| 【発明の名称】 |
ビタミンＥ中間体の製造方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】ヴェルナー・ボンラート
【氏名】デートレフ・アイゼンクレーツァー
【氏名】ヴァレリ・アンジョルラス
【氏名】ラインハルト・カルゲ
【氏名】トーマス・ネットシェル
【氏名】ミハエル・シュナイダー
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| 【要約】 |
【課題】ビタミンＥの合成中間体として有用なトリメチルヒドロキノン−１−モノアセタアートを安価、高収率で得る製造方法を提供する。
【解決手段】リパ−ゼを用いる選択的酵素的モノけん化によってトリメチルヒドロキノリンジアセタートをトリメチルヒドロキノン−１−モノアセタアートに転換する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 トリメチルヒドロキノンジアセタートをトリメチルヒドロキノン−１−モノアセタートに極めて選択的に転換する方法であって、トリメチルヒドロキノンジアセタートを、リパーゼを用いた酵素的モノけん化に供する工程を含む方法。
【請求項２】 リパーゼが、固体担体材料上に固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】 リパーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas spec.）リパーゼ、特に、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorenses）リパーゼであるか、またはサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanugiosus）リパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】 リパーゼが、サーモミセス・ラヌギノサスリパーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】 酵素的モノけん化が、疎水性溶媒中で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】 tert−ブチルメチルエーテルが、溶媒として使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】 酵素的モノけん化が、連続的に実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】 結果として生じたトリメチルヒドロキノン−１−モノアセタートを、直接かまたは必要に応じて脱アセチルした後のいずれかで、イソフィトールまたはその等価物と反応させることによって、（全−rac）−α−トコフェロールまたはその酢酸塩に転換する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】 反応が、加圧下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】 （全−rac）−α−トコフェロールまたはその酢酸塩を製造する方法であって、リパーゼを用いて、トリメチルヒドロキノンジアセタートをトリメチルヒドロキノン−１−モノアセタートに転換する工程と、生成したトリメチルヒドロキノン−１−モノアセタートを、イソフィトールまたはその等価物と縮合させ場合により、続いて、脱アセチル化する工程とを含む方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】ビタミンＥの主たる市販形は、たとえば、無水酢酸を用いた、（全−rac）−α−トコフェロールのアセチル化によって合成される、ビタミンＥの酢酸塩誘導体である。
【０００２】（全−rac）−α−トコフェロールの工業的合成は、トリメチルヒドロキノン（ＴＭＨＱ）とイソフィトール、フィトールまたはその誘導体、たとえば、ハロゲン化フィチルとの縮合に基づく。ＴＭＨＱは、通常、高価な２，３，６−トリメチルフェノールから得るが、ＴＭＨＱとイソフィトール、フィトールまたはその誘導体、たとえば、ハロゲン化フィチルとの縮合には、酸性触媒を使用しなければならない。
【０００３】あるいは、（全−rac）−α−酢酸トコフェロールは、トリメチルヒドロキノン−１−モノアセタート（ＴＭＨＱ−１−ＭＡ）とイソフィトールまたはその等価物とを縮合させることによって合成することができる。この代替合成法で使用されるＴＭＨＱ−１−ＭＡは、はるかに安価なα−イソホロンから、ケトイソホロンおよびトリメチルヒドロキノンジアセタート（ＴＭＨＱ−ＤＡ）を経て、得ることができるが、後者は、文献から公知の方法（たとえば、水性アルカリ性塩基で処理することによって）では実行することが困難な、完全に位置選択的なモノ−脱アセチル化を経なければならない。
【０００４】ＴＭＨＱ−ＤＡをリパーゼを用いる酵素的モノけん化に供することによって、ＴＭＨＱ−ＤＡを完全に位置選択的にＴＭＨＱ−１−ＭＡに転換することができることが見出された。
【０００５】本発明の好ましい実施形態では、リパーゼを固体担体材料上に固定する。上記担体材料は疎水性担体、たとえば、Membrana GmbH, Obernburg（ドイツ）により供給される、ＡＣＣＵＲＥ ＭＰ１００１等のポリプロピレン担体であってもよい。しかし、異なる性質の担体、すなわち、酵素の固定化にしばしば使用されるアルカリ性触媒担体ＣＥＬＩＴＥ〔化学組成：ＳｉＯ2 ８７％、ＣａＯ ０．９％、Ａｌ2Ｏ3 ６．１％、Ｆｅ2Ｏ3 １．６％、Ｎａ2Ｏ＋Ｋ2Ｏ １．６％、pH（１０％懸濁液、２５℃）＝８．５〕では、固定化された酵素の性能を満足に示さなかった。
【０００６】本発明の目的に適したリパーゼとしては、酵素クラスＥＣ３．１．１．３に属するものなどがある。
【０００７】市販されている様々なリパーゼの中でも、下記：サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）リパーゼ（ＴＬＬ）、ミューコル・ミハイ（Mucor mihei）リパーゼ（ＭＭＬ）、アルカリゲネス属（Alcaligenes spec.）リパーゼ（ＡＳＬ）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）リパーゼ（ＣＲＬ）、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）（分画Ｂ）リパーゼ、およびシュードモナス属（Pseudomonas spec.）リパーゼ（ＰＳＬ）、たとえば、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）リパーゼ（ＰＦＬ）は、本発明の目的に有効であることがわかっている。好ましいリパーゼは、ＰＳＬ、ＰＦＬおよびＴＬＬであり、ＴＬＬが、特に好ましい。
【０００８】本発明の酵素的モノけん化は、疎水性溶媒、たとえば、１−メチル−２−ピロリドン中で、特に、tert−ブチルメチルエーテル、ブチルエーテル、メチル２−メチル−２−ブチルエーテル等々のエーテル溶剤中で、都合よく行われ、tert−ブチルメチルエーテルが特に好ましい。
【０００９】好都合なことに、約０．０１〜約９９．５容量％、好ましくは約０．０３〜約２０容量％、最も好ましくは約０．０９〜約５容量％の水または緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液を、エーテル溶剤に加えてもよい。１％までの濃度で、エタノールが存在してもよい。
【００１０】Tetrahedron ５６（２０００）３１７−３２１には、とりわけ、水の存在下で、tert−ブチルメチルエーテル中の遊離酵素ＰＳＬを用いて、２−メチル−１，４−ジアセトキシナフタレンを、対応する１−アセトキシ−４−ヒドロキシ化合物に選択的モノけん化することについて記載されている。しかし、この実験を、最高１８５時間にわたって繰返したとき、矛盾する結果を得た。さらに、同じ反応条件で、最高約３００時間まで、ＴＭＨＱ−ＤＡを遊離酵素ＰＳＬで処理したとき、初期反応速度は、約３分の１に過ぎなかった。固定化ＰＳＬを用いた、＜１００時間にわたるＴＭＨＱ−ＤＡのモノけん化で、ほぼ定量的な転換が行われたのに比し、固定化ＰＦＬおよび固定化ＴＬＬでは、同様の結果が得られた。
【００１１】本発明のモノけん化の反応速度は、通常、反応温度の上昇と共に速くなる。もちろん、最高温度は、溶媒の沸点（tert−ブチルメチルエーテルの場合、５５℃）によって限定されるが、加圧下で酵素的モノけん化を実施するときには、さらに高温で行うことができる。一部のリパーゼ、特にＴＬＬに関して、温度を約６０〜８０℃に上げることが可能である。
【００１２】このように、本発明の酵素的モノけん化は、約４〜約８０℃の温度範囲で、好ましくは約２０〜約７５℃の温度範囲で、都合よく実施することができる。
【００１３】酵素（遊離酵素も固定化酵素も）と基質（ＴＭＨＱ−ＤＡ）との比率は、かなり広い範囲で様々であってもよく、約０．００１g/g〜約１０g/gが都合よく、約０．０１〜０．２g/gが好ましい。
【００１４】基質（ＴＭＨＱ−ＤＡ）と溶媒との比率も、同様に、かなり広い範囲で様々であってもよく、約０．００１g/g〜約１００g/gが都合よく、約０．０１〜０．８g/gが好ましい。
【００１５】酵素を適当な担体上に固定するとき、たとえば、バッチ式の代わりに、固定床反応器または連続攪拌タンクで、本発明のモノけん化を、有利に連続的に実施することができる。
【００１６】既述の通り、本発明の酵素的モノけん化によって得られるＴＭＨＱ−１−ＭＡを、たとえば、イソフィトールとの反応によって、（全−rac）−α−トコフェリルアセタートに転換することができる。（全−rac）−α−トコフェロールが、粗生成物中にきっと存在する場合、たとえば、無水酢酸を用いてアセチル化することにより、このような（全−rac）−α−トコフェロールを、必要に応じて、その酢酸塩に転換することができる。
【００１７】以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明するものであって、決して、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００１８】実施例１：遊離リパーゼを使用した、ガラス容器内でのバッチ実験tert−ブチルメチルエーテル５ml、水５０μl、遊離酵素〔Fluka Chemie AG(Buchs,Switzerland）から入手したリパーゼ〕１．６７mg、およびＴＭＨＱ−ＤＡ〔粗製、すなわち、ケトイソホロンの転位−芳香族化によって生じた物質で、ＴＭＨＱ−ＤＡ約９０％およびトリメチルカテコールジアセタート（ＴＭＣ−ＤＡ）約９％からなる〕を、容器に加えた。容器のヘッドスペースを窒素でフラッシングした。この容器を５０℃のインキュベーターに入れ、７００rpmで攪拌して、確実に十分混合した。サンプルを採取するために容器を開け、５００μlを採取し、ヘッドスペースを窒素でフラッシングし、容器を再び閉めた。次いで、このサンプルを、０．５〜１．０重量％の基質濃度または生成物濃度に希釈し、ＧＣで分析した。
【００１９】
【表１】
【００２０】実施例２：固定化酵素を使用したバッチ実験（ａ）Membrana GmbH ObernburgによりＡＣＣＵＲＥＬ ＭＰ１０００１の名称で供給される担体は、４００〜１０００μmのサイズを有する。固定化する前に、１０００μmのサイズを有する担体粒子を篩分けによって選択した。
【００２１】固定化の場合、エタノール１．７ml中に含まれるＡＣＣＵＲＥＬ ＭＰ１０００１ ５００mg、およびリン酸カリウム緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4、pH７．２０mM）２．５mlに溶解したリパーゼ粉末１００mgを混合し、室温にて、シェーカーで一晩振盪した。固定化リパーゼを濾過で回収し、同緩衝液で３回洗浄し、室温にて数時間乾燥させた。固定化酵素を、使用するまで４℃にて保存した。
【００２２】一部変更したＬｏｗｒｙ法を使用して固定されたタンパク質の量を測定した。
【００２３】（ｂ）tert−ブチルメチルエーテル１０ml、水１００μl、固定化酵素（酵素１３％／ＡＣＣＵＲＥＬ担体８７％）〔リパーゼは、「キラザイム（Chirazyme）」と呼ばれる、Roche Diagnostics GmbH（Mannheim、ドイツ）から供給されるスクリーニングキットの一部であった〕２０mgおよびＴＭＨＱ−ＤＡ１６０mgを、容器に加えた。容器のヘッドスペースを窒素でフラッシングした。この容器を３３℃のインキュベーターに入れ、７００rpmで攪拌して、確実に十分混合した。サンプルを採取するために容器を開け、５００μlを採取し、ヘッドスペースを窒素でフラッシングし、容器を再び閉めた。次いで、このサンプルを、０．５〜１．０重量％の基質濃度または生成物濃度に希釈し、ＧＣで分析した。
【００２４】
【表２】
【００２５】粗ＴＭＨＱ−ＤＡ（実施例１参照）を使用したとき、純ＴＭＨＱ−ＤＡを使用したときと比較した相対的転換率は、９５％〜１００％の範囲であった。
【００２６】
【表３】
【００２７】実施例３：固定床反応器内での連続酵素的けん化固定床反応器〔ＡＣＣＵＲＥ ＭＰ１００１上に固定したＴＬＬ ９００mg、床の高さ７３mm、床の直径１２．０mm、床密度０．１１g/ml、床体積８．１ml、担体直径０．７mm〕内で、４０℃にて、基質流量：水−飽和tert−ブチルメチルエーテル中、０．０１g/gの濃度のＴＭＨＱ−ＤＡ；tert−ブチルメチルエーテルの質量流量＝０．０８０mg／分；ＴＭＨＱ−ＤＡの質量流量＝０．８５ｇ／ｄで、ＴＭＨＱ−ＤＡのＴＭＨＱ−１−ＭＡへの連続けん化を実施した。固定化ＴＬＬは、少なくとも２２４時間、安定且つ活性であった。ＴＭＨＱ−ＤＡのＴＭＨＱ−１−ＭＡへのけん化におけるＴＬＬの選択性は、１００％転換にてほぼ１００％であり、滞留時間が長くても、あるいは低濃度のＴＭＨＱ−ＤＡ溶液をフィードしたときでも、ＴＭＨＱ−１−ＭＡのＴＭＨＱへのけん化は事実上起こらなかった。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５０１３０４３９７
【氏名又は名称】ロシュ ビタミン アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｒｏｃｈｅ Ｖｉｔａｍｉｎｓ ＡＧ
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| 【出願日】 |
平成１４年２月１８日（２００２．２．１８） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００７８６６２
【弁理士】
【氏名又は名称】津国 肇 （外１名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２９１４９５（Ｐ２００２−２９１４９５Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年１０月８日（２００２．１０．８） |
| 【出願番号】 |
特願２００２−３９８５２（Ｐ２００２−３９８５２） |
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