| 【発明の名称】 |
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼアッセイ |
| 【発明者】 |
【氏名】ランディ・ランジェー・ラムハラック
【氏名】マーク・アラン・スパー
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| 【要約】 |
【課題】ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性を測定する新規な方法の提供。
【解決手段】関連する化合物の活性を減少および／または排除するために新規な溶媒系の利用を特徴とし、(ａ) 少なくとも１つのＤＧＡＴ基質を提供し；(ｂ) それにＤＧＡＴが結合しているミクロソームをＤＧＡＴ基質と合わせて反応混合物を形成し；(ｃ) ミクロソームおよびＤＧＡＴ基質の混合物を予め定めた時間の間インキュベーションし；(ｄ) ＤＧＡＴとＤＧＡＴ基質との反応を停止させ；さらに(ｅ) ＤＧＡＴの生物学的活性のインジケーターとしてトリグリセリド産生を検出することからなる。本発明はまた、化合物がＤＧＡＴの生物学的活性を調節するために有用であるか否かを決定する方法を開示する。本方法は、ＤＧＡＴ活性の調節物質としての化合物をマススクリーニングするために利用することができる。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 以下の工程：(ａ) 少なくとも１つのＤＧＡＴ基質を提供し；
(ｂ) それにＤＧＡＴが結合しているミクロソームをＤＧＡＴ基質と合わせて反応混合物を形成し；
(ｃ) ミクロソームおよびＤＧＡＴ基質の混合物を予め定めた時間の間インキュベーションし；
(ｄ) ＤＧＡＴとＤＧＡＴ基質との反応を停止させ；さらに(ｅ) ＤＧＡＴの生物学的活性のインジケーターとしてトリグリセリド産生を検出するを含むジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を測定する方法。
【請求項２】 ＤＧＡＴ基質がオレオイルＣｏＡ、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールおよびその放射性同位体を含む請求項１に記載の方法。【請求項３】 少なくとも１つのＤＧＡＴ基質がアセトン：クロロホルム溶媒に溶解される請求項１に記載の方法。
【請求項４】 アセトン対クロロホルムの比が８：２である請求項３に記載の方法。
【請求項５】 アセトンの濃度が容積で約１.０％から約５.０％の範囲である請求項３に記載の方法。
【請求項６】 クロロホルムの濃度が容積で約０.１％から約０.８％の範囲である請求項３に記載の方法。
【請求項７】 ＤＧＡＴ基質がエタノール：クロロホルム溶媒に溶解される請求項１に記載の方法。
【請求項８】 エタノール対クロロホルムの比が１：１である請求項７に記載の方法。
【請求項９】 エタノールの濃度が容積で約０.２％から約２.０％の範囲である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】 クロロホルムの濃度が容積で約０.１％から約０.６％の範囲である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】 以下の工程：(ａ) ＤＧＡＴ基質を提供し；
(ｂ) それにＤＧＡＴが結合しているミクロソームを提供し；
(ｃ) ＤＧＡＴの生物学的活性を調節する能力について分析しようとする化合物を、（ａ）および（ｂ）で述べた構成成分と接触させて反応混合物を形成し;(ｄ) 前記反応混合物を予め定めた時間の間インキュベーションし；
(ｅ) 反応混合物中のＤＧＡＴと少なくとも１つのＤＧＡＴ基質との一切の反応を停止させ；さらに(ｆ) ＤＧＡＴの生物学的活性を測定するが、この場合、前記化合物と接触していないコントロールと比較してＤＧＡＴの生物学的活性における変化は、化合物がＤＧＡＴの生物学的活性を調節することを示すを含む、化合物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を調節するために有用であるか否かを決定する方法．
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【発明の詳細な説明】【０００１】本発明は、一般にジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(ＤＧＡＴ)の生物学的活性を測定する方法を提供する。特に本発明は、ＤＧＡＴの生物学的活性を調節することができる化合物の迅速なマススクリーニングの方法を提供する。より具体的には、本発明は、脂肪アシルヒドロラーゼ（ＡＨ）活性を顕著に低下させるだけでなくアシルＣｏＡ：アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）およびエタノールアシルトランスフェラーゼ（ＥＡＴ）活性を排除しつつＤＧＡＴ活性をより強くすることができる、ＤＧＡＴ活性測定用アッセイシステムを提供する。
【０００２】
【従来技術】高トリグリセリド血症は心血管系疾患発症の危険因子である（J. Gaziano, C.Hennekens, C. O'Donnell, J. Breslow, J. Buring. Fasting triglycerides,high-density lipoprotein, and risk of myocardial infarction. Circulation96: 2520-2525 (1997))。トリグリセリド（ＴＧ）はまた、脂肪細胞の脂肪取り込みに重要な役割を果たし（R. Coleman, R. Bell. Triacylglycerol synthesisin isolated fat cells. J. Biol. Chem. 251: 4537-4543 (1976)）、したがって、肥満に関して主要な役割をもつ。さらに、トリグリセリドはリポ蛋白（例えばＶＬＤＬおよびＬＤＬ）を含有するアポＢ−１００の集合に必要である（K. Bostrom, J. Boren, M. Wettesten, et al. Studies on the assembly of apo B-100-containing lipoprotrins in HepG2 cell. J. Bio. Chem. 263: 4434-4442(1988); C. Pullinger, J. North, B. Teng, V. Rifici, A. Ronhild de Brito,J. Scott. The apolipoprotein B gene is constitutively expressed in HepG2 cells: regulation of secretion by oleic acid, albumin, and insulin, and measurement of the mRNA half-life. J. Lipid Res. 30: 1065-1077 (1989))。結果として、トリグリセリドレベルを減少させる治療法の開発に大きな関心が注がれている。トリグリセリド生合成における決定的／肝要な工程を触媒することが判明している酵素はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である（R. Coleman. Diacylglycerol acyltransferase and monoacylglycerol acyltransferase from liver and intestine. Methods in Enzymology 209: 98-104 (1992)）。ＤＧＡＴは、補酵素Ａ活性化脂肪酸の１,２−ジアシルグリセロールの３位への移転を触媒してトリグリセリドを生成する（R. Lehner, A. Kuksis. Biosynthesis of triacylglycerols. Prog. Lipid Res. 35(No.2): 169-201 (1996); R. Bell. Enzymes of glycerolipid synthesis in eukaryotes.Ann. Rev. Biochem. 49: 459-487 (1980)）。したがって、ＤＧＡＴ活性の抑制はこの経路によるトリグリセリド産生を低下させ、これは血中ＶＬＤＬ／ＬＤＬの同時減少をもたらし、ＨＤＬを増加させる可能性がある。しかしながら、特定のＤＧＡＴ抑制物質を単離するためのマススクリーニングは、そのようなアッセイの確立に付随する技術的な問題のためにこれまで完成にいたっていない。【０００３】通常のＤＧＡＴアッセイは、ピコモルＴＧ／分／mgミクロソーム蛋白質という程度の低い活性を示し、いくつかの他の酵素反応の生成物が夾雑する。さらにまた、ＤＧＡＴ触媒反応生成物は通常はＴＬＣ分析によって解析されるが、これはマススクリーニングで使用するには実際的ではない。単離ミクロソームからＤＧＡＴによって生成されたＴＧを抽出するために有機溶媒を使用する方法は以前に報告された（R. Coleman. Diacylglycerol acyltransferase and monoacylglycerol acyltransferase from liver and intestine. Methods in Enzymology 209:98-104 (1992)）。しかしながら、この抽出に含まれるいくつかの工程は、マススクリーニングにこの技術を応用することを非常に困難にさせている。出願人らは、アセトン：クロロホルムまたはエタノール：クロロホルムを含む溶媒系を開発したが、この溶媒系は劇的にＤＧＡＴ活性を高め、同時に干渉する酵素の活性を抑制する。さらに、ＤＧＡＴ触媒反応混合物から特異的にＴＧを抽出する一工程抽出法を開発した。ＤＧＡＴ活性調節物質のスクリーニングのために、出願人らは本発明のＤＧＡＴアッセイを改変し、本発明の一工程抽出法を９６穴（ウェル）様式に変更した（後者は調節物質／化合物の高処理スクリーニングを可能にする）。このような改変は、ＤＧＡＴアッセイの自動化、すなわちロボットによる実施を可能にする。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性を測定する方法を提供する。本方法は新規な溶媒系を利用して関連または干渉する化合物の活性を低下および／または排除する。本発明はまた、化合物がＤＧＡＴの生物学的活性を調節するために有用であるか否かを決定する方法を提供する。本方法は、ＤＧＡＴの生物学的活性の調節物質として化合物をマススクリーニングするために使用することができる。
【０００５】添付図面において：図１は、ＤＧＡＴを含むミクロソーム酵素活性に対する種々の溶媒の影響を示すグラフである。（Ａ）はミクロソームの活性に対するエタノールの影響を示し、（Ｂ）はＤＧＡＴ活性に対するアセトンの影響を示し、（Ｃ）はＤＧＡＴ活性に対するクロロホルムの影響を示し、（Ｄ）はＤＧＡＴ活性に対するエタノールとクロロホルムの影響を示し、（Ｅ）はＤＧＡＴ活性に対するアセトンとクロロホルムの影響を示している。全てのアッセイは、３７℃５分で、各反応につき４０μgのミクロソーム蛋白質（エタノール、クロロホルム、エタノール：クロロホルム）または１.２５μgのミクロソーム蛋白質（アセトン、アセトン：クロロホルム）、３３.３nCiの［14Ｃ］オレオイルＣｏＡ、４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、並びに表示の濃度のエタノール、アセトンおよびクロロホルムを用いて実施した。Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］[１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドは、ＤＭＳＯで１００倍に希釈して作製し、さらに表示の最終濃度に希釈した。数値は平均を示す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０００６】図２は、以下による種々のＤＧＡＴアッセイの比較である：（Ａ）０.８％エタノール、ＴＬＣ；（Ｂ）０.８％エタノール、一工程抽出、ＴＬＣ；（Ｃ）２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）、ＴＬＣ；（Ｄ）２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）、一工程抽出、ＴＬＣ。
【０００７】図３は、０.８％エタノールおよび２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）を含む種々の溶媒を用いたときの化合物Ｎ−(７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］[１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドによるＤＧＡＴ活性のパーセント抑制、およびＴＬＣと一工程抽出の比較を示すグラフである。アッセイは３７℃で５分、エタノールについては、反応当たり４０μgミクロソーム蛋白質、２０nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを、２.１％アセトン：クロロホルムについては、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。数値は平均を表す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０００８】図４は、（Ａ）群１、（Ｂ）群２、（Ｃ）群３、（Ｄ）群４のラット肝ミクロソーム調製物のＤＧＡＴ活性に対するＮ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］[１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドの影響を、ＴＬＣ、一工程抽出／ＴＬＣ、および一工程抽出／シンチレーション計測により比較したものを示す。アッセイは３７℃で５分、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。［14Ｃ］トリグリセリドは、ＴＬＣ単独、一工程抽出およびＴ、または一工程抽出およびシンチレーションのいずれかで測定した。数値は平均を表す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０００９】図５はＤＧＡＴ活性に対する時間と温度の影響を示す。アッセイは２２℃または３７℃で表示の時間、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。数値は平均を表す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【００１０】図６はＤＧＡＴ活性に対するＤＭＳＯの影響を示す。アッセイは、２２℃で２０分または３７℃で５分、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡ、４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、および表示の濃度のＤＭＳＯを用いて実施した。数値は平均を表す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【００１１】図７は、ＤＧＡＴアッセイで産生された［14Ｃ］トリグリセリドの安定性に対するアルカリエタノール停止溶液ミックス（ＡＥＳＳＭ）の影響を示す。アッセイは３７℃で５分、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi[14Ｃ]オレオイルＣｏＡ、４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。反応は１５０μLのＡＥＳＳＭの添加によって停止させ、表示の時間室温で保温した。数値は平均を表す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【００１２】図８は、９６穴マススクリーニング抽出および手動抽出によって測定した場合の、ＤＧＡＴ活性に対するＮ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］[１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドの影響を示す。アッセイは２２℃で６０分、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡ、４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。プレートの抽出についての数値は平均を表し、プレート１につてはｎ＝６±ＳＥＭで、プレート２につてはｎ＝８±ＳＥＭである。手動抽出についての数値は平均を示し、ｎ＝２±ＳＥＭである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の生物学的活性をアッセイで測定する方法を提供する。本アッセイは、ＤＧＡＴ活性を高め、同時に他の反応生成物または干渉生成物の活性を大きく低下および／または排除することができる。
【００１４】“ＤＧＡＴ活性”とは、補酵素Ａ活性化脂肪酸を１,２−ジアシルグリセロールの３位へ移転させトリグリセリド分子を生成することを意味する。本明細書で用いられている、“トリグリセリド”（トリアシルグリセロールまたは中性脂肪）という用語は、グリセロールの脂肪酸トリエステルを指す。トリグリセリドは典型的には非極性で水に不溶性である。ホスホグリセリド（またはグリセロホスホリピド）は生物膜の主要な脂質成分である。動物の油脂は主としてトリグリセリドの混合物を含む。
【００１５】本明細書で用いられている、“調節する”という用語は、ある機能を増加または低下させることを意味する。好ましくは、ＤＧＡＴ活性（例えばトリグリセリドレベル）を調節する化合物は、ある機能を少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、もっとも好ましくは少なくとも５０％増加または低下させ、ＤＧＡＴ活性の“調節物質”と定義される。
【００１６】一般に本方法は、少なくとも１つのＤＧＡＴ基質とＤＧＡＴが結合した肝ミクロソームを混合する工程を含む。前記ＤＧＡＴ基質およびミクロソームを予め定めた時間の間一緒にインキュベーションする。本発明のために好ましい基質は１,２−ジアシルグリセロールおよび補酵素Ａ活性化脂肪酸である。本発明の方法は、ＤＧＡＴ基質として好ましくは１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールおよびオレオイルＣｏＡを利用する。
【００１７】ＤＧＡＴとその基質との反応の停止は、約１２.５％の無水エタノール、約１０％の脱イオン水、約２.５％の１ＮのＮａＯＨ、並びに約７８.４％のイソプロパノール、約１９.６％のｎ−ヘプタンおよび約２.０％の脱イオン水を含有する溶液を約７５％を含む溶液を添加して達成される。
【００１８】反応の停止後、ＤＧＡＴの生物学的活性のインジケーターとしてトリグリセリドの存在について上部（ｎ−ヘプタン）相を分析する。トリグリセリドの存在は、ホスホイメージヤープレートを用いるか、またはシンチレーション計測を用いて検出測定できる。好ましくは前記上部相をホスホイメージプレート、好ましくはフラッシュプレート（FLASH PLATE, NEN Life Sciences, Inc., Boston, MA）に移す。前記プレートは白色ポリスチレンマイクロプレートで構成された９６穴プレートまたは固形支持体で、プレートの各ウェルの内部はポリスチレンを基剤としたシンチラントの薄層で被覆されている。
【００１９】本方法は、サンプルの分析スピードを高めるために自動化機器またはロボットで実施できる。上記で指摘したように、本発明ではＤＧＡＴ基質を溶解させるために新規な溶媒系を使用する。これらの特別な溶媒系によって新規で有利な特性が本発明の方法に付与されている。これらの新規で有利な特性には、ＤＧＡＴ活性の改善、ＤＧＡＴ選択性の強化および本発明の方法の一工程抽出の利用性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２０】ＤＧＡＴの活性は、溶媒として０.５％から４.０％のエタノール、２.５％から１０％のアセトン、０.２％から０.４％のクロロホルム、およびエタノールとクロロホルムの混合物（それぞれ０.２％から２.０％と０.１％から０.６％）、およびアセトンとクロロホルムの混合物（それぞれ１.０％から５.０％と０.１％から０.８％）を用いて顕著に増強された。ＤＧＡＴアッセイで１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールのために最初に用いられた溶媒である０.８％トゥイーン８０と比較した場合、０.８％のエタノール、１０％のアセトン、０.４％のクロロホルム、２.１％のアセトン：クロロホルム（８：２）、０.８％のエタノール：クロロホルム（１：１）で、ＤＧＡＴ活性は、それぞれ５.３倍、４８４倍、４６３倍、１０５７倍および１１４３倍増加した。さらに、アセトン：クロロホルムの混合物は、ＦＡＨ活性を９.４倍も顕著に低下させただけでなく、ＡＣＡＴおよびＥＡＴ活性を排除するという利点を有する。アセトン：クロロホルム溶媒を用いることによって、本発明で使用する一工程抽出法でＤＧＡＴアッセイからトリグリセリドだけを抽出することができる。
【００２１】本発明の方法はまた、化合物がＤＧＡＴの生物学的活性を調節するのに有用であるか否かを決定するために使用できるように改変できる。ＤＧＡＴの生物学的活性を調節する化合物の能力を確認するために、ＤＧＡＴ活性の調節能力について調べようとする化合物をＤＧＡＴ基質およびミクロソームと混合する。その後の工程は、ＤＧＡＴアッセイについて上記で述べた工程と同一である。ＤＧＡＴの生物学的活性を調節する化合物の能力は、前記化合物と接触していないコントロールと比較してＤＧＡＴ生物活性の変化によって決定できる。この変化は化合物がＤＧＡＴの生物学的活性を調節することを示している。すなわち、ＤＧＡＴおよびＤＧＡＴ基質混合物のトリグリセリド産生の変化における増加、低下または変化の欠如によって、被検化合物がＤＧＡＴ生物活性に対して有する作用を直接的および定量的に測定することができる。以下の実施例によってさらに本発明を詳述する。これらの実施例は本発明を例証しようとするもので、限定と解されるべきではない。
【００２２】
【実施例】材料と方法試薬と化学物質［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび［14Ｃ］グリセロールトリオレエートはAmersham（Buckinghamshire, England）から入手した。アセトン、クロロホルム、メタノール、イソプロパノール、エタノール、ジエチルエーテル、Ｎ−ヘプタン、イソオクタン、氷酢酸、ＨＣｌ、スクロース、イミジゾール、脂肪酸非含有ＢＳＡ、５０％ＮａＯＨ溶液、ＤＭＳＯ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールはSigma Chemical Co.,（St. Louis, Missouri）から入手した。１.０ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７.４）はDigene（Beltsville, Maryland）から入手した。０.５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）はアンビオン（Austin, Texas）から入手した。すべての緩衝液は０.２２μのフィルターを用いて使用前にフィルター滅菌した。
【００２３】Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］[１,４］−オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミド（Chemistry, PGRD, Ann Arbor, Michigan）。ＤｃプロテインアッセイはBioRad（Hercules, California）から入手した。２０×２０cmのワットマンＬＫ６Ｄシリカゲル６０Ａ薄層クロマトグラフィープレート、コスター（Costar）３７９４の９６穴ポリプロピレンプレート、およびコスター３９５６の９６中型穴ポリプロピレンプレートはＶＷＲ（Chicago, Illinois）から入手した。フラッシュプレート（FLASH PLATE(登録商標))はNEN Life Science Products,Inc,（Boston, Massachusetts）から入手した。ロボット試薬槽はTomTec Instrumentation（Hamden, Conneticut）から入手した。
【００２４】動物３５０から４００ｇの雄のスプラーグ＝ドーリー（Sprague-Dawley）ラット（Rattus rattus）をチャールズリバー（Charles River）(Willmington, Maryland）から入手した。ラットは、“Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care International”公認の施設で飼育し採集前の２週間固形飼料を与えた。
【００２５】装置ホモジナイザー：ポリトロン（Polytron）RT3100; Gerald K. Keller Co.,GT-21ミキサー／ホモジナイザー遠心機：ベックマン／コウルター・アバンティー(Beckman/Coulter Avanti)J-30I超遠心機：ベックマンＬ８−８０Ｍマイクロプレート用分光光度計：モレキュラー・デバイシズ・スペトラ・マッ クス・プラス（Molecular Devices Spetra Max Plus）
保温：パーキン・エルマー（Perkin Elmer）9600サーモサイクラー重力対流オーブン（Gravity Convection Oven), 1310, VWRホスホイメージャー：モレキュラー・ダイナミクス・ストーム860ホスホイメージャー（Molecular Dynamics Storm 860 PhosphoImager）
Multimek 96 Robotic Pipetor, Beckman/CoulterMultidrop 384, Titertek, Beckman/CoulterSaigen Carousels, Beckman/CoulterOrca Robotic Arm, Beckman/CoulterSaigen Plate Sealer Model 041-03-00043, Beckman/CoulterTopcount NXT, Microplate Scintillation, およびLuminescence Counter, Packard Instrument CompanyBeckman/Saigen Core Systems Software, Beckman/Coulter【００２６】ミクロソームの単離スクロース濃度勾配法：ＣＯ2付加によりラットを安楽死させ、直ちに肝臓を取り出し、氷冷ミクロソーム緩衝液（ＭＣ緩衝液）に入れた。ＭＣ緩衝液は、１２５mMのシュクロース、３.０mMのイミダゾール（ｐＨ７.４）から成る。肝臓を約１０片に切り分けて１つの肝臓につき２０mLの氷冷ＭＣ緩衝液に入れ、氷上でガラスのダウンス（Dounce）パワーホモジナイザーで１０回上下させて均質化させた。ホモジネートをベックマンＪＡ−１４ローターで１７００rpm、１０分、４℃で遠心した。上清を取り出し、氷上に静置した。ペレットを肝臓当たり４.０mLのＭＣ緩衝液に再懸濁し、上記のように再度均質化させて、ベックマンＪＡ−１４ローターで１７００rpm、１０分、４℃で遠心した。この上清を先の上清と一緒にし、ベックマンＪＡ−１４ローターで１３０００rpm、２０分、４℃で遠心した。上清を氷上の新しい試験管に移しペレットを廃棄した。上清をベックマンＴｉ−７０ローターで３５０００rpm、６０分、４℃で遠心し、得られたペレット（ミクロソーム膜を含む）を、ガラスのダウンスパワーホモジナイザーで１７ストロークにより氷冷ＭＣ緩衝液に再懸濁した。ミクロソーム蛋白質濃度はＤｃ蛋白質アッセイによって決定し、ＢＳＡを用いて標準曲線を作製した。ミクロソームは１０から２０mg／mLの最終蛋白質濃度に希釈した。ミクロソームの部分標本を１.０mLの試験管に取り、液体窒素の凍結フリーザーで保存した。
【００２７】ＤＧＡＴ酵素アッセイ試薬：ＤＧＡＴアッセイ緩衝液（ＤＡＢ）：０.２５Ｍシュクロース、１.０mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）、１５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、および１.２５mg／mLの脂肪酸非含有ＢＳＡ。
【００２８】ＤＧＡＴアッセイ基質混合物：溶媒（トゥイーン（Tween）８０、１００％非変性エタノール、アセトン、クロロホルム、アセトン：クロロホルム、エタノール：クロロホルム）に溶解させた［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを表示の濃度でＤＡＢで希釈し、この溶液をボルテックスミキサーで撹拌し、アッセイの実施まで氷上で保持した。化合物をＤＭＳＯに溶解し、ＤＡＢで１０×に希釈し（１０×化合物）、アッセイの実施まで室温で保持した。凍結したミクロソームの部分標本（総蛋白質量は１０〜２０mg／mL）を氷上で融解し、ＭＣ緩衝液で希釈して表示の濃度の５×使用ストックを作製し、使用まで氷上で保存した。
【００２９】一工程抽出溶液停止溶液：７８.４％イソプロパノール、１９.６％ｎ−ヘプタン、および２.０％ＤＩＨ2Ｏを予め作製し、密閉容器で室温で１カ月まで保存した。
アルカリエタノール停止溶液ミックス（ＡＥＳＳＭ）：１００％非変性エタノール１２.５％、１０.０％のＤＩＨ2Ｏ（脱イオン水）、２.５％の１.０ＮＮａＯＨ、７５.０％の停止溶液をアッセイ前に新しく作製し、室温で保存した。
【００３０】反応方法：ＤＧＡＴアッセイ反応は以下のように実施した：５μLの１０×化合物をパーキンエルマー薄壁反応管に添加し、続いて３５μLのＤＧＡＴ基質混合物を加えてボルテックスミキサーで撹拌した。反応は、１０μLの希釈した５×ミクロソームの添加で開始し、ボルテックスミキサーで撹拌し、パーキンエルマー９６００サーモサイクラーで表示の時間と温度でインキュベーションした。
【００３１】トリグリセリド分離ＴＬＣ法：反応は１０μLの０.７５ＮのＨＣｌを添加して停止させた。続いてサンプルをＴＬＣプレートにスポットし、重力対流オーブンで７０℃で３０分乾燥させた。トリグリセリドの測定のためにプレートを１０２mLのイソオクタン：エチルエーテル：酢酸（７５：２５：２）で室温で６０分２７×７.５×２６cmのＴＬＣチャンバーで反応させた。ＴＬＣプレートをチャンバーから取り出し、重力対流オーブンで７０℃３０分乾燥させ、セロファンで包んでホスホイメージャープレートに一晩暴露した。ホスホイメージャープレートをホスホイメージャーでスキャンし、画像をイメージカント（ImageQuant）ソフトで分析した。［14Ｃ］グリセロールトリオレエート標準物は、大量測定用ＴＬＣプレートで定量した。全ての統計処理は、期待値のための両側ｔ検定を用いマイクロソフトのエクセル分析ソフトで実施した。
【００３２】一工程抽出法：反応は、１５０μLのＡＥＳＳＭ、続いて３００μLのｎ−ヘプタンの添加によって停止させた。混合物を５回ピペットで出し入れして混合し、５分間室温で分離させた。上部相全体（ｎ−ヘプタン相）を新しい試験管に取り出し、シリカＴＬＣプレートにスポットし、上記のように（ＴＬＣ法の項を参照されたい）処理するか、またはシンチレーションカクテルを含む５mLのシンチレーションバイアルに入れて計測した。
【００３３】９６穴ＤＧＡＴマススクリーニングアッセイ試薬：［14Ｃ］オレオイルＣｏＡ、５０μCi／mL（２７９nCi／mLに希釈）およびアセトン：クロロホルム（８：２）に溶解した１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１９.５mM（ＤＡＢで６７２nMに希釈）から成るＤＧＡＴ基質ミクスをボルテックスミキサーで撹拌し、アッセイ実施まで氷上で保存した。凍結したミクロソームの部分標本（総蛋白質量が１０〜２０mf／mL）を氷上で融解し、ＤＡＢで希釈して０.０６２５mg／mLの使用ストックを作製し、アッセイ実施まで氷上で保存した。
【００３４】反応プロトコル：化合物は化合物マネージメント（PGRD, Ann Arbor）に発注し、これをＤＭＳＯに１０mMで溶解し、９６穴丸底ポリプロピレンプレートに１.０μLをスポットした。プレートを回転コンベヤーロボットにセットする。ロボットアームは３０μLの基質ミックスの添加のためにプレートをマルチドロップ１に移動させ、室温で１.０分震盪させる。ロボットアームは、２０μLの希釈ミクロソームの添加のためにプレートをマルチドロップ２に移動させ、１.０分室温で震盪させる。ロボットアームは回転コンベヤーにプレートを戻し、ここでプレートは室温で１.０時間インキュベーションされる。
【００３５】抽出プロトコル：ロボットアームは、１５０μLのＡＥＳＳＭの添加のためにプレートをマルチドロップ３に移動させる。ロボットアームは抽出開始のためにプレートをマルチメックに移動させる。反応容積は、マルチメック上の９６中穴ポリプロピレンプレートに移される。チップは、持続的に脱イオン水が流れている試薬槽で１００μLの脱イオン水で３回洗浄される。続いて、マルチメックは９６穴反応プレートを１００μLのｎ−ヘプタンで３回洗浄し、この容積を抽出プレートに移す。マルチメックは抽出プレートでこの容積（６×１００μL）を混合し、プレートを１０秒静置する。持続的に試薬が流れている試薬槽で１００μLの脱イオン水で３回チップを洗浄する。１００μLの上部ｎ−ヘプタン相をフラッシュプレートに移す。ロボットアームはフラッシュプレートを排気フードを備えた回転コンベヤーに移動させる（この排気フードでｎ−ヘプタンを最低６時間蒸発させることができる）。プレートをプレート封入装置に移動させて封入し、トップカウントシンチレーションカウンターに移動させて１.０分計測する。データを集め、トリリウム（Trillium）による化合物管理システムに伝える。
【００３６】実施例１ＤＡＧ溶媒：ＤＧＡＴ活性は以下のＤＡＧ溶媒の量を増加させながら測定した：エタノール、アセトン、クロロホルム、およびエタノール：クロロホルムまたはアセトン：クロロホルムの混合物、後者の混合物では、アセトンおよびエタノールの濃度は一定に保ち、一方クロロホルムの濃度を増加させた。ＤＧＡＴ活性はエタノールの濃度の増加とともに以下のように増加する（Ｒ2＝０.９６２６）：０.５％エタノールでコントロールの１２１％の顕著な増加（ｐ＝０.０１３）から４.０％のエタノールでコントロールの１８０％のレベルに増加、ｐ＝０.００５（図１Ａ）。ＤＧＡＴ活性はまたアセトンの濃度の増加とともに以下のように増加する（Ｒ2＝０.９９０１）：１０.０％アセトンでコントロールの３９４％のレベルに増加、ｐ＝０.０００６（図１Ｂ）。ＤＧＡＴ活性はクロロホルムの濃度の増加とともに以下のように増加する（Ｒ2＝０.９７６３）：０.３５％アセトンでコントロールの９５５％のレベルに増加、ｐ＝０.０００４（図１Ｃ）。エタノール：クロロホルム混合物を用い、エタノールを１.５％に維持したとき、ＤＧＡＴ活性はクロロホルムの濃度の増加とともに増加し（Ｒ2＝０.９８６６）、０.６％クロロホルムでコントロールの１４３６％のレベルに達する、ｐ＝０.０００４（図１Ｄ）。アセトン：クロロホルムの混合物を用い、クロロホルムの濃度を増加させたとき、アセトン１.６７％でＤＧＡＴ活性は増加し（Ｒ2＝１.０００）、０.８％クロロホルムでコントロールの５８１％のレベルに達する、ｐ＝０.００３。しかしながら、この増加は０.４％のクロロホルムを越えた後直線的でなくなる。クロロホルムの利点はアセトン濃度が１.６７％以上に増加したとき減少する（図１Ｅ）。
【００３７】既知量の［14Ｃ］トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）（トリグリセリドとしてもまた知られている）標準物をＤＧＡＴ反応と合わせてＴＬＣプレートにスポットし、種々の溶媒を用いて［14Ｃ］ＴＡＧ産生速度を求めた。［14Ｃ］ＴＡＧの産生は、０.８％トゥイーン８０、０.８％エタノール、１０％アセトン、２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）、および０.８％エタノール：クロロホルム（１：１）について、それぞれ２０±０.０２ピコモル、１０４±０.４ピコモル、９.５±０.０６ナノモル、２０.９±０.０２５ナノモル、および２２.５±０.５８ナノモル［14Ｃ］ＴＡＧ／mgミクロソーム蛋白質／分の範囲であった（表１）。全ての値はエタノールコントロールよりも顕著に高いかまたは低かった（ｐ＜０.００１）。
【００３８】トゥイーン８０と比較して、他の全ての溶媒はＤＧＡＴ活性を増強させ、もっとも劇的な増強はアセトン／クロロホルムまたは９５％エタノール／クロロホルムの混合物で観察され、それぞれ１０５７倍および１１４２倍であった。しかしながら、アセトン：クロロホルム（８：２）はＡＣＡＴおよびＥＡＴ活性を排除しＦＡＨ活性を９.４倍低下させるという大きな利点を示した（(図３Ａ）および（図３Ｃ)）。これらの利点によって、ＤＧＡＴアッセイで最初に用いた条件からミクロソームの濃度を３２倍減少させることができ、［14Ｃ］オレオイルＣｏＡ基質濃度は１２倍減少させることができた。
【００３９】ＤＧＡＴ活性は異なる溶媒で大きく変化したが、参考化合物（Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］［１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミド）のＩＣ50は比較的一定で２.０から２.６μMの範囲であった（表２）。
【００４０】実施例２ＴＬＣおよび一工程抽出法を用いた場合のＤＡＧ溶媒のエタノールとアセトン：クロロホルムの比較ＡＣＡＴ、ＥＡＴ、ＦＡＨおよびＤＧＡＴは０.８％のエタノールの存在下で活性を示す（図３Ａ）。一工程抽出プロトコルを用いたとき、ＡＣＡＴの生成物、コレステロールエステルおよびＥＡＴの生成物、エチルアシルエステルがＤＧＡＴに由来するトリグリセリドとともに抽出される（図３Ｃ）。２.１％のアセトン：クロロホルム（８：２）の使用によってＡＣＡＴおよびＥＡＴの生成物を排除し、さらにＦＡＨの活性を大きく減少させ、それによってＤＧＡＴの基質利用性を高める（図３Ｃ）。一工程抽出法で２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）を併用することによって、ＤＧＡＴによって得られる［14Ｃ］標識トリグリセリドの特異的産生および抽出が可能になる（図３Ｄ）。ＤＧＡＴ抑制のための参考化合物（Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］[１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミド）のＩＣ50は、０.８％エタノールおよびＴＬＣで実施したＤＧＡＴアッセイの２.６μMから、０.８％エタノール抽出およびＴＬＣ分離の２.４μM、２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）およびＴＬＣの２.０μM、２.１％アセトン：クロロホルム（８：２）抽出およびＴＬＣ分離の２.５μMの範囲である（図３）。
【００４１】実施例３４つの別個のラット肝ミクロソーム調製物に由来するＤＧＡＴ活性に対するＮ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ]［１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドの影響のＴＬＣ、一工程抽出／ＴＬＣおよび一工程抽出／シンチレーション法の比較Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］［１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドを用いて、４つの別々のラット肝ミクロソーム調製物のＤＧＡＴアッセイによって、［14Ｃ］トリグリセリド検出についてＴＬＣと一工程抽出法を比較し、さらにホスホイメージャーとシンチレーション法を比較した。群１、２、３および４のＩＣ50は、ＴＬＣ法単独、一工程抽出／ＴＬＣおよび一工程抽出／シンチレーション法の間でほんのわずか異なっただけであった（図４および表２）。
【００４２】実施例４ＤＧＡＴアッセイに対する時間と温度ＤＧＡＴアッセイを２２℃で２時間実施したとき、［14Ｃ］トリグリセリドの産生は７０分まで直線的態様で増加し（Ｒ2＝０.９７６０）、７０分過ぎから最後の１２０分まで平坦に進行する。ＤＧＡＴアッセイを３７℃で２時間実施したとき、［14Ｃ］トリグリセリドの産生は２５分まで直線的態様で増加し（Ｒ2＝０.９７５８）、２５分過ぎから最後の１２０分まで平坦に進行する（図５）。
【００４３】実施例５ＤＧＡＴ活性に対するＤＭＳＯの影響ＤＧＡＴを３７℃（Ｒ2＝０.８５６６）および２２℃（Ｒ2＝０.７９０７）の両方でアッセイしたとき、ＤＭＳＯはＤＧＡＴ活性を直線的態様で低下させる。３７℃および２２℃の両方について、ＤＭＳＯ濃度が４.５％に達したときのみ（ｐ＜０.０５）、ＤＧＡＴアッセイは顕著な変化を示した（図６）。
【００４４】実施例６ＤＧＡＴアッセイで産生された［14Ｃ］トリグリセリドの安定性に対するアルカリエタノール停止溶液ミックス（ＡＡＥＳＳ）の影響９６穴ＤＧＡＴマススクリーニング法の実施時に、ＤＧＡＴ反応は、１.０ＮのＮａＯＨを含むＡＡＥＳＳを添加し続いて一定時間（５分未満）保温することによって停止させられるが、その間にロボットはプレートを抽出のために移動させる。トリグリセリドは、ＡＡＥＳＳで見出されたように塩基性環境で加水分解に感受性を有する。ＤＧＡＴ反応生成物が抽出前にＡＡＥＳＳの存在下で保温されるとき、アッセイで産生された［14Ｃ］トリグリセリドは２０分までは保温による顕著な減少を示さなかった（Ｒ2＝０.１２２５、Ｐ＜０.０５）（図７）。
【００４５】実施例７手動抽出と比較した、９６穴ＤＧＡＴマススクリーニング法に対するＮ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］［１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドの影響マススクリーニングの抽出プロトコルを２つの別個の９６穴プレート（第一のプレートから６列、第二のプレートから８列、手動抽出に第一のプレートから２列）で、ＤＧＡＴ抑制物質Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］［１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドを用いて実施した。プレート１、プレート２、および手動抽出サンプルについてのＩＣ50は、それぞれ１.５０、１.２７、１.７０μMである（図８）。
【００４６】出願人らは、速度が遅く手間を要する方法であるＴＬＣを使用することなくＤＧＡＴ抑制物質のマススクリーニングを可能にする方法を開発するために、ＤＧＡＴアッセイの種々のパラメーターをテストした。基質、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを溶解するためにアセトン：クロロホルム溶媒を用いることによって、ＤＧＡＴ活性は１０００倍以上増加し、ＡＣＡＴおよびＥＡＴ活性は排除され、さらにＦＡＨ活性は９倍以上減少した。アセトン：クロロホルムを使用することによって、非常に高い［14Ｃ］トリグリセリド産生が可能になり、これにより一工程抽出法による抽出が容易になった。ＤＧＡＴアッセイ試薬の容積および一工程抽出法を調節することによって、本アッセイは９６穴様式に都合よくなった。後者の改変は、ＤＧＡＴ抑制物質の高処理性能を有するマススクリーニングを可能にした。９６穴ＤＧＡＴマススクリーニング法に最適の時間、温度およびＤＭＳＯ濃度が確立された。ＤＧＡＴ抑制物質、Ｎ−（７,１０−ジメチル−１１−オキソ−１０,１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］［１,４］オキサゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドは、ＤＧＡＴ抑制物質のスクリーニングとしての９６穴様式アッセイの有効性を示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】アッセイは３７℃で５分、エタノールについては４０μgミクロソーム蛋白質、２０nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを、アセトン：クロロホルムについては１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。数値は平均を表す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
a：トゥイーン８０に対してｐ＜０.００１【００４９】
【表２】
【００５０】アッセイは、３７℃で５分、反応当たり１.２５μgミクロソーム蛋白質、８.３nCi［14Ｃ］オレオイルＣｏＡおよび４０３μMの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールを用いて実施した。
【００５１】これらの実施例は、ＤＧＡＴ活性の測定およびＤＧＡＴ活性の調節物質としての化合物の高効率スクリーニングのために本発明の方法が有用であることを明瞭に示している。前述の記載から、本発明の多数の改変および変更が容易に実施できることは理解されよう。本明細書に示した考察、記述および実施例は本発明の具体的な実施態様の説明であって、本発明の実施を限定しようとするものではない。本発明の範囲を規定するものは以下の請求の範囲（その同等物を包含する）である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】３９１０１１３０８
【氏名又は名称】ワーナー−ランバート・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＷＡＲＮＥＲ ＬＡＭＢＥＲＴ ＣＯＭＰＡＮＹ
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| 【出願日】 |
平成１３年１２月２７日（２００１．１２．２７） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００９１７３１
【弁理士】
【氏名又は名称】高木 千嘉 （外２名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−３０６１９９（Ｐ２００２−３０６１９９Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年１０月２２日（２００２．１０．２２） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−３９６１３９（Ｐ２００１−３９６１３９） |
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