| 【発明の名称】 |
大豆のナイトレートトランスポーター１遺伝子ファミリーに属する遺伝子 |
| 【発明者】 |
【氏名】青島 均
【氏名】山田 守
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| 【要約】 |
【課題】植物には、窒素源への暴露によって誘導される、ＮＲＴ１およびＮＲＴ２という２つのファミリーの存在が知られているが、大豆においては、ＮＲＴ２のｃＤＮＡがクローニングされているに過ぎない。本発明は、ＮＲＴ１ファミリーに属する、大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を提供することを目的とする。
【解決手段】上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、大豆のｃＤＮＡクローニングと遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリーに属する大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を単離し、ヌクレオチド配列を同定するに至った。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 大豆の遺伝子であって、窒素源への暴露によって誘導されるナイトレートトランスポーター１遺伝子ファミリーに属する遺伝子。
【請求項２】 ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３のいずれかで示される請求項１に記載の大豆の遺伝子。
【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列表の配列番号４または配列番号５で示される請求項１に記載の大豆の遺伝子断片。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大豆の遺伝子であって、窒素源への暴露によって誘導されるナイトレートトランスポーター１遺伝子に属する遺伝子および遺伝子断片に係わるものである。
【０００２】
【従来の技術】植物には、窒素源への暴露によって誘導される、ナイトレート（ＮＯ3-）の取り込みに関与する輸送体ナイトレートトランスポーター１（Nitrate Transporter 1）とナイトレートトランスポーター２（Nitrate Transporter 2）の２つのファミリーの存在が知られている（以下、それぞれＮＲＴ１、ＮＲＴ２と略記する）。シロイヌナズナやトマトなどの植物では、両ファミリーのｃＤＮＡが、既にクローニングされている。しかし大豆では、ＮＲＴ２のｃＤＮＡが、クローニングされているに過ぎない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＮＲＴ１ファミリーに属する、大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を提供することが目的である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、大豆のｃＤＮＡクローニングと遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリーに属する大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を単離し、ヌクレオチド配列を同定するに至った。
【０００５】窒素源は、多くの高等植物にとって必須の栄養素であり、ナイトレート（ＮＯ3-）は、それらの内でもメインの窒素源である。ナイトレートの同化は、根の細胞において、土壌中からナイトレートを取り込むことにより開始される。それに引き続いて、細胞中でナイトライト（ＮＯ2-）を経由してアンモニウム（ＮＨ4+）へと還元される。根の表皮細胞および皮質細胞の原形質膜を横断しての取り込みは、電気化学的なナイトレートの勾配に対するエレクトロジェニック プロトン−ナイトレート（２Ｈ+／ＮＯ3-）シンポートによって行われる。
【０００６】ナイトレートトランスポーター（ＮＲＴ）をコードする遺伝子の同定は、ナイトレート同化作用を欠失している突然変異体に関する研究から始まった。そのような真核生物の突然変異体のほとんどはナイトレートの還元能が障害されていたが、残りの突然変異体はナイトレート取り込み能に欠陥を有していた。このナイトレート取り込み能に欠陥を有する突然変異体のキャラクタリゼーション、単離およびホモロジー解析の結果、真核生物における２種類の遺伝子ファミリーの存在が明らかにされた（Crawford et al.，Trends Plant Sci. 1998; 3:389-395）。これら２つの遺伝子ファミリーは、それぞれＮＲＴ１、ＮＲＴ２と命名されたが、ファミリー間のヌクレオチド配列の類似性はないという、大きな特徴を有していた。ＮＲＴ１とＮＲＴ２の２つのファミリーは高等植物間で保存されているが、ＮＲＴ２ファミリーは菌類や藻類でも保存されている。
【０００７】Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）においては、高親和性のナイトレートトランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされ、ＮＲＴ２ファミリーに属する遺伝子としてＧｍＮＲＴ２と命名されており、また、大豆の根におけるＧｍＮＲＴ２の発現が、供給される窒素源の種類によって異なるレギュレーションを受けること、ＧｍＮＲＴ２遺伝子の発現増加に伴って、根における正味のナイトレート取り込み量が増加することが報告されている（Amarasinghe et al., Planta 1998; 206: 44-52）。しかしながら、大豆のＮＲＴ１ファミリーのナイトレートトランスポーター遺伝子のクローニングに関しては、未だ報告はない。そこで本発明者らは、大豆のｃＤＮＡクローニングと遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリーに属する大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を単離し、ヌクレオチド配列を同定するに至った。
【０００８】
【発明の実施の形態】発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明する。
【０００９】本発明の新規な遺伝子および遺伝子断片のｃＤＮＡクローニングは、市販の大豆ｃＤＮＡライブラリー用いて行った。また、ＤＮＡ操作法は、定法に従った（Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn.，1989）。得られたｃＤＮＡクローンは、ヌクレオチド配列分析を行って遺伝子配列を明らかにした後、既知の遺伝子配列とのホモロジー解析にかけた。その結果、アミノ酸配列レベルでの比較において、ＮＲＴ２ファミリーに属する遺伝子とのホモロジーはなく、ＮＲＴ１ファミリーに属する遺伝子とのホモロジーは高いことから、大豆のＮＲＴ１ファミリーに属する遺伝子であることを確認できた。また、既知の遺伝子とのハイドロパシー解析の結果からも、ナイトレートトランスポーター遺伝子であることが推定できた。
【００１０】既知のナイトレートトランスポーター遺伝子では、窒素源の種類によって、あるいは窒素源に対する暴露時間の違いによって、複雑な遺伝子発現パターンを示すことが知られている。本発明の新規ＮＲＴ１遺伝子の場合も、複雑な遺伝子発現パターンを示すという点では同様であった。
【００１１】本発明のＮＲＴ１遺伝子が、既知のＮＲＴ１遺伝子と異なる点は、発現している組織の違いにある。既知のＮＲＴ１遺伝子、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica napus）、トマト（Lycopersicon esculentum）の場合は、窒素源によって遺伝子発現が誘導されるのは、主として根に限定されている。本発明の大豆のＮＲＴ１遺伝子では、窒素源による誘導条件によっては、根と葉の両方または葉のみでの発現が確認できた点で、既知のＮＲＴ１遺伝子とは明らかに異なっており、新規なＮＲＴ１遺伝子であると言える。
【００１２】本発明の新規な遺伝子は、遺伝子組換えによる植物の品種改良に利用することが可能である。例えば、少量の窒素肥料で、あるいは窒素分の少ないやせた土壌で生育可能な新規組換え植物創製への利用が考えられる。窒素肥料が、合成肥料として大量に使用されるようになってから、食料増産には大きく貢献してきたが、一方では、窒素肥料に由来する硝酸塩が農地からしみ出て、湖沼や湾を富栄養化させていることによる環境汚染、農地に残留している窒素化合物による土壌の酸性化などのマイナス面も、近年は目立っている。少量の窒素肥料で生育可能な遺伝子組換え植物は、このような害を低減させるために役立つ。
【００１３】本発明の大豆ＮＲＴ１遺伝子を、植物品種改良のための遺伝子操作に用いる場合は、植物の組織内に、遺伝子を導入する必要がある。遺伝子導入には、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、マイクロプロジェクタイル法などのベクターを用いない既知の方法が利用できる。また、ベクターを用いる形質転換法でも良い。
【００１４】また、本発明の大豆ＮＲＴ１遺伝子断片は、完全長のｃＤＮＡクローンを得るためのプローブとして利用することができる。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明の具体的な実施態様を実施例として示すが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１６】
【実施例１】大豆のｃＤＮＡライブラリーは、ストラタジーン（Stratagene）社製を用いた。１２日目の大豆（Glycine max cv. Williams 83）の、上胚軸（epicotyl）由来のｍＲＮＡを用いて作製されたｃＤＮＡライブラリーである。
【００１７】宿主菌は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた。ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）用として、２つのプライマーＡＡＴ−ＮおよびＡＡＴ−Ｃ（表１）を用いた時に、ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤＮＡは増幅され、大豆のｃＤＮＡライブラリーからクローニングできた。
【００１８】完全長のｃＤＮＡをクローニングするためのＰＣＲは、大豆ｃＤＮＡライブラリー０．１μｇをテンプレートとし、２．５ユニットのＴａｑ DNAポリメレ−ス、１００ｐｍｏｌのプライマーを用いた。ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤＮＡの５’−領域は、プライマー５’ＶＥＣと３’ＶＥＣのセット（表１）を用い、３’−領域はプライマー５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１のセット（表１）を用いて、それぞれのｃＤＮＡを増幅させた。プライマー５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１の５’端には、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIの切断部位を有している。増幅されたＰＣＲフラグメントを、制限酵素ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIIIで切断後、ベクターｐＵＣ１１８のマルティプルクローニングサイトに挿入した。次に、それぞれのＰＣＲフラグメントを、ＨｉｎｄIII切断部位を有するオーバーラッピング領域で再結合させた後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII切断部位に挿入した。最終的な組換え体は、ヌクレオチド配列分析により確認した。
【００１９】
【表１】
【００２０】ＧｍＮＲＴ１−１と相同性を有するｃＤＮＡを探索するため、前述の大豆ｃＤＮＡライブラリーの約１×１０5ファージクローンをスクリーニングした。スクリーニング用のプローブは、ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤＮＡの８１６番目から１，２６７番目のヌクレオチドに相当する４５２ｂｐのＤＮＡ断片を用い、ＥＣＬキット（Amersham-Pharmacia Biotech 製）で検出した。その結果、ＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１−２の２つの完全長ｃＤＮＡを検出できた。それぞれのｃＤＮＡ塩基配列を、配列表の配列番号１および配列番号２に示した。
【００２１】ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤＮＡは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の同じフレーム内に、ストップコドンがヌクレオチド１７−１９番目のサイトに存在して、そのフレーム内に最初のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が存在することを示しており、また３’端の非翻訳領域（3'-UTR）にポリ（A）テイルが存在することから、完全長のｃＤＮＡであることが示された。１，７９４ｂｐから成るＯＲＦには、５９７アミノ酸のペプチドがコードされており、その分子量は６５，８２０Ｄａと計算された。
【００２２】ＧｍＮＲＴ１−２ｃＤＮＡも、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の同じフレーム内の、開始コドンから１０５ヌクレオチド上流のサイトにストップコドンが存在しており、そのフレーム内に最初のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が存在することを示しており、また３’端の非翻訳領域（3'-UTR）にポリ（A）テイルが存在することから、完全長のｃＤＮＡであることが示された。１，８１８ｂｐから成るＯＲＦには、６０５アミノ酸のペプチドがコードされており、その分子量は６６，７２０Ｄａと計算された。
【００２３】
【実施例２】大豆のＮＲＴ１ファミリーに属する遺伝子が、ＧｍＮＲＴ１−１やＧｍＮＲＴ１−２以外にも存在するのではないかと考え、さらなるｃＤＮＡクローニングを試みた。実験方法は、実施例１と実質的に同等である。その結果、新たに３種類のｃＤＮＡを検出できた。
【００２４】完全長のＧｍＮＲＴ１−３（配列表の配列番号３）は、ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法により得られたものであり、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびプライマー 5'-TTGGATTCACAACGTTGGACACGG-3' を用いて行った。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の同じフレーム内に、ストップコドンがヌクレオチド１３８−１４０番目のサイトに存在して、そのクローン内に最初のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が存在することを示しており、また３’端の非翻訳領域（3'-UTR）にポリ（A）テイルが存在することから、ＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１−２と同じく、完全長のｃＤＮＡであることが確認できた。１，７２８ｂｐから成るＯＲＦには、５７５アミノ酸のペプチドがコードされており、その分子量は６４，１２０Ｄａと計算された。
【００２５】一方、ＧｍＮＲＴ１−４（配列表の配列番号４）とＧｍＮＲＴ１−５（配列表の配列番号５）は完全長のｃＤＮＡではなく、遺伝子断片であった。ＧｍＮＲＴ１−４は、５’端の非翻訳領域（5'-UTR）、３’端の非翻訳領域（3'-UTR）およびポリ（A）テイルを欠失していた。ＧｍＮＲＴ１−５は、５’端の非翻訳領域（5'-UTR）を欠失していたが、３’端の非翻訳領域（3'-UTR）とポリ（A）テイルは有していた。コーディング領域に関しては、ＧｍＮＲＴ１−４はN末端側の約３００アミノ酸とＣ末端側の約５０アミノ酸を欠失していた。また、ＧｍＮＲＴ１−５のコーディング領域は、N末端側の約２０アミノ酸が欠失していた。
【００２６】
【実施例３】得られた新規なｃＤＮＡ、ＧｍＮＲＴ１−１〜ＧｍＮＲＴ１−５が、ＮＲＴ１遺伝子ファミリーに属することを証明するため、既に知られている他の植物のＮＲＴ１タンパク質とのホモロジー解析を行った。ＧｍＮＲＴ１−２の配列を基準として、それぞれのコーディング領域のアミノ酸配列を対象に、ソフトウエアＢＬＡＳＴを用いて解析した（図１）。ホモロジーは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）との比較ではAtNRT1とは３１％、AtNRT3 とは３１％であり（図１）、またトマト（Lycopersicon esculentum）の場合はLeNRT1-1とは３１％、LeNRT1-2とは３２％であり（表２）、いずれも高い相同性を示した。また、大豆のＮＲＴ１ファミリー間のホモロジーは、９７〜２９％という高い値であった（表２）。
【００２７】
【表２】
【００２８】また、ハイドロパシー解析の結果、シロイヌナズナのＮＲＴ１ファミリーに属するAtNRT1タンパク質と同様に、１２個の膜貫通セグメントを有するとともに、中央部に疎水性が低い領域が存在するという２つの特徴を有していた。ハイドロパシー解析の結果の一例を、図２に示してある。
【００２９】一方、同じくＧｍＮＲＴ１−２を基準とした、大豆および他の植物のＮＲＴ２ファミリーとのホモロジーは４〜３％と低く（表２）、実質的にはホモロジーがないと言える。従って、ＮＲＴ１ファミリーとＮＲＴ２ファミリーとのアミノ酸配列には、明らかな違いが存在することを証明できた。
【００３０】以上の結果を総合すると、アミノ酸配列レベルでの比較により、本発明の新規遺伝子および遺伝子断片は、大豆のＮＲＴ１ファミリーに属することが示された。
【００３１】
【実施例４】本発明の大豆ＮＲＴ１ファミリーに属する遺伝子の発現パターンを確認するため、以下の試験を行った。
【００３２】フォトチャンバー内において、大豆（Glycine max cv. Williams）を２２℃、１６時間／８時間の明暗サイクル条件下に栽培した。窒素源によるＮＲＴ１遺伝子のインダクションの結果は、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction）により確認した。
【００３３】窒素源に対する短時間暴露の場合は、大豆の種子は、滅菌した湿潤バーミキュライト（vermiculite）のトレイ中で発芽させた。６日後の実生を、栄養液を含んだ水栽培用ポットに移し、３〜６時間処理した。実質的に窒素源を含まない栄養液は、２ｍＭ ＣａＳＯ4，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，０．９４ｍＭ ＣａＣｌ2，０．５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4，０．１６ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，０．０８２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，０．０２４ｍＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ，１．０８ｍＭ ＭＥＳ バッファー，０．８ｍＭ ＫＯＨ，５μＭ Ｈ3ＢＯ3，２μＭ ＭｎＳＯ4，０．８μＭ ＺｎＳＯ4，０．０３３μＭ ＣｏＣｌ，０．６５ｎＭ （ＮＨ4）6ＭＯ7Ｏ24 の組成である。窒素源補充栄養液には、１０ｍＭ ＫＮＯ3 または １０ｍＭＮＨ4Ｃｌまたは１０ｍＭ ＫＮＯ3 と １０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌの両方を、実質的に窒素源を含まない栄養液に添加した。培養液のｐＨは、６．０に調整した。
【００３４】窒素源に対する長期間暴露の場合は、大豆の種子を滅菌した湿潤バーミキュライト（vermiculite）のトレイ中で発芽させ、３種類の栄養液の１種類を添加した後、７〜１４日間成長させた。ナイトレートおよびアンモニウム（NH4+）補充液の組成は、２５ｍＭ ＮＨ4ＮＯ3，２ｍＭ ＣａＣｌ2，３ｍＭ ＫＣｌ，１．６ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．３７５ｍＭ ＭｇＳＯ4，０．３７５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，０．０５ｍＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ，０．０１ｍＭ ホウ酸，０．０４５ｍＭ ＭｎＳＯ4，０．７μＭ ＺｎＳＯ4，０．２μＭ ＣｕＳＯ4，０．２μＭＫＩである。アンモニウム補充液の組成は、ＮＨ4ＮＯ3の代わりに、２５ｍＭコハク酸アンモニウムを含有している他には、ナイトレートおよびアンモニウム補充液と同じである。培養液のｐＨは、６．０に調整した。
【００３５】ＲＴ−ＰＣＲは、宝酒造のｍＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いた。トータルＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を用いて単離した。窒素源への短時間暴露の場合は、トータルＲＮＡを大豆の根から単離した。また、窒素源への長期間暴露の場合は、大豆の根と葉からトータルＲＮＡを単離した。
【００３６】ＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１−２の両方の発現を解析するためには、５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１のプライマーセット（表１）を用いた。逆転写反応は、０．１μｇのトータルＲＮＡと３’ＳＢＯＮ１プライマーを用いて、５０℃、１５分間行った。続くＰＣＲ反応は、５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１のプライマーセットを用いて、２５〜４０サイクルの反応を行った（後述の図３および４には、２５、３０、３５、４０の各サイクルのサンプルでの結果を示してあり、ＲＴ−ＰＣＲ産物の経時変化を見ることができる）。１サイクル毎の反応は、８５℃、１分間の熱変性（denature）、４５℃、１分間のアニ−リング（anealing）、７２℃、１分間の伸長（extension）反応を行った。反応生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウム ブロマイドで染色した。ゲル上のバンドの濃度は、デンシトメーター（Bio-Rad製 Molecular Imager）で定量した。
【００３７】ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２の発現を区別するためには、５’Ｎｄｉｆと３’Ｎｄｉｆ（表１）という別のプライマーセットを用いた。これらはそれぞれ、ＧｍＮＲＴ１−２のヌクレオチド配列の１２７〜１４３番目と３１３〜３２９番目に対応している。この反応の生成物は、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。
【００３８】ＲＴ−ＰＣＲの生成物が、ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２のどちらに由来するかを決定するためには、同じトータルＲＮＡ、同じプライマーセット５’Ｎｄｉｆと３’Ｎｄｉｆを用いて、同じ宝酒造製のＲＮＡ ＰＣＲキット（ＡＭＶ）によるＲＴ−ＰＣＲを行った。この反応の生成物は、Ｔ−ベクター（Promega製）にクローニングした後、ヌクレオチド配列分析を行った。
【００３９】ＧｍＮＲＴ２の転写物を検出する場合には、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーセットとして、５’−ＧＮＴと３’−ＧＮＴ（表１）を用いた。ｍＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いた本発明の実験条件下においては、逆転写酵素を除いた条件下では、いかなるバンドも検出されなかった。従って、本実施例において増幅されたバンドは、ＲＮＡ由来であることが示された。図３に結果を示したが、目的のバンドの位置は、楔形の矢印マークで示してある。
【００４０】窒素源に短時間（３時間）暴露した場合は、ＧｍＮＲＴ１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−２の増幅バンドが検出されたのは、窒素源なし（Nitrogen-free）、ナイトレート存在下での成長（Nitrate）、ナイトレートとアンモニウム共存下での成長（Nitrate/Ammonium）の３つのケースであり、アンモニウム存在下で成長させた場合（Ammonium）には、増幅バンドは検出されなかった（図３ Ａ））。増幅バンドの相対的な強度は、ナイトレート存在下、窒素源なし、ナイトレートとアンモニウム共存下の順に大きかった。
【００４１】コントロールとして、ＮＲＴ２ファミリーのＧｍＮＲＴ２の発現を、同じトータルＲＮＡを用いて調べてみた。その結果、ＧｍＮＲＴ２の増幅バンドは、ナイトレート存在下で最も高く、窒素源なしの条件下が次に高かったが、アンモニウム存在下では増幅バンドは検出されなかった（図３ Ｂ））。このＧｍＮＲＴ２の結果は、文献値と一致していた（Amarasinghe et al., Planta 1998; 206: 44-52）。窒素源に長時間（６時間）暴露した時のトータルＲＮＡを用いた場合は、ＧｍＮＲＴ１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−２およびＧｍＮＲＴ２に対して、ほとんど同様の結果が得られた。
【００４２】ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２の発現を区別するために、プライマーセット５’Ｎｄｉｆと３’Ｎｄｉｆ（表１）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。この場合には、ＧｍＮＲＴ１−１からは１７９ｂｐのバンドが、ＧｍＮＲＴ１−２からは２０３ｂｐのバンドが検出される。ナイトレート存在下で成長させた根からのトータルＲＮＡでは、プライマー セット５’Ｎｄｉｆと３’Ｎｄｉｆを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、２０３ｂｐのバンドだけが検出された（図３ Ｃ））。さらに、ヌクレオチド配列分析により、確かにＧｍＮＲＴ１−２の転写物であることを確認できた。従って、ナイトレート存在下で成長させた大豆の根では、ＧｍＮＲＴ１−２だけが発現されていることが判明した。同様にして、窒素源なしとナイトレートとアンモニウム共存下のケースも、ＧｍＮＲＴ１−２の増幅バンドだけが観察された。
【００４３】窒素源への１４日間の長期間暴露においては、アンモニウム存在下で成長させた根だけに、ＧｍＮＲＴ１−２のバンドだけが観察され、ヌクレオチド配列分析からもＧｍＮＲＴ１−２由来であることが確認できたが、ナイトレートとアンモニウム共存下では、バンドは観察されなかった（図３ Ｄ）のレーン１および２）。一方、葉からは、ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２の２つのバンドが観察され、ヌクレオチド配列分析からも確認できた（図３ Ｄ）のレーン４および５）。以上の結果から、ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２は、組織における発現パターンが異なっており、ＧｍＮＲＴ１−１は葉で発現されており、ＧｍＮＲＴ１−２は根と葉の両方で発現されていることが明らかになった。
【００４４】図３のＥ）のデータは、試験に用いたトータルＲＮＡの品質チェックと、結果の定量性の保証を目的として行ったものであるが、ｒＲＮＡ（ribosomal RNA）の２８Ｓおよび１８Ｓバンドの状態を指標として判定した結果、問題はないことが示された。
【００４５】
【実施例５】ＧｍＮＲＴ１−３およびＧｍＮＲＴ１−４についても、遺伝子の発現パターンを確認するための試験を行った。特にことわらない限り、試験条件は実施例４と同等である。
【００４６】３時間処理後の根から得られたトータルＲＮＡの場合は、すべての条件において、ＧｍＮＲＴ１−３の増幅バンドが検出された（図４ Ａ））。この結果は、ＧｍＮＲＴ１−３遺伝子は、構成的（constitutive）に発現されていることを示している。ＧｍＮＲＴ２に関しては、実施例４と一致した結果が得られた（図４Ｂ）および図３ Ｂ））。また、６時間処理後の根から得られたトータルＲＮＡの場合も、ＧｍＮＲＴ１−３とＧｍＮＲＴ２のどちらについても、ほぼ同等の結果が得られた。図４のＣ）のデータは、試験に用いたトータルＲＮＡの品質チェックと、結果の定量性の保証を目的として行ったものであるが、ｒＲＮＡの２８Ｓおよび１８Ｓバンドの状態を指標として判定した結果、問題はないことが示された。
【００４７】窒素源への長期間暴露の場合は、アンモニウム存在下およびナイトレートとアンモニウム共存下の２つの条件下で行った。トータルＲＮＡは、大豆の根からは５、７、１１、１４日目に調製し、葉からは１１、１４日目に調製した後に、ＲＴ−ＰＣＲにかけた。プライマーセットとしては、ＧｍＮＲＴ１−３用には５’ＳＢＯＮ２と３’ＳＢＯＮ２（表１）を、ＧｍＮＲＴ１−４用には５’ＳＢＯＮ３と３’ＳＢＯＮ３（表１）を用いた。
【００４８】根においては、ＧｍＮＲＴ１−３の増幅バンドが、すべてのサンプルで同等に検出された（図５のＡ））。この結果からも、ＧｍＮＲＴ１−３遺伝子は構成的に発現されていることが示された。ＧｍＮＲＴ１−２のバンドは、アンモニウム存在下に成長させた大豆のすべての試料において観察されたが、ナイトレートとアンモニウム共存下の場合は、バンドは観察されなかった（図５のＢ））。バンドの強度は成長と共に徐々に増加しており、明らかにバンドの強度の増加は、根の成長と対応していることが示された。
【００４９】ＧｍＮＲＴ１−４の発現は弱く、アンモニウム存在下の５日目と７日目の試料だけに観察された（図５のＣ））。従って、この結果は、アンモニウム存在下に成長させた大豆では、ＧｍＮＲＴ１−４遺伝子は成長の初期段階で発現しており、ＧｍＮＲＴ１−２遺伝子の発現は、根の成長と共に増加して行くことが示された。ＧｍＮＲＴ１−５の増幅バンドは、すべての試験サンプルにおいて観察できなかった。恐らく、今回の試験条件下では、発現が低すぎるものと考えられる。ＧｍＮＲＴ２のバンドは、アンモニウム存在下の７日目と１１日目の試料で見られたが、ナイトレートとアンモニウム共存下では１１日目の試料だけに、非常に弱いバンドが観察された（図５のＤ））。図５のＥ）のデータは、試験に用いたトータルＲＮＡの品質チェックと、結果の定量性の保証を目的として行ったものであるが、ｒＲＮＡの２８Ｓおよび１８Ｓバンドの状態を指標として判定した結果、問題はないことが示された。
【００５０】葉では、ＧｍＮＲＴ１−３遺伝子の増幅バンドが、アンモニウム存在下およびナイトレートとアンモニウム共存下の両方の試料において同様に検出され、１１日目と１４日目の試料のバンド強度は、ほとんど同等であった（図６のＡ））。しかしながら、ＧｍＮＲＴ１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−２のバンドもまた両方の条件下で検出され、１４日目のバンドの強度は１１日目の試料よりもずっと強かった（図６のＢ））。図６のＣ）のデータは、試験に用いたトータルＲＮＡの品質チェックと、結果の定量性の保証を目的として行ったものであるが、ｒＲＮＡの２８Ｓおよび１８Ｓバンドの状態を指標として判定した結果、問題はないことが示された。
【００５１】
【発明の効果】本発明は、大豆のｃＤＮＡクローニングと遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリーに属する大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を単離し、ヌクレオチド配列を同定するに至った。既知のＮＲＴ１ファミリー遺伝子との比較、特に発現組織の違いなどから、本発明の遺伝子および遺伝子断片は、確かに新規な遺伝子であることを同定できた。
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
【００５４】
【表５】
【００５５】
【表６】
【００５６】
【表７】
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| 【出願人】 |
【識別番号】８００００００１３
【氏名又は名称】有限会社 山口ティー・エル・オー
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| 【出願日】 |
平成１３年３月２８日（２００１．３．２８） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８０５３９
【弁理士】
【氏名又は名称】高木 義輝
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２８１９７５（Ｐ２００２−２８１９７５Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年１０月２日（２００２．１０．２） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−９３５２３（Ｐ２００１−９３５２３） |
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