| 【発明の名称】 |
リアルタイムザイモグラフィーによる酵素およびその阻害物質の検出・活性測定方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】服部 俊治
【氏名】入江 伸吉
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| 【要約】 |
【課題】従来のザイモグラフィーと比較してより高感度、簡便、定量性に優れた蛋白質分解酵素およびその阻害蛋白質の検出法を提供すること。
【解決手段】当該検出法は、電気泳動による蛋白質分解酵素の検出・活性測定に当たって、ゲル中に蛍光標識した基質を用いることを特徴とする。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 電気泳動による酵素の検出・活性測定に当たって、ゲル中に蛍光標識した基質を用いることを特徴とする酵素の検出・活性測定方法。
【請求項２】 電気泳動による酵素阻害剤の検出、活性測定に当たって、ゲル中に蛍光標識した基質を用いることを特徴とする酵素阻害剤の検出・活性測定方法。
【請求項３】 前記基質を蛍光色素で標識することにより蛍光標識を行い、該蛍光色素がフルオレセインイソチオシアネートであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の方法に用いられるための蛍光標識した基質。
【請求項５】 請求項４に記載の蛍光標識した基質を含む酵素または酵素阻害剤の検出・活性測定用キット。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医学、生命科学分野における高感度な検査法に関し、更に詳細には、測定方法が簡易で、測定時間も短く、より簡便な酵素および酵素阻害剤の検出・活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素の検出法には様々な方法があるが、酵素活性と酵素分子量が同時に測定できる方法としてザイモグラフィーという手法が広く用いられている。この方法は、電気泳動を利用する方法であり、あらかじめゲル中に酵素の基質となる蛋白質を封入し、電気泳動後一定時間ゲルを酵素反応液中に浸透させた後、ゲルをクマシーブリリアントブルー等の蛋白質の染色液中で染色する。酵素の存在する位置は、基質が分解されて存在しなくなるため白く抜けて見え、その位置と抜けた度合いによって、分解酵素のおよその活性と分子量が同時に測定できる方法である。
【０００３】一方、電気泳動後、酵素反応液中に分解酵素を共存させると、染色後のゲル全体は、基質が分解され白く抜けるが、酵素阻害物質が存在する場合、その部分の基質が分解されないため染色されたバンドとして検出される。このような性質を利用した方法はリバースザイモグラフィーと呼ばれ、酵素阻害蛋白質の検出に利用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】これらの従来提案されているザイモグラフィーは、広く用いられているもののいくつか問題点がある。
【０００５】第一に、結果が蛋白質の染色後にしか分からないため、あらかじめ予備実験を行わないと適切な酵素反応時間の設定ができないという問題点がある。反応時間が短すぎると十分な感度が得られない一方、反応時間が長すぎると反応が進みすぎて、定量性が失われる。この問題は特に酵素阻害蛋白質を検出するリバースザイモグラフィーでは深刻で、適切な反応時間で行わないと全く結果が得られない場合がある。
【０００６】第二に、バンドの検出には蛋白質用の染色液を用いるため、被検査試料中に大量の蛋白質が混在した場合、たとえ試料中の酵素が基質を分解したとしても、試料中の混在蛋白質の分子量が測定しようとする蛋白質の分子量に近いと白く抜けたバンドが観察されず、酵素活性を見落とす可能性があり、正確な測定を行うことが困難な場合があるという欠点がある。特に、リバースザイモグラフィーでは、逆に試料中に混在した蛋白質が反応液中の酵素で消化しきれずに残った場合に、実際には阻害蛋白質でないものを阻害蛋白質と見誤る可能性がある。
【０００７】第三に、蛋白質の染色および脱染色には大量のアルコールと酢酸を用いるため、その廃液処理が必要になるという欠点がある。したがって、従来のザイモグラフィーによる酵素や酵素阻害剤の検出・活性測定方法は、種々の欠点があり、より簡便な測定方法が要望されているのが現状である。特に、マトリックスメタロプロテアーゼと呼ばれるマトリックス分解酵素群は、現在癌の転移との関連性が指摘され、その簡便な測定法がますます必要とされている。またこの酵素の阻害剤は、癌転移阻害剤としての可能性が指摘されており、いくつかの阻害剤は臨床試験まで進んでいる。さらに広くマトリックスメタロプロテアーゼ群の阻害剤をスクリーニングするためには、その阻害剤の簡便な測定法の開発も要望されている。
【０００８】従って、本発明の課題は、測定方法が簡易で、測定時間も短く、より簡便な蛋白質分解酵素および蛋白質分解酵素阻害剤の検出・活性測定方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題を解決すべく検討した結果、従来のザイモグラフィー法においてゲル中にあらかじめ蛍光標識させた基質を存在させることにより前記目的を達成しうることを知見した。
【００１０】すなわち、本発明は、電気泳動による酵素の検出・活性測定に当たって、ゲル中に蛍光標識した基質を用いることを特徴とする酵素の検出・活性測定方法にある。
【００１１】さらに本発明は、電気泳動による酵素阻害剤の検出・活性測定に当たって、ゲル中に蛍光標識した基質を用いることを特徴とする酵素阻害剤の検出・活性測定方法にある。
【００１２】また、本発明は、前記酵素または酵素阻害剤の検出・活性測定方法において、前記基質を蛍光色素で標識することにより蛍光標識を行い、該蛍光色素がフルオレセインイソチオシアネートであることを特徴とする酵素または酵素阻害剤の検出・活性測定方法にある。
【００１３】さらに本発明は、電気泳動による酵素または酵素阻害剤の検出・活性測定に用いられる、蛍光標識した基質にある。また、本発明は電気泳動ゲル中に前記蛍光標識した基質を含む、酵素または酵素阻害剤の検出・活性測定用キットにある。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の方法では、反応を中断せずに分解過程が随時測定できることから、本明細書中では、本発明の酵素の検出・活性測定方法を「リアルタイムザイモグラフィー」と、酵素阻害剤の検出・活性測定方法を「リアルタイムリバースザイモグラフィー」と称することがある。
【００１５】以下、本発明の好ましい１実施形態について説明する。本発明の電気泳動に用いられるゲル化剤には、ポリアクリルアミド、アガロース等があり、ゲル化剤としてポリアクリルアミドを含有させるのが好ましい。ゲルは、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）等の界面活性剤を含有しているのが好ましい。ゲル化剤の濃度は、通常、１〜１５重量％、好ましくは、３〜１０重量％であり、ゲル化剤としてポリアクリルアミドを使用する場合、通常、５〜１５重量％、好ましくは、１０〜１２重量％である。ゲル中のＳＤＳ等の界面活性剤の濃度は、通常、０．０１〜１．０重量％、好ましくは、０．０５〜０．５重量％、最も好ましくは、０．１重量％である。
【００１６】本発明方法では、電気泳動による酵素、特に、蛋白質分解酵素または酵素阻害剤の検出・活性測定に当たって、ゲル中に蛍光標識した基質を用いる点に特徴がある。
【００１７】本発明の方法により検出され得る酵素には、従来のザイモグラフィー法で検出できるすべての酵素、すなわち、電気泳動によって酵素活性が不可逆的に失活しないかぎりどのような酵素でも検出でき、例えば、蛋白質分解酵素、多糖分解酵素等が挙げられる。特に、蛋白質分解酵素が好ましく、蛋白質分解酵素には、マトリックスメタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン等がある。
【００１８】本発明の方法により検出され得る酵素阻害剤には、同様に、従来のリバースザイモグラフィー法で検出できるすべての酵素阻害剤があり、特に、蛋白質分解酵素阻害剤が好ましく、蛋白質分解阻害剤にはＴＩＭＰ（tissue inhibitor of metalloprotease ）、大豆トリプシンインヒビター等がある。
【００１９】本発明において用いられる前記基質としては、測定しようとする酵素や酵素阻害剤の特異性に対応していかようにも選ぶことができる。例えば、測定しようとする酵素が蛋白質分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの場合、コラーゲン、特に、ウシＩ型コラーゲン、ゼラチン、カゼイン、エラスチン、フィブリン等が好ましく、測定しようとする酵素阻害剤が蛋白質分解酵素阻害剤であるトリプシン阻害剤の場合、ウシ血清アルブミン等が好ましく、ＴＩＭＰの場合、変性コラーゲン等が好ましい。
【００２０】また、前記蛍光標識は、前記基質を蛍光色素で標識することにより行われる。この際用いられる前記蛍光色素としては、基質に結合することができ、蛍光測定装置で測定できる蛍光波長の特性を持つかぎりどのような蛍光色素も利用可能であるが、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(以下、「FITC」と称す)、ローダミン等が挙げられ、中でも特にFITCが好ましい。
【００２１】基質に蛍光色素を結合させて標識する方法は公知の方法で実施できる。例えば、コラーゲンにFITCを標識する場合、所定の濃度のコラーゲン０．０１Ｍ酢酸溶液と等量の０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）とを混和し、得られたコラーゲン溶液に別に調製したFITCアセトン溶液および前記炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）のFITC溶液を合わせて、遮光下所定時間所定温度で反応させる。反応後、適当な単離・精製方法を使用してFITC−標識コラーゲンを得る。（例えば、永井裕、堀久枝、服部俊治、砂田泰伸、寺戸国昭、橋田亮一、宮本和代 「コラゲナーゼ活性の簡易微量測定法の開発とその応用 part１ＦＩＴＣ-標識コラーゲンを用いたコラゲナーゼ活性微量測定法」 炎症 ４ 121-130,1984を参照されたい。）前記基質のゲル中の濃度は、特に限定されないが、通常、０．０１〜０．５重量％であり、好ましくは、０．０５重量％である。
【００２２】本発明の検出・活性測定方法は、前記蛍光標識した基質を用いる以外は、従来のザイモグラフィーまたはリバースザイモグラフィー法と同様に行うことができる。例えば、蛍光標識した基質を所定の濃度で含むＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で試料を電気泳動する。ここで、当業者は、電気泳動の条件を適宜設定できる。電気泳動後、そのゲルからTriton X-100を含むバッファーでＳＤＳを除去し、分離蛋白質を再生する。その後、適当な条件下で反応させ、適当な蛍光検出器、例えば、DNA用の紫外線トランスイルミネーター、フルオロイメージアナライザー等を用いてゲル中の基質蛋白質の分解の程度を測定する。写真撮影の場合には用いた蛍光色素に適するフィルターを用いるのが好ましい。
【００２３】本発明の蛍光標識した基質は、リアルタイムザイモグラフィー法またはリアルタイムリバースザイモグラフィー法を行うためのその他の試薬と共にキット化することができる。例えば、あらかじめ、本発明の蛍光標識した基質を含むアクリルアミドゲルを必要なバッファーと共に供することによりキット化できる。
【００２４】本発明の検出・活性測定方法によれば、電気泳動によって酵素活性が不可逆的に失活しないかぎり、基質および測定する分解酵素の種類はいかようにも変えることができる。そして、蛍光検出は酵素反応を中断することがないので、任意の時間に基質の分解を測定し記録に残すことができる。よって適切な酵素反応時間を、基質の分解をモニターしながら予備実験なしで設定できる。また異なった反応時間での分解状態の測定が同一のゲル上で可能なため、定量性の範囲も広くとることができる。これらの理由で本発明の方法によって、前記の第一の課題点は解消される。
【００２５】さらに、蛍光検出器によって検出されるものは、基質として使用した蛋白質だけで、試料中に混在する他の蛋白質の影響も受けないため、第二の課題点も解消される。
【００２６】蛍光標識した蛋白質の検出には、蛋白質の染色は必要がないので、廃液処理の問題も回避され、環境問題にも対処できる方法である。また染色および脱染色の過程を伴わないため、結果が即座に得られ実施時間の節約にもなり、前記の第三の課題点も解消される。
【００２７】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。尚、以下の記載で％は特に説明しない限り重量％を示す。
【００２８】（実施例１）
マトリックスメタロプロテアーゼの検出-リアルタイムザイモグラフィー０．４％ウシI型コラーゲン溶液（０．０１Ｍ酢酸に溶解）を、等量の０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に滴加しながら混和する。別に、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)溶液（１０μｇ／ｍｌ、１％炭酸ナトリウム溶液、２５ｍｌ）を上記のコラーゲン溶液に加え、遮光下、３時間２５℃で攪拌した。反応後、冷暗所（以降の操作は冷暗所で行う）でコラーゲン溶液を４℃に冷却し、６ＭＨＣｌの滴加により中和した後、固形ＮａＣｌを加え最終濃度２０％になるように加えて一昼夜攪拌をし、その後遠心分離に（５，０００ｒｐｍ、２０分）により粗FITC標識コラーゲンを沈殿として回収した。得られた粗FITC標識コラーゲンをＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーに付して精製した。
【００２９】得られた精製FITC標識コラーゲンを約８０℃で、５分間熱変性させた後、当該標識コラーゲンの最終濃度が0.05%となるように、アクリルアミドを１０％（最終濃度換算）で含有させるトリス緩衝液（ｐＨ９．５）中に溶解させ、得られた溶液１０ｍｌにTEMED（N-N-N'-N7テトラメチルエチレンジアミン）５μｌおよび１０％過硫酸アンモニウム５０μｌを加えてアクリルアミドをゲル化させた。別に、トリス緩衝液（ｐＨ７．６）を使用してマトリックスメタロプロテアーゼ２(MMP2)標品（ヤガイ社製）の五倍希釈系列を作成し、500マイクロユニットから0.16マイクロユニットまでの濃度のMMP2を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
【００３０】電気泳動後、ゲルは2.5％トリトンＸ-100を含む酵素反応溶液（0.2％食塩、5ミリモル塩化カルシウム、トリス-塩酸緩衝液ｐＨ7.5）中で10分間ごとに３回洗って、SDSを除いた。その後、ゲルを酵素反応溶液中で振盪して37℃で反応させる。１時間ごとにゲルを取りだし、紫外線トランスイルミネーター（スペクトロライン社、モデル「TC312A 312nmUltraviolet」）上でゲルを観察する。この際、ゲルは緑に発色し（図１Ａ）、酵素が存在している位置は、暗いバンドとして観察される。写真撮影は、富士写真フィルム社製「ゼラチンフィルター」（商品名「SC52」 520nm以下の波長をカット）を通して、富士写真フィルム社製商品名「SF3000」フィルムを用いた。尚、図１Ａは、4時間反応させた場合の蛍光標識基質を用いたリアルタイムザイモグラムの模写図であり、図１Ｂは、同一時間反応させた場合の、従来法のザイモグラムの模写図である。レーン１；500マイクロユニット、レーン2；100マイクロユニット、レーン3；20マイクロユニット、レーン4；4マイクロユニット、レーン5；0.8マイクロユニット、レーン6；0.16マイクロユニットのMMP2を試料とした。
【００３１】写真撮影したバンドは、画像解析ソフト（「NIHイメージ」）を用いてバンドの濃度を定量化した。図１ＡおよびＢに示す結果から明らかなように、同一時間（4時間）の酵素反応で、蛍光標識基質を用いた本発明の方法では、従来のザイモグラフの約5倍の感度が得られた。
【００３２】また、図２に示すように、4時間での検出限界は20マイクロユニット、48時間では0.8マイクロユニットであった。また異なった時間での測定を組み合わせて、500マイクロユニットから0.8マイクロユニットまでの範囲で定量的に酵素活性が測定できた。尚、図２および３には、蛍光標識基質を用いたリアルタイムザイモグラフィーの4時間反応時と2０時間反応時での酵素活性の定量性を示す。
【００３３】（実施例２）
ティッシュインヒビターオブメタロプロテアーゼ1（TIMP1）の検出（リアルタイムリバースザイモグラフィー）実施例１と同様にFITC標識コラーゲンを含む１２％SDSポリアクリルアミドゲルを作成した。ただしこの中にMMP-9を2ユニット含むようにした。このゲル中で200ナノグラムから0.32ナノグラムまでの5倍希釈系列のTIMP-1（富士薬品製）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
【００３４】電気泳動後、ゲルは実施例１と同様2.5％トリトンＸ-100を含む酵素反応液中で10分間ごとに3回洗って、SDSを除いた。その後、ゲルを酵素反応液中で振盪して37℃で反応させる。一定時間ごとに実施例１と同様の方法で写真撮影した。TIMP1 は緑に発色した約3万の分子量のタンパク質として検出された。24時間のインキュベートで、1.6ナノグラムまで少量のTIMP1が検出された。
【００３５】（実施例３）
トリプシン阻害蛋白質の検出（リアルタイムリバースザイモグラフィー）FITC標識ウシ血清アルブミンとしてシグマ社製「アルブミンボバインフルオレセインイソチオシアネート」（商品名：ＦＩＴＣアルブミン）を使用した。
【００３６】このFITC標識アルブミンを最終濃度0.05％で含む、１２％ポリアクリルアミドゲルを実施例１と同様に作成した。このアクリルアミドゲル中で10マイクログラムから1ナノグラムまでの10倍希釈系列（トリス緩衝液（ｐＨ７．６）で希釈）大豆由来トリプシンインヒビター（シグマ社製）を電気泳動によって分離した。電気泳動後、ゲルは、2.5％トリトンＸ-100を含むリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）中で10分間ごとに3回洗った。その後トリプシン10マイクログラム／ミリリットル含むリン酸緩衝液中でゲルを振盪させながら反応させた。実施例１と同様に一定時間毎に、トランスイルミネーター上でゲルを観察し、写真撮影を行った。この場合、ゲルは蛍光を失い、阻害剤が位置するバンドは酵素消化を免れて、蛍光が残るので緑色に発色して観察される（図３）。大豆由来トリプシンインヒビターの検出限界は、18時間酵素消化で1ナノグラムであった（図３）。尚、図３は、蛍光標識基質を用いたリバースザイモグラフィーによるトリプシンインヒビターの検出を行った際の模写図であり、レーン１；1マイクログラム、レーン2；100ナノグラム、レーン3；10 ナノグラム、レーン4；1ナノグラム、レーン5；0.1ナノグラム、レーン6；0.01ナノグラムの大豆由来トリプシンインヒビターを試料とした。
【００３７】
【発明の効果】本発明の検出・活性測定方法によれば、測定方法が簡易で、測定時間も短く、より簡便な方法が提供される。
【００３８】具体的には、蛋白質分解酵素およびその阻害蛋白質の検出が簡便に可能になり、定量性、検出バンドの信頼性も増した。また実施に係わる環境に負担をかける薬品使用量を大幅に減ずることが可能になった。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９９０５５４３０
【氏名又は名称】財団法人日本皮革研究所
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| 【出願日】 |
平成１３年１月３１日（２００１．１．３１） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８９７０５
【弁理士】
【氏名又は名称】社本 一夫 （外５名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２２３７９２（Ｐ２００２−２２３７９２Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年８月１３日（２００２．８．１３） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−２３７８１（Ｐ２００１−２３７８１） |
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