Ｃｏ．，ＮＹ，ＵＳＡ）に入れ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉを６００μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした。その後５０℃で３０分間インキュベートした。これに、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩを３００μＬ加えて５〜６秒ボルテックスした後、５０℃で１５分間インキュベートした。これにＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩを３００μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした後、氷上に１５分間静置した。これを１２０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心し、水相を１．５ｍＬマイクロチューブに分取した。これに２〜２．５倍量のエタノールを加え、よく混合し、１２０００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心した。これの上清を捨て、沈殿を７５％エタノールでリンス後、試薬３ ５０μＬに溶解させた。
【００１８】（２）DNAの精製抽出したDNAは、DNA精製用カラムＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。試薬の調製、精製方法は、マニュアルに従った。
【００１９】（３）ＰＣＲ反応１試薬、Ｂｕｆｆｅｒは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付のものを用いた。
操作：チューブに以下の溶液を入れて混合した。
１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬＧｅｎｅＡｍｐ ｄＮＴＰ ＭＩＸ １０μＬｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒｗａｒｄ １μＬｐｒｉｍｅｒ ｒｅｖｅｒｓｅ １μＬｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ １０ｎｇＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．５μＬ滅菌水総容量 １００μＬ微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ３領域を増幅させるため、プライマーセットとしては、フォワードプライマーを配列番号１（３５７ｆ：＜２２３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、リバースプライマーを配列番号２（５１９ｒ：＜２２３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いた。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｏｇｅｎｅ（ＥＹＥＬＡ）を用いて、以下の条件で行った。
プレヒート ９５℃・１０分サイクル反応（解離反応：９５℃・１分、アニーリング反応：６２℃・１分、伸長反応：７２℃・１分）×２５サイクル最終反応 ７２℃・１０分【００２０】（４）ＰＣＲ反応２上記ＰＣＲ１で得られたＰＣＲ反応物１μＬをｔｅｍｐｌａｔｅとし、プライマーセットとしては、以下のものを用いてＰＣＲ反応１と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
フォワードプライマー：ＧＣクランプ（配列番号３で表されるもの：＜２２３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）＋３５７ｆリバースプライマー：５１９ｒ【００２１】（５）ＤＧＧＥＤＧＧＥは、Ｄ Ｃｏｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、そのマニェアルに従って行った。
■試薬 ５０×ＴＡＥ Ｔｒｉｓ １２１ｇ ＣＨ3ＣＯＯＨ ２８．５５ｍＬ ０．５ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ５０ｍＬ／５００ｍＬ ｄＨ2Ｏ■操作（ゲルの作製）アクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝３７．５：１）９％、変性剤６０％（１００％変性剤：７Ｍ尿素、４０％ホルムアミド）とアクリルアミド７％、変性剤４０％、１×ＴＡＥを加え、脱気後１０％過硫酸アンモニウムを０．７ｍＬ／１００ｍＬゲル溶液に加えた。次いで、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを７０μＬ／１００ｍＬゲル溶液に加えた。次いで、変性剤濃度勾配ができるように、ゲル作製装置を用いてガラス板の間にアクリルアミドゲル溶液を挿入した後コームをさし、ゲルを重合させた。
【００２２】（試料の挿入と泳動）泳動槽に予め１×ＴＡＥを入れておき、６０℃に保温した。ゲルプレートを泳動装置にセットし、コームを抜いたウェルをピペットで洗浄した。ＰＣＲ反応２で増幅されたものに１／５容のｄｙｅを加え、ウェルに挿入した。次いで、６０℃で９０Ｖ、９００分間泳動を行った。
（染色及び検出）蒸留水で１万倍に希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）で３０分間染色し、２５４ｎｍのＵＶ照射により検出を行った。
【００２３】結果：ＤＧＧＥにより得られたバンドのうち、アコヤガイ幼生大量斃死海水において特徴的であるＢａｎｄ１，２，３について塩基配列を決定し、アコヤガイ幼生大量斃死原因菌の推定を行った。
（ゲルからの回収）ゲル中からＢａｎｄ１，２，３を切り出し、切り出したゲルをＴＥ５０μＬ中で１晩静置し、ＴＥ中にDNAを溶出させた。この１μＬ液をｔｅｍｐｌａｔｅとして、ＰＣＲ反応２と同様にしてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物についてＤＧＧＥ反応を行い、目的のＢａｎｄであることを確認した。
（塩基配列解析）解析は、東洋紡ジーンアナリシスに依頼した。得られた塩基配列を配列番号４、５及び６に示す。
【００２４】データベース検索アコヤガイ幼生大量斃死原因菌の推定は、塩基配列を既知の微生物の配列と比較することで行った。既知の微生物の配列との比較は、ＢＬＡＳＴ（ｂａｓｉｃａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）により、データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬを利用した。結果を以下に示す。
【００２５】Ｂａｎｄ１Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅＩｄｅｎｔｉｔｙ：１６５／１７６（９３％）
Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ；ｇａｍｍａ ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ；Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ；ＶｉｂｒｉｏＲｅｆ．：Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｉｌｉａ，Ｖ． ａｎｄ Ｃｏｒｒｅ，Ｓ．，Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ ｓｐ． ｎｏｖ．，ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｓｃａｌｌｏｐ（Ｐｅｃｔｅｎｍａｘｉｍｕｓ）ｌａｒｖａｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８Ｐｔ２，４８１−４８７（１９８８）
【００２６】Ｂａｎｄ２Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅＩｄｅｎｔｉｔｙ：１７２／１７６（９７％）
Ｂａｎｄ３Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅＩｄｅｎｔｉｔｙ：１７４／１７６（９８％）
【００２７】一例として、Ｂａｎｄ３の塩基配列とＶｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａの塩基配列を、配列番号７、配列番号８（<223>：Vibrio pectenicida）、配列番号９、配列番号１０（<223>：Vibrio pectenicida）、配列番号１１、配列番号１２（<223>：Vibrio pectenicida）に示す。
【００２８】Ｂａｎｄ１、２、３とも、Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ １６ＳｒＲＮＡ ｇｅｎｅと高い相同性を示したため、アコヤガイ幼生大量斃死原因菌は、Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ又はその非常に近縁の種であると推定された。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、環境中の微生物の遺伝子塩基配列から、生態環境系の変化又は差異を検出することができる。
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ<110>MITSUBISHI HEAVY INDUSTRIES,LTD<120>Method of detecting change or difference of ecological environment<130>200101092<160>12<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><400>1actcctacgg gaggcagcag 20<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><400>2ttaccgcggc kgctggcac 19<210>3<211>40<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><400>3cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40<210>4<211>177<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>4tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgy atgaagaagg 60ccttckggtt gkaaagyact ttcagyagtg aggaaggcgg atgtgttaat agcatattca 120tttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagccgccg cggtaaa 177<210>5<211>177<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>5tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 60ccttcgggtt gtaaagyact ttcagcagtg aggaaggtgg atgtgttaat agcacattca 120tttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagccgccg cggtaaa 177<210>6<211>177<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>6tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 60ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcagtg aggaaggtgg atgtgttaat agcgcattca 120tttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagccgccg cggtaaa 177<210>7<211>60<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>7tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccacgtgt atgaagaagg 60<210>8<211>60<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>8tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 60<210>9<211>60<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>9ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcagtg aggaaggtgg atgtgttaat agcgcattca 60<210>10<211>60<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>10ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcagtg aggaaggtgg atgtgttaat agcgcattca 60<210>11<211>56<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>11tttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaa 56<210>12<211>56<212>DNA<213>Vibrio pectenicida<400>12tttgacgtta gctgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagccgccg cggtaa 56 |
| 【出願人】 |
【識別番号】０００００６２０８
【氏名又は名称】三菱重工業株式会社
|
| 【出願日】 |
平成１３年５月１日（２００１．５．１） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１００１１２７３７
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 考晴 （外３名）
|
| 【公開番号】 |
特開２００２−３２５５９９（Ｐ２００２−３２５５９９Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−１３４７０１（Ｐ２００１−１３４７０１） |
|