| 【発明の名称】 |
抗体の作製方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】瀬谷 司
【氏名】松本 美佐子
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| 【要約】 |
【課題】
【解決手段】抗原タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ動物細胞を培養し、抗原タンパク質を発現させた後、該細胞を該細胞と同種の動物に免疫することを特徴とする、該タンパク質に対する抗体の作製方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 抗原タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入した動物細胞を培養し、抗原タンパク質を発現させた後、該細胞を該細胞と同種の動物に免疫することを特徴とする、該タンパク質に対する抗体の作製方法。
【請求項２】 抗原タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドが動物細胞で働くプロモーターを含有する発現ベクターであるＤＮＡを使用すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】 免疫する動物細胞とアジュバントとを混合した懸濁液を動物に免疫すること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】 抗原タンパク質が非分泌タンパク質であること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】 免疫する動物が哺乳類又は鳥類であること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】 動物細胞及び免疫する動物が、ウサギ由来細胞及びウサギ、マウス由来細胞及びマウス、ヤギ由来細胞及びヤギ、ラット由来細胞及びラット、サル由来細胞及びサル、ヒツジ由来細胞及びヒツジまたはニワトリ由来細胞及びニワトリの少なくともひとつであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体の作製方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、従来未知の全く新しいタイプの抗体作製方法に関するものであって、従来必須であった抗原タンパク質の精製工程を必要とせずしかも効率的に抗体を作製できる全く新しいタイプの抗体作製方法に関するものである。
【０００２】更に詳細には、本発明は、遺伝子組換え技術により、動物細胞に抗原タンパク質をコードするＤＮＡを組み込み、該動物細胞を培養して抗原タンパク質を発現させ、これを該動物細胞と同種の動物に免疫して、該抗原タンパク質に対する抗体を作製する方法である。本方法により作製された抗体は、医薬、診断薬、研究試薬として有効に使用することができる。
【０００３】
【従来の技術】抗体は、特定の抗原を認識して結合する性質を持つため、特定タンパク質の検出、精製などの目的で医薬、診断薬、研究試薬として広く利用されている。抗体はこのように産業上有用であるが、その作製方法としては、抗原タンパク質を産生する臓器または血液などの体液や、遺伝子組換え技術によって生産された抗原タンパク質を含む培養液などから抗原タンパク質を精製し、これを動物の静脈や皮下又は皮内に注射・免疫し、免疫した動物の血清中に産生された抗体を得るという方法で作製されている。
【０００４】このようにして抗体を作製するには、抗原タンパク質に夾雑物が含まれていると、これを動物に免疫した場合、夾雑物に対する抗体が副生するため、抗原タンパク質は高度に精製する必要がある。また、少量の抗原タンパク質では、これを動物に免疫しても、それに対する抗体は生産されない。したがって、抗体作製のためには、高度に精製された抗原タンパク質が大量に必要である。
【０００５】しかしながら、上記した従来の方法では、抗原タンパク質は、臓器や血液などの体液、あるいは遺伝子組換え技術によって生産された抗原タンパク質を含有する培養液から分離、精製しているが、これら体液や培養液中には各種夾雑物が含まれているため、これを高度に精製しなければならないが、それにはデリケートな精製工程が必要であり、またそれらは多大な努力を要する。また、このような従来法では抗原タンパク質を必要量調製するにも多大な労力を要するし、このような状態で抗原タンパク質を動物に免疫しても、抗原タンパク質の精製度及び／又はその量が充分でない場合が多々あり、その場合には目的とする抗体は生成されず、実験動物が無益に消費されてしまう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗原タンパク質の精製を必要とせず、抗体の作製率も高く、実験動物の浪費が少ない抗体の作製方法を提供する目的でなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、各方面から鋭意研究の結果、抗原タンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクター（免疫しようとする動物細胞において機能するプロモーター含有）に組み込み、この発現ベクターを動物細胞に移入し、この動物細胞を培養することにより抗原タンパク質を発現させ、これを動物細胞と同種の動物に免疫したところ、拒絶反応が全く引き起こされることなくしかも動物体内で抗原タンパク質に対する抗体が得られるという全く新規にして有用な知見を得た。
【０００８】すなわち、本発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子組換え技術により、抗原タンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、動物細胞に移入して該蛋白質を発現させ、該動物細胞を培養して抗原タンパク質の発現量を増やし、これを該動物細胞と同種の動物に免疫することで、抗原タンパク質を精製することなしに該抗原タンパク質に対する抗体が作製できることをはじめて確認し、更に研究の結果、遂に本発明を完成した。
【０００９】本発明における抗原タンパク質は、ヒト、動物（哺乳類、鳥類、両棲類、爬虫類、魚類、昆虫類その他）、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子のほか、人工的にデザインされた合成遺伝子によってコードされている全てのタンパク質を包含するものである。
【００１０】具体的には血液やリンパ液などの細胞外液の構成成分、サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックスなどや、レセプター、トランスポーター、イオンチャネルなどの膜タンパク質、細胞骨格、代謝酵素、シグナル伝達因子、蛋白質合成関連タンパク質（リポソームなど）、蛋白質分解関連タンパク質（プロテアソームなど）などの細胞質タンパク質、核骨格、転写因子、複製因子などの核タンパク質が例示できる。また、オルガネラタンパク質としては、ミトコンドリア、リソソーム、ペルオキシソーム、ミクロソームなどを構成する各種タンパク質（電子伝達系、分解酵素など）が例示できる。さらに人工的にデザインされた合成遺伝子によってコードされる人工タンパク質も本発明のタンパク質の範ちゅうに含まれる。サイトカインとしては、モルモット ＩＬ−１８その他、膜蛋白質としては、ヒト ＣＤｗ１５０（ＳＬＡＭ）、ＴＲＥＭ−２、マウス ＣＤ４６、Ｒａｅ−１、ニワトリ Ｃｒｅｍｐ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒその他、分泌蛋白質としては、可溶性ヒトＣＤ４６その他、細胞質蛋白質としては、ヒトＳＩＭＰＬＥその他が例示される。
【００１１】本発明においては、上記したような抗原タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ動物細胞とこれを免疫する動物とが同種でアロ抗体の産生が少なければ、抗原タンパク質はその由来、種類、大きさ等が問われることはない。換言すれば、本発明によれば、各種の抗原タンパク質に対する抗体を効率よく自由に製造できるという著効が奏される。
【００１２】目的抗原タンパク質をコードする遺伝子としては、目的とする抗原タンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが例示される。ただし、いずれも開始コドンから終始コドンまでのオープンリーディングフレームを含んでいる必要がある。遺伝子の調製方法としては、該当遺伝子を含む細胞のｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで、又は、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲで抗原タンパク質のｃＤＮＡをクローニングし、核酸配列をＤＮＡシークエンサーで確認すればよい。必要に応じてタグ（Ｈｉｓｔａｇ，Ｆｌａｇｔａｇなど）を付与しておくこともできる。もちろんゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡから目的とする遺伝子ＤＮＡを制限酵素等によって切り出し、これを使用することも可能である。
【００１３】目的抗原タンパク質をコードする遺伝子は発現ベクターに組み込んだ後、動物細胞に導入する。使用するベクターは、環状二本鎖ＤＮＡ、環状一本鎖ＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ、線状ＲＮＡおよびこれらの遺伝子を含むファージ粒子等いかなる態様をとってもよいが、大腸菌などの微生物と哺乳動物細胞いずれでも発現可能なプロモーターその他の配列を有するシャトルベクターを好適に使用することができる。例えば、具体的には大腸菌と哺乳動物細胞とのシャトルベクターであるｐＭＥ１８ｓや、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＣＡＧＧＳなどを用いることができる。
【００１４】目的抗原タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター（動物細胞内で機能するプロモーター含有）を大腸菌のコンピテント細胞など常法にしたがって増やし、常法にしたがって精製する。次に当該ベクターを動物細胞にリポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４，７４１３〜７４１７（１９８７））など常法にしたがって移入する。細胞の形質転換は、顕微鏡下に変化を観察できる場合もあるが、通常、４８時間後に細胞を回収し、−８０℃に凍結保存する等、常法にしたがって行えばよい。
【００１５】動物細胞内で働くプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、ウイルス由来のプロモーターとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターや後期プロモーター（ＳＶ４０）、アデノウイルスの後期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ（ＨＩＶ・ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター、サイトメガロウイルスのプロモーター（ＣＭＶ）などが例示できる。動物細胞由来のプロモーターとしては、チミジンキナーゼのプロモーター、メタロチオネインのプロモーター、β−アクチンのプロモーター、延長因子−１αのプロモーター、リポソーム蛋白質のプロモーター等が例示できる。より具体的にはＳＶ４０（ｐＭＥ１８ｓ）プロモーター、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ｐＥＦＢＯＳ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ｐＣＡＧＧＳ）のエンハンサー＋βアクチンのプロモーターを使用することができる。
【００１６】使用する動物細胞は、免疫する動物と同種の動物由来の細胞を使用する。動物細胞としては、ウサギ腎臓細胞（ＲＫ１３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、サル細胞（ＣＯＳ−７）などが用いられる。
【００１７】目的抗原タンパク質をコードするＤＮＡの上記プロモーターを含む発現ベクターへの組換え、及び動物細胞の形質転換は、公知の遺伝子工学技術を用いて行なうことができる（例えば、Ｉｗａｔａ，Ｓｅｙａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７０，１５１４８〜１５１５２（１９９５））。
【００１８】目的抗原タンパク質で形質転換した動物細胞を細胞培養培地で培養して、目的抗原タンパク質を生産させる。目的抗原タンパク質生産培地は、該動物細胞が生育でき、目的抗原タンパク質の生産を保証するものならばどのような培地を用いてもよく、動物細胞に合わせて最適の培地を選択すればよい。
【００１９】一般に培地には、平衡塩類溶液と低分子の栄養物質を含む培地を使用する。平衡塩類としては、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ3、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4などを用いることができる。また、栄養物質としては、細胞に取り込まれて生合成や代謝の基質となるか、補酵素として利用されるもので、グルコースなどの糖類やアミノ酸、水溶性ビタミンなどを用いることができる。培地のｐＨは、６．６〜７．８の範囲、より好ましくは７．２〜７．４の範囲がよい。
【００２０】培養温度は２０〜４０℃、好ましくは約３７℃での培養がよい。培養時間は、通常１日〜３週間、好ましくは２日〜７日間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行う等、常法にしたがって行えばよい。
【００２１】目的抗原タンパク質又はｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法、又はＴａｇの抗体を用いたウエスタンブロットなどで確認する。目的抗原タンパク質又はｍＲＮＡの発現が確認された後、該動物細胞で動物に免疫を行う。
【００２２】動物への投与に際して、免疫系を刺激して抗原に対する免疫反応を高めるために、アジュバントを使用する方がよい。アジュバントとしては、結核菌からの抽出物を使用したフロイントアジュバントなどの抗体産生細胞誘起性アジュバントやミョウバン、ベントナイト、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムなどの沈降性アジュバントなどが使用できる。
【００２３】動物への免疫は、抗原タンパク質の発現が確認された培養動物細胞を必要に応じてアジュバントと混合して懸濁液を調整し、これを１週間以上の間隔をおいて２回以上注射によって免疫する。
【００２４】免疫する動物としては、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、イヌ、サルなどの哺乳動物類、ニワトリなどの鳥類など、一般に抗体作製に使用される動物いずれを使用しても構わないが、目的抗原タンパク質の精製工程を除くために、免疫動物は抗原タンパク質を発現させる動物細胞と同じ動物種であることが必要である。免疫動物が抗原タンパク質を発現させた動物細胞と同じ動物種を用いれば、目的抗原タンパク質以外は自己細胞であるため目的とする抗原タンパク質に対する抗体のみが作製される。
【００２５】このように、目的タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞内に組み込み、動物細胞内において該ＤＮＡを発現せしめ、この動物細胞をそれと同一種の動物に免疫して、発現された目的抗原タンパク質に対する抗体を動物体内で作製せしめるという技術思想は従来は全く報告されておらず、本発明が最初である。このような本発明に係る方法は、目的抗原タンパク質を精製する必要がなく、目的抗原タンパク質を大量にしかも確実に発現せしめることができ、免疫する動物において拒絶反応もひき起こされないという著効が奏される。
【００２６】これに対して、抗原タンパク質を発現させた動物細胞とは異なる動物種に免疫した場合には、抗原タンパク質を発現させた動物細胞由来のタンパク質などを免疫された動物細胞が異物とみなし、目的とする抗原タンパク質以外にこれらのタンパク質などに対する複数の抗体が作製されてしまうし、目的抗原の作製率も大幅に低下してしまい、更には免疫拒否反応がひき起されて、実験動物を死亡させその結果、抗体の作製自体が不可能となる場合すら生じる。しかしながら本発明によれば、抗原タンパク質の精製工程が全く必要でなく、抗体の作製率も高く、貴重な実験動物を無益に消費することはないといった著効が奏される。唯一、アロ抗原に対する抗体が産生される可能性がある。しかし、アロ抗原への抗体力価は一般に異種蛋白の抗体力価に比べて極めて低いので通常の実験（flow cytometry, western blottingなど）では問題にならない。
【００２７】抗体産生の有無は、動物から血液を採取後血清を分離し、抗原タンパク質との結合反応を調べることによって行なう。例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降、酵素免疫アッセイ、抗体染色など公知の方法を用いることができる。他に表面（膜）抗原の抗体ならフローサイトメリーが有用である。
【００２８】これらの方法で血清中での抗体産生を確認した後、血清をそのままポリクローナル抗体試料として用いることもできるし、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィーなどにより精製した後、用いることもできる。後者の場合、例えば最終免疫後、１０日目程度に全採血を行い、抗血清を分離し、これをプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー法によりＩｇＧ分画を単離すればよい。このようにして精製したポリクローナル抗体は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動等によってその純度を検定すればよい。なお、本発明において抗血清の採取、抗体の精製等は、上記のほか常法にしたがって適宜実施することができる。
【００２９】また、本発明によれば、ポリクローナル抗体のほかモノクローナル抗体を作製することができる。その場合、常法（例えば、Ｇ．Ｋｏｅｌｅｒ，Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）等）に準じて実施することができる。すなわち、免疫能を獲得した動物から摘出した脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等から選ばれる抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ポリエチレングリコール等融合剤の存在下で融合する。次いで、融合細胞（ハイブリドーマ）をＨＡＴ培地（１×１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０-3Ｍチミジン含有）等の培地で選択的に増殖させ、培養上清への上記トランスフェクタントと特異的に結合する抗体の分泌が認められた細胞を限界希釈法等によりクローニングする。
【００３０】このようにして作製されたハイブリドーマは、その培養上清や骨髄腫細胞の由来する動物に移植して得られる腹水よりモノクローナル抗体を生産することができる。モノクローナル抗体も上記したポリクローナル抗体と同様の工程によって精製することができる。
【００３１】本発明方法によって作製された抗体は、抗原タンパク質に対する特異性が高く、イムノアッセイ用試薬といった各種分析用試薬、診断薬のほか、医薬や研究用試薬等各方面において広範に利用することができる。
【００３２】次に実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、この実施例は、本発明者らが今回分離、同定するのに成功した新規ニワトリ膜型補体制御蛋白質（ｃｈｉｃｋｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ：Ｃｒｅｍｐ）をコードする新規遺伝子（Ｃｒｅｍｐ遺伝子）、及びｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅａｒｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅの一つであるマウスＲａｅ−１αをコードする遺伝子（Ｒａｅ−１α遺伝子）に基づくものであるが、本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。なお、Ｃｒｅｍｐのアミノ酸配列を配列番号１（図１、図２、図３、いずれも下段）に示し、それをコードする遺伝子（Ｃｒｅｍｐ遺伝子）の塩基配列を配列番号２（図１、図２、図３、いずれも上段）に示す。これらは、上記したように、いずれも本発明者らがはじめて見出したものであって、新規物質である。
【００３３】
【実施例１】（１）既に登録されているニワトリのＣｒｅｍｐ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０３５５９２：配列番号２、図１〜３上段）のｃＤＮＡの塩基配列を元に設計したプライマーＣｒｅｍｐ−Ｍ４（配列番号３、図４）とＣｒｅｍｐ−ＲＶ（配列番号４、図５）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってニワトリ胸腺から抽出したＲＮＡからＣ末端にＨｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｔａｇの付いたＣｒｅｍｐ遺伝子のｃＤＮＡを得た。次いでＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した本遺伝子断片をｐＭＥ１８ｓ（Ｌｉｕ．Ｙ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９０，８９５７〜６１（１９９３））のＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトに導入することによって、細胞内でＣｒｅｍｐの発現が可能なプラスミドｐＭＥ１８ｓ−Ｃｒｅｍｐ−Ｈｉｓを構築した。
【００３４】（２）構築したｐＭＥ１８ｓ−Ｃｒｅｍｐ−ＨｉｓをＲＫ１３細胞（理化学研究所細胞開発銀行ＲＣＢ０１８３）（１×１０7個)にｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いたリポフェクチン法によりトランスフェクトした。トランスフェクトしたＲＫ１３細胞は、３７℃のＣＯ2インキュベータ（９５％大気／５％ＣＯ2）でＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒａｍ：ウシ胎児血清）で４８時間培養した。
【００３５】（３）４８時間培養後、トランスフェクトしたＲＫ１３細胞は、１０ｍＭ ＥＤＴＡ リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ／ＰＢＳ）を用いて集め、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。このＲＫ１３の懸濁液を、０．６ｍｌのフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）と混ぜ、よく混合した。更にこの混合物を用いてＮＺＷウサギにリンパ節（皮下）近くに注入することで免疫を行った。免疫は、７日置きに４回行った後、更に３日後にブースターとして最終免疫を行った。更に最終免疫の４日後と６日後にウサギの耳動脈から４０ｍｌずつを採血した。採血から抗血清を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分）により採取した。更にこの抗血清をｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いたアフィニティクロマトグラフィーで精製し、抗Ｃｒｅｍｐ抗体を得た。
【００３６】（４）すなわち、得られた抗血清を、下記するように、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー法によりＩｇＧ分画を単離した。まず、プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社製）２ｍｌをカラムに充填し、１．５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）で平衡化した後、血清を同量の１．５Ｍグリシン溶液で希釈し、これをカラムに流しプロテインＡにＩｇＧを結合せしめた。１．５Ｍグリシン溶液でカラムを洗った後、０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ３．０）で溶出させてＩｇＧ分画を得た。
【００３７】（５）このようにして抗血清を精製して、抗Ｃｒｅｍｐ抗体を得た。抗体生成の確認は、Ｃｒｅｍｐタンパク質発現細胞を用いたウエスタンブロット法およびフローサイトメトリー法により行った。
【００３８】（６）すなわちウエスタンブロット法では、免疫に用いた、ｐＭＥ１８ｓ−Ｃｒｅｍｐ−ＨｉｓをトランスフェクトしたＲＫ１３細胞を、１％ＮＰ−４０にて可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動してメンブラン上に転写した。次に転写したメンブランを５００倍希釈抗血清と反応させ、抗血清と反応したタンパク質を１０，０００倍希釈ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体にて可視化した。その結果、抗血清はＲＫ１３細胞中のＣｒｅｍｐ遺伝子産物に強く反応した。これに対し、陰性対照として泳動した、トランスフェクトしないＲＫ１３細胞に対しては、抗血清は反応しなかった。
【００３９】（７）フローサイトメトリー法では、Ｃｒｅｍｐタンパク質発現細胞および非発現細胞を、希釈した抗血清と反応させ、洗浄後、蛍光標識抗ウサギ抗体と反応させ、洗浄後の残存蛍光強度を測定した。その結果、Ｃｒｅｍｐタンパク質発現細胞では高い残存蛍光強度が認められたのに対し、非発現細胞では認められず、抗血清のＣｒｅｍｐタンパク質発現細胞との高い反応性が確認された。
【００４０】
【実施例２】（１）Ｒａｅ−１α遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｄ６４１６０：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９（２），３１９−３２８（１９９６）） （配列番号５）を鋳型として、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを含むプライマーを用いてＰＣＲを行い、生じたＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片（図７）をプラスミドｐＥＦＢＯＳのＸｈｏＩ、ＮｏｔＩサイトに導入することによって、マウスＲａｅ−１αの発現が動物細胞内で可能なプラスミドＲａｅ−１α／ｐＥＦＢＯＳ（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託：寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５０２）（図６）を、構築した。次いで、本プラスミドを家兎由来ＲＫ１３細胞（理化学研究所細胞開発銀行ＲＣＢ０１８３）にｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（ＧＩＢＣＯ社）を用いたリポフェクション法によりトランスフェクトし、３７℃のＣＯ2インキュベーター（９５％大気／５％ＣＯ2）にてＲＰＭＩ１６４０／１０％ウシ胎児血清を用いて２４時間培養した。
【００４１】（２）２４時間後、トランスフェクトしたＲＫ１３細胞を、１０ｍＭ ＥＤＴＡリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ／ＰＢＳ）を用いて集め、ＰＢＳにて洗浄後、ｐｅｌｌｅｔの状態で、−８０℃にて保存した。またＲＴ−ＰＣＲ法によりＲａｅ−１α遺伝子のｍＲＮＡへの転写を確認することによりＲＫ１３細胞でのＲａｅ−１α遺伝子の発現を確認した。
【００４２】（３）保存しておいた本細胞を解凍し、４×１０7個の細胞を０．３５ｍｌの生理食塩水に懸濁し、０．６ｍｌのフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）と混ぜ、よく混合した。更にこの混合物を用いて家兎に注射することで免疫を行った。免疫は、７日置きに４回行った後、さらに３日後にブースターとして最終免疫を行った。採血後、遠心分離により抗血清を採取した。
【００４３】（４）血清中の抗体生成の確認は、ウェスタンブロット法により行った（図８）。すなわち免疫に用いた、Ｒａｅ−１α／ｐＥＦＢＯＳをトランスフェクトしたＲＫ１３細胞を、１％ＮＰ−４０にて可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動してメンブラン上に転写した。次に転写したメンブランを５００倍希釈抗血清と反応させ、抗血清と反応したタンパク質を１０，０００倍希釈ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体にて可視化した。その結果、抗血清はＲＫ１３細胞中のＲａｅ−１α遺伝子産物に強く反応した（図８、Ｉ．Ｂ．２ 矢印）。これに対し、陰性対照として泳動した、トランスフェクトしないＲＫ１３細胞に対しては、抗血清は反応しなかった（図８、Ｉ．Ｂ．１）。トランスフェクトしたＲＫ１３細胞およびトランスフェクトしないＲＫ１３細胞を泳動した全タンパク質は、クマシー・ブリリアント・ブルー染色にて示した（図８、クマシー１および２）。なお、図８はいずれも写真である。
【００４４】
【発明の効果】本発明にしたがって、抗原タンパク質を動物細胞内で発現せしめておき、これを同種の動物に免疫するという全く新しいタイプの方法により、抗原タンパク質の精製工程を要することなく、高い作製率で効率的に抗原タンパク質に対する抗体を作製することが可能となった。しかもその際、免疫動物での拒否反応がないため実験動物が無益に消費されることもないし、夾雑タンパク質に対する各種抗体の副生もないため、抗体の精製も効率的に行うことが可能となり、例えば、抗Ｃｒｅｍｐ抗体及び抗Ｒａｅ−１α抗体の作成に実際に成功した。
【００４５】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ〈110〉 Protein Express Co., Ltd〈120〉 Producing Method of Antibody〈130〉 6516〈141〉 2001-9-28〈160〉 5〈210〉 1〈211〉 451〈212〉 PRT〈213〉 Chiken Thymus〈400〉 1Met Ala Val Gly Val Phe Ala Leu Ala Val Leu Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15Ala Ala Arg Ala Gln Gly Ser Cys Thr Leu Pro Asp Lys Val Gln Asn 20 25 30Ala Glu Leu Thr Glu Asp Ala Ser Thr Met Ser Ser Phe Pro Val Gly 35 40 45Thr Thr Val Ser Tyr Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Met Arg Ile Pro Gly 50 55 60Met Pro Val Ser Arg Thr Cys Gly Glu Asn Leu Met Trp Ser Gln Ile65 70 75 80Glu Thr Phe Cys Thr Ala Arg Ser Cys Thr His Pro Gly Glu Leu Gln 85 90 95Asn Gly Val Val His Val Thr Asp Leu Thr Phe Gly Ser Ala Val Thr 100 105 110Phe Ser Cys Glu Lys Gly Tyr Arg Leu His Gly Asn Arg Gln Ile Ser 115 120 125Cys Val Ile Gln Gly Lys Val Val Asp Trp Asn Gly Pro Leu Pro Leu 130 135 140Cys Asp Arg Val Pro Cys Arg Pro Pro Pro Ser Ile Ala Asn Gly Arg145 150 155 160Tyr Thr Glu Ala Ala Asn Tyr Val Tyr Gln Thr Thr Val Thr Tyr Ser 165 170 175Cys Asp Asp Val Arg Thr 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Pro Glu Val Pro Val385 390 395 400 Cys Lys Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Ile Ile Cys Met Ile Val Ala 405 410 415 Val Leu Val Phe Leu Ala Ala Phe Trp Ile Phe Lys Lys Phe Ile Ser 420 425 430 Gln Glu Gly Lys Ser Asp Ser Thr Pro His Thr Ala Lys Tyr Thr Ser 435 440 445 Cys Lys Ala 450〈210〉 2〈211〉 1353〈212〉 DNA〈213〉 Artificial Sequence〈400〉 2atggcggtgg gggtgtttgc gttggcggtg ctgctggcgg ggctcggcgc ggcacgggcg 60cagggctcct gcacgcttcc agacaaggtc cagaatgcag agctcacgga ggatgccagc 120acaatgagca gctttcctgt tggaaccact gtgagctaca cctgtcgccc tggctatatg 180aggatccctg ggatgcctgt tagtcgaacg tgtggcgaaa acttaatgtg gtcgcaaata 240gagacgttct gtacagcaag aagctgtact catccgggag aactacaaaa tggcgttgtt 300catgtgacag atcttacatt tggttcggca gttacttttt cttgtgaaaa agggtacagg 360ttacatggaa atcgtcagat ttcctgtgta attcaaggta aagttgttga ctggaatgga 420cctcttcctt tatgtgatag agttccttgt aagccacctc caagtatagc caatgggcgc 480tacactgaag cagccaacta tgtttatcaa acaacagtaa cctatagttg tgacgatgtg 540cgcacaggag aaactccctt ctcgctggtt ggttcacctt 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4〈211〉 47〈212〉 DNA〈213〉 Artificial Sequence〈400〉 4gggctcgagt caatgatgat gatgatgatg tgctttacag ctcgtat 47〈210〉 5〈211〉 762〈212〉 DNA〈213〉 Mouse Cell〈400〉 5atggccaagg cagcagtgac caagcgccat cattttatga ttcagaagct gttaattcta 60ctgagctatg gatacaccaa cgggctggat gatgcacact ctcttaggtg caacttgacc 120atcaaggatc ctaccccagc agatcctctc tggtatgaag cgaagtgctt agtggatgaa 180atacttatcc tccatttaag taacataaac aagaccatga cttcaggtga cccaggggag 240acagcaaatg ccactgaagt gggggaatgt ttgacacaac ctctgaaaga tttgtgccag 300aagttgagga acaaggtgtc taacaccaaa gtggacactc acaagaccaa tggttaccca 360catttacaag tcaccatgat ttatctgcaa agccagggcc aaattcctag tgccacctgg 420gaattcaaca tcagtgacag ttacttcttc accttctaca cagagaatat gagctggaga 480tcagctaatg atgaatcagg ggttatcatg aataaatgga aagatgatgg ggaatttgtg 540aaacgattga aattcttgat acccgaatgc agacaggaag ttgatgaatt cttaaagcag 600cccaaggaaa agccaagatc aacctcaagg tcccccagta tcacccagct tacatcaact 660tccccgcttc cacctcccag ccactctact tctaagaaag gatttatctc tgtgggactc 720atcttcatat ctttattatt tgcatttgca tttgcaatgt ga 762 |
| 【出願人】 |
【識別番号】５００５４６９９４
【氏名又は名称】株式会社プロテイン・エクスプレス
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| 【出願日】 |
平成１３年９月２８日（２００１．９．２８） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００７５７７５
【弁理士】
【氏名又は名称】戸田 親男
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| 【公開番号】 |
特開２００２−３２５５９７（Ｐ２００２−３２５５９７Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−３００８９０（Ｐ２００１−３００８９０） |
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