| 【発明の名称】 |
医薬候補を減少させるための高処理量スクリーン |
| 【発明者】 |
【氏名】マイケル ジョン エイベリー
【氏名】ウェイチャオ ジョージ チェン
【氏名】ハッサン ゴーダ フォーダ
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| 【要約】 |
【課題】医薬製品の毒性に寄与する反応性代謝産物を作り出す医薬候補を同定する高処理量方法の提供。
【解決手段】本発明は、反応性代謝産物を作り出す医薬候補の同定方法であって：ａ）グルタチオンの存在下、ミクロソームの医薬代謝酵素系とともに上記医薬候補をインキュベートし、そして；ｂ）ステップａ）において形成されたグルタチオン・コンジュゲートを検出する、前記方法に関する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 反応性代謝産物を作り出す医薬候補を同定する方法であって：ａ）グルタチオンの存在下、ミクロソームの医薬代謝酵素系とともに上記医薬候補をインキュベートし；そしてｂ）ステップａ）において作られる場合、グルタチオン・コンジュゲートを検出する、を含む前記方法。
【請求項２】 高処理量の方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】 前記ミクロソームの医薬代謝酵素系がヒト肝臓系である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】 前記グルタチオン・コンジュゲートが、タンデム・マス・スペクトロメトリーにより同定される、請求項１に記載の方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】本発明の背景医薬候補の毒性は、予備的な開発の間の減少のかなりの部分の原因である。開発及び商業化の後に、有害な反応を示す治療剤は競争力がなく、そして究極的には市場から姿を消すかもしれない。早い時機に、潜在的に毒性をもつ化合物を取り除くためにＤｉｓｃｏｖｅｒｙスクリーンを実施することは、開発段階に入るＤｉｓｃｏｖｅｒｙ候補の全てがより高い生存率を達成することを可能にするであろう。開発後、選択された医薬は、競争力のある利点を、そしてより好ましい治療係数を享受する可能性が高くなるであろう。
【０００２】１の共通な毒性モードは、親電子性反応代謝産物の形成であり、これは、生きた細胞タンパク質及び核酸内に存在する求核基への共有結合によりそれらの毒性を顕出する（１−２）。全ての毒物学的顕出が反応性代謝産物に帰されるわけではないけれども、文献のかなりの部分は、医薬の生物活性化の結果として形成された化学反応性代謝産物の不適当な解毒が、組織壊死（３−４）、発癌（５）、催寄形（６）、及び免疫仲介毒性（７）のための病原メカニズムであることを示唆する。
【０００３】
【化１】
【０００４】
【化２】
【０００５】
【化３】
【０００６】本発明の要約本発明は、反応性代謝産物を作り出す医薬候補を同定する方法であって：ａ）グルタチオンの存在下、ミクロソームの医薬代謝酵素系とともに上記医薬候補をインキュベートし；そしてｂ）ステップａ）において作られる場合、グルタチオン・コンジュゲートを検出する、を含む前記方法を提供する。
【０００７】本発明は、さらに、高処理量の方法である、反応性代謝産物を作り出す医薬候補の同定方法を提供する。本発明は、さらに、前記医薬酵素系がヒト肝臓系である、反応性代謝産物を作り出す医薬候補の同定方法を提供する。本発明は、反応性代謝産物を作り出す医薬候補を同定する方法であって：グルタチオンの存在下、ミクロソームの医薬代謝酵素系とともに上記医薬候補をインキュベートし、そしてタンデム・マス・スペクトロメトリーによりグルタチオン・コンジュゲートを検出する、ことを含む前記方法をも提供する。
【０００８】本発明の詳細な説明本発明は、反応性代謝産物を作り出す能力を有する候補を同定する高処理量方法を提供する。それは、反応性中間体を除去するための自然のメカニズムの中の１つ：ブルタチオンとの結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を利用する。その求核スルフヒドリル基を通じて、グルタチオンは、その反応性親電子性成分に結合して安定なＳ−置換付加物を形成する化学的に反応性の種に対して重要な細胞構成成分を保護する（８）。グルタチオンによるアセトアミノフェノン親電子性代謝産物の解毒は、上記保護の古典的な例の中の１つである。ヒト肝ミクロソームの医薬代謝酵素系及びグルタチオンとともにインビトロにおいてインキュベートすることにより生成されるグルタチオン・コンジュゲートを検出するための広く行われている分析方法は、反応性代謝産物への生物活性化を経験する化合物を同定するであろう。この分析方法は、タンデム・マス・スペクトロメトリーを利用する。衝突誘導分解の間に、全てのグルタチオン付加物は、ピログルタミン酸成分（１２９Ｄａ）の自然な損失を経験する。１２９Ｄａの特徴的な自然損失は、代謝活性化その後のコンジュゲーションを介して生成されているグルタチオン・コンジュゲーションの特異的な検出を許容する（９）。
【０００９】本発明の方法は、信頼性がある、迅速で、簡単な、そして高処理量自動化になじむものである。上記インキュベーション・ステップは、Ｊ．Ｊａｎｉｓｚｅｗｋｉにより開発された加熱（ｈｅａｔｅｄ）ブロック９６ウェル・インキュベーション法に従い、容易に自動化されることができる。サンプル調製及び抽出ステップはＱｕａｄｒａ ９６ ＳＰＥを用いて自動化される（１０）。上記分析ステップは、特に簡単であり、化合物特異的最適化を要求しない。我々は７分間の運転時間をもってクロマトグラフィーを使用したけれども、上記アッセイの特異性は、サンプル当り１分間の運転時間が実行可能であることを示唆する。従って、１日当り１０００を上廻る化合物の処理量は、デュアル・カラム・スイッチング・システムを使用することにより達成されることができる。
【００１０】上記方法は、その毒性が、医薬代謝性酸化Ｐ４５０系による生物活性化により生成される反応性代謝産物により仲介されるところの最高の毒性化合物を検出するであろう。それは、グルタチオンと安定性付加物を形成しない反応性代謝産物（例えば、フリー・ラジカル）又は非ミクロソーム酵素により形成されるものを検出しないであろう。
【００１１】実施例インビトロ・インキュベーション及びサンプル調製５００μＭ基質、１mMグルタチオン（ＧＳＨ）、１μＭ Ｐ４５０、及び１００mM リン酸カリウム・バッファー（pH７．４）を含有するヒト肝ミクロソーム（ＨＬ−ｍｉｘ−１１）インキュベーション混合物を３７℃で３分間事前インキュベートした。この反応を、ＮＡＤＰＨ−生成系（０．５４mM ＮＡＤＰ+ ，１０mM ＭｇＣｌ2 ，６．２mM ＤＬ−イソクエン酸、及び０．５Ｕ／mlイソクエン酸デヒドロゲナーゼ）の添加により開始した。最終インキュベーション容量は１mLであった。ＮＡＤＰＨ又は基質を含まないサンプルを、ネガディブ・コントロールとして使用した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、上記インキュベーション混合物を１０分間３，５００rpm で遠心分離にかけた。上記上清を自動化された９６−ウェル固相抽出により調製した（１０）。これは、タンパク質の除去、１００μｌの水による３回の洗浄、及び１００μｌのアセトニトリルによる溶出を含んでいた。溶媒留去の後、残渣を１００μｌの出発移動相に溶解させた。
【００１２】ＨＰＬＣ／ＭＳ分析クロマトグラフィーによる分離は、ＣＴＣ ＰＡＬオートサンプラーによるインジェクション後、ＨＰ１１００ ４連 ＨＰＬＣポンプを使用した。調製されたサンプルのアリコート（２０μｌ）を、３μｍ粒子を充填した２×３０ Ｃ１８ カラム上にインジェクトした。この分析を、０．２ｍｌ／分の移動相流速、そして１分間の初期保持後５分間にわたり、５／９５アセトニトリル／１０mM酢酸アンモニウムから８／２０までの速いグラジエントを用いて行った。このＨＰＬＣカラム溶出液を、ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ ３０００トリプル四重極のＴｕｒｂｏｌｏｎｓｐｒａｙ源に導入した。このイオン源は６Ｌ／秒の窒素乾燥ガスを使用し、そして５２００Ｖにおける陽イオンモード、４５０℃、及び７の噴霧器設定において操作された。窒素を、９の設定において、カーテン・ガスとして、そして５の設定において、衝突ガスとして使用した。上記イオン源内で形成された陽イオンは、１０Ｖに保たれたオリフィスを通して真空室内にサンプル採取され、そして１９．４eVの実験室フレーム・エネルギーにおいて第２の四重極内で衝突活性化された。上記質量分析計を、中性損失モードにおいて操作し、約２．４秒においてｍ／ｚ３２０〜８００のレンジにわたりスキャンした。
【００１３】知られた毒性特性をもつ選択された薬物への適用本法を、多様な化学構造及び毒性特性を表す２０の商業的に入手できる治療剤に適用することにより評価した。上記化合物の半分は（表１）、望ましい安全特性を有することが知られている。他の半分（表２）は、反応性代謝産物を作り出すことが知られている。
【００１４】ＮＡＤＰＨ又は基質を含まない対照サンプルは、ｍ／ｚ３４８において応答を表す遅い溶出マトリックス・ピークの出現を示した（図１）。ＧＳＨ分子イオンの質量対電荷比は３０８であるので、このマトリックス・ピークは、上記スキャン・レンジを僅かに高く開始することにより（３２０ｍ／ｚの代わりに３５０）除去されることができる。図１〜４中に示すクロマトグラムを、ｍ／ｚ３５０から８００に上記イオン電流を再構築することにより得た。それぞれのサンプル・セットについて、ネガティブ・コントロール・サンプルとポジティブ・コントロール・サンプルを含めることが推奨される。
【００１５】２０の商業的に入手可能な化合物を用いた上記評価からの結果は（図２〜４）、本法が反応性代謝産物の形成を容易に検出することを証明した。望ましい安全特性を有する１０の化合物のそれぞれが陰性応答を作り出した（図２）。これは、上記方法が偽陽性応答を作り出さないことを示唆する。反応性代謝産物を生成することが知られている１０の化合物からの８は、陽性応答を作り出した（図３）。上記の陽性応答は、広いレンジの反応性代謝産物をカバーする（表１）。これらは、キノン・イミン（アセトミノフェノン及びインドメタシン）、ニトレニウム（クロザピン）、エポキシド（カルバマゼピン）、キノン（４−ヒドロキシアニソール）、及びキノン・メチド（ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、及び４−イソプロピルフェノール）を含む。インドメタシンからの上記反応性代謝産物の形成は、いくつかの逐次的な酸化ステップを要求する（１３）。これらの結果は、本法が、多酸化ステップから生じるものを含む最も反応性の高い代謝産物を検出するということを示唆する。
【００１６】本アッセイにおいて反応性代謝産物を生成することが知られているが陽性応答を作り出さなかった２つの化合物は、バルプロ酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）とフェニトイン（ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）である（図４）。しかしながら、上記バルプロ酸反応性代謝産物（２，４−ジエン−ＶＰＡ）の形成は、４０エンＶＰＡを形成するためのミクロソームＰ４５０酸化だけでなく、２，４−ジエン−ＶＰＡを形成するためのミトコンドリア・コエンザイムＡ依存性プロセスにより触媒されるβ−酸化を要求する（１９）。フェニトインに関しては、上記反応性代謝産物は、エポキシドの代わりのフリー・ラジカルである（２０）。ＧＳＨは上記フリー・ラジカルを還元し、そしてフェニトインの共有結合を還元することができるが、ＧＳＨはそれと安定した付加物を形成することができない。明らかに、本スクリーンは、ミクロソームＰ４５０系を介する生物活性化により形成される反応性代謝産物、そして特に、グルタチオンと安定性付加物を形成するものだけを検出する。
【００１７】テストされた上記化合物の中の３つは、キノン・メチド反応性代謝産物を作り出す。１２９の中性損失のスキャンのピーク応答は、先に記載された（６）相対的なキノン・メチド形成速度にひじょうによく相関した、すなわち、クレゾール＜ｐ−クレゾール＜４−イソプロピルフェノール（図２）。これは、提案されたスクリーンが同一シリーズ内のいくつかの化合物について、反応性代謝産物の形成の程度を比較するために、潜在的に使用されることができるということを示唆する。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
【表３】
【００２１】
【表４】
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| 【出願人】 |
【識別番号】３９７０６７１５２
【氏名又は名称】ファイザー・プロダクツ・インク
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| 【出願日】 |
平成１３年４月２４日（２００１．４．２４） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００７７５１７
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 敬 （外４名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２３８５９７（Ｐ２００２−２３８５９７Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年８月２７日（２００２．８．２７） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−１２５７５８（Ｐ２００１−１２５７５８） |
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