| 【発明の名称】 |
３−ヒドロキシベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】本間 務
【氏名】今村 剛士
【氏名】見目 敬
【氏名】須川 悦子
【氏名】矢野 哲哉
【氏名】小林 辰
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| 【要約】 |
【課題】新規ポリヒドロキシアルカノエートを提供すること。また、目的外のモノマーユニットを大幅に低減し、かつ、高収率で当該ポリヒドロキシアルカノエートを取得できる、微生物による製造方法を提供すること。
【解決手段】３-ヒドロキシ-ベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして有する新規ポリヒドロキシアルカノエートを、ベンゾイルアルカン酸を原料として合成し得る微生物を、ベンゾイルアルカン酸と糖類とを含む培地で培養し、培養菌体に生産された当該ポリヒドロキシアルカノエートを抽出、回収する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 下記式[１]で表されるモノマーユニット組成を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
ＡxＢ(1-x) [１](ただし、上記式中、Ａは下記化学式[２]で表される少なくとも１つ以上であり、Ｂは下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上であり、xは０.０１以上１未満である)【化１】
(nは１から８の整数のいずれかである)【化２】
(ただし、pは０から１０の整数のいずれかを表す)【化３】
(ただし、qは３または５である)【請求項２】 化学式[５]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化４】
【請求項３】 化学式[６]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化５】
【請求項４】 化学式[７]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化６】
【請求項５】 化学式[８]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化７】
【請求項６】 化学式[９]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化８】
【請求項７】 化学式[６]で表されるモノマーユニットを含み、かつ、化学式[８]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化９】
【化１０】
【請求項８】 化学式[７]で表されるモノマーユニットを含み、かつ、化学式[９]で表されるモノマーユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【化１１】
【化１２】
【請求項９】 数平均分子量が１０,０００から１,０００,０００である、請求項１から請求項９のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート。
【請求項１０】 ベンゾイルアルカン酸から該ベンゾイルアルカン酸を利用して下記式[１]で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物を、該ベンゾイルアルカン酸を含む培地で培養する工程を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
ＡxＢ(1-x) [１](ただし、上記式中、Ａは下記化学式[２]で表される少なくとも１つ以上であり、Ｂは下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上であり、xは０.０１以上１未満である)【化１３】
(ただし、nは１以上の整数を表す)【化１４】
(ただし、pは０から１０の整数のいずれかを表す)【化１５】
(ただし、qは３または５である)【請求項１１】 ベンゾイルアルカン酸が下記化学式[１０]で表されるベンゾイルアルカン酸であり、ポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[１１]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１０に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化１６】
(nは１から８の整数のいずれかである)【化１７】
(ただし、式中ｍは、n、n−２、n−４、n−６からなる群より選択される少なくとも１つ以上であり、かつ、１以上の整数である)【請求項１２】 ベンゾイルアルカン酸と糖類とを含む培地で、該ベンゾイルアルカン酸を利用して前記式[１]で表されるモノマーユニット組成を有するポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有することを特徴とする、請求項１０に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１３】 微生物の培養が、ベンゾイルアルカン酸と糖類とを含む培地による１段階で行われることを特徴とする、請求項１２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１４】 微生物の培養が、ベンゾイルアルカン酸と糖類とを含む培地による培養と、これに続くベンゾイルアルカン酸と糖類を含み、かつ窒素源を制限した培地による培養の少なくとも２段階で行われることを特徴とする、請求項１２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１５】 糖類が、グルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１６】 微生物が、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)に属する微生物である、請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１７】 微生物がシュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ４５、ＦＥＲＭ ＢＰ-７３７４)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-７３７５)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ-７３７６)からなる群から選択される少なくとも１つの株である、請求項１６に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１８】 下記化学式[１２]で表される４-ベンゾイル酪酸を含む培地で、４-ベンゾイル酪酸を利用して下記化学式[５]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[５]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化１８】
【化１９】
【請求項１９】 下記化学式[１３]で表される５-ベンゾイル吉草酸を含む培地で、５-ベンゾイル吉草酸を利用して下記化学式[６]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[６]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化２０】
【化２１】
【請求項２０】 下記化学式[１４]で表される６-ベンゾイルヘキサン酸を含む培地で、６-ベンゾイルヘキサン酸を利用して下記化学式[７]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[７]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化２２】
【化２３】
【請求項２１】 下記化学式[１５]で表される７-ベンゾイルヘプタン酸を含む培地で、７-ベンゾイルヘプタン酸を利用して下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化２４】
【化２５】
【請求項２２】 下記化学式[９]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、下記化学式[１６]で表される８-ベンゾイルオクタン酸を含む培地で、８-ベンゾイルオクタン酸を利用して下記化学式[９]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[９]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化２６】
【化２７】
【請求項２３】 下記化学式[１５]で表される７-ベンゾイルヘプタン酸を含む培地で、７-ベンゾイルヘプタン酸を利用して下記化学式[６]で表されるモノマーユニットを含み、かつ、下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[６]で表されるモノマーユニットを含み、かつ下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【請求項２４】 下記化学式[７]で表されるモノマーユニットを含み、かつ、下記化学式[９]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、下記化学式[１６]で表される８-ベンゾイルオクタン酸を含む培地で、８-ベンゾイルオクタン酸を利用して下記化学式[７]で表されるモノマーユニットを含み、かつ、下記化学式[９]で表されるモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する微生物を培養する工程を有し、生産されたポリヒドロキシアルカノエートが下記化学式[７]で表されるモノマーユニットを含み、かつ下記化学式[９]で表されるモノマーユニットを含む請求項１０から請求項１２のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化３１】
【化３２】
【化３３】
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合もある)に関する。また、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を用いた当該ＰＨＡの極めて効率的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合もある)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ16株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す場合もある)と３-ヒドロキシ吉草酸(以下、３ＨＶと略す場合もある)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特表平６-１５６０４号公報、特表平７-１４３５２号公報、特表平８-１９２２７号公報など)。
【０００５】特開平５-７４４９２号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍsp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００６】特開平５-９３０４９号公報、及び、特開平７-２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(以下、３ＨＨxと略す場合もある)との２成分共重合体を生産することが開示されている。
【０００７】特開平９-１９１８９３号公報では、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００８】また、近年、炭素数が１２程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length:ｍclと略記)の３-ヒドロキシアルカノエート(以下、３ＨＡと略す場合もある)からなるＰＨＡについての研究が精力的に行われている。このようなＰＨＡの合成経路は大きく２つに分類することが可能であり、その具体例を下記(１)および(２)に示す。
【０００９】(１)β酸化を利用した合成:特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Pseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３-ヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。
【００１０】また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,５８(２),746 (1992)には、シュードモナス・レジノボランス(Pseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 1：15：75：9)をモノマーユニットとするポリエステルを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 8：62：23：7)をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３ＨＡモノマーユニットは(２)で説明する脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００１１】(２)脂肪酸合成経路を利用した合成Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,１６(３)、119 (1994)には、シュードモナス sp.61-3株(Pseudoｍonas sp.61-3 strain)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸及び、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするポリエステルを生産することが報告されている。
【００１２】ところで、通常、ＰＨＡの生合成は、細胞内の様々な代謝経路の中間体として生じる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」を基質とし、ＰＨＡシンターゼ(ＰＨＡ synthase)により行われる。
【００１３】ここで、「ＣoＡ」とは「補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)」のことである。そして上記(１)の先行技術に記載されている様に、オクタン酸やノナン酸等の脂肪酸を炭素源とした場合、ＰＨＡの生合成は、「β酸化サイクル」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われるとされている。
【００１４】以下に、「β酸化サイクル」を経由してＰＨＡが生合成されるまでの反応を示す。
【００１５】
【化３４】
一方、上記(２)の先行技術に記載されている様に、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われるとされている。ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリアプロテイン(acyl carrier protein)」のことである。
【００１６】ところで、先に述べたとおり、上記(１)および(２)で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基(例えば、フェニル基など)を側鎖に導入したＰＨＡが極めて有用であることが期待される。他の置換基の例としては、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。
【００１７】そのような置換基を側鎖に導入したＰＨＡ(以下、必要に応じて「unusual ＰＨＡ」とする)の合成に関しては、β酸化を利用した合成について、例えば、Ｍacroｍolecules,２４,p5256-5260 (1991)に、アリール基等を側鎖に導入したＰＨＡに関する報告がある。具体的には、シュードモナス・オレオボランスが５-フェニル吉草酸(以下、ＰＶＡと略す場合もある)とノナン酸とを基質として(モル比２:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３ＨＶ、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(以下、３ＨＰＶと略す場合もある)をモノマーユニットとして、0.6：16.0：41.1：1.7：40.6 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、また、ＰＶＡとオクタン酸とを基質として(モル比１:１、総濃度 10ｍｍol/L)、３ＨＨx、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３ＨＰＶをモノマーユニットとして、7.3：64.5：3.9：24.3の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比 39.2％)生産することが報告されている。この報告におけるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられていることからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと考えられる。
【００１８】関連する記述は、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.,１９１，1957-1965(1990)、Ｃhirality,３，492-494(1991)にもあり、３ＨＰＶが含まれていることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、微生物産生ＰＨＡにおいては、その製造に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、各種の組成・構造のものが得られているが、プラスチックとしての応用を考えた場合、物性的に未だ十分であるとは言えない。微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためにはさらに多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００２０】一方、前述のような、置換基を側鎖に導入したタイプのＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)は、導入した置換基を所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そのような機能性と生分解性とを両立可能であるような優れたＰＨＡと、その製造方法、ならびに、所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索もまた重要な課題である。
【００２１】このような置換基を側鎖に導入したＰＨＡの他の例としては、前記したフェニル基、さらにはフェノキシ基を側鎖に有するＰＨＡが挙げられる。
【００２２】フェニル基の他の例としては、Ｍacroｍolecules,２９,1762-1766 (1996)に、シュードモナス・オレオボランスが、５-(４-トリル)吉草酸(５-(４-メチルフェニル)吉草酸)を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(４-トリル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２３】更には、Ｍacroｍolecules,３２,2889-2895 (1999)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸とノナン酸を基質として含む培地での培養によって、３-ヒドロキシ-５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２４】また、フェノキシ基の例としては、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５,1665-1672 (1994)に、シュードモナス・オレオボランスが１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２５】また、Ｍacroｍolecules,２９,3432-3435 (1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用いて、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨＡを、１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。この報告におけるポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。
【００２６】
【表１】
更に、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,４１,32-43(1995)では、シュードモナス・オレオボランスＡＴＣＣ29347株及びシュードモナス・プチダ(Pseudoｍonas putida)ＫＴ2442株を用いて、オクタン酸と p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは p-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産に成功している。
【００２７】特許第２９８９１７５号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造方法が記載されている。
【００２８】これらの生産は以下の様な「二段階培養」で行われている。
培養時間： 一段目、24時間 ； 二段目、96時間各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。
(１)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐホモポリマー一段目の基質:クエン酸、イーストエキス二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸(２)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐホモポリマー一段目の基質:クエン酸、イーストエキス二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸(３)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐコポリマー一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸(４)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐコポリマー一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イーストエキス二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００２９】また、シクロヘキシル基をモノマーユニット中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボランスによる生産の例が報告されている(Ｍacroｍolecules,３０,1611-1615 (1997))。
【００３０】この報告によれば、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸(以下、ＮＡと記載する)とシクロヘキシル酪酸(以下、ＣＨＢＡと記載する)あるいはシクロヘキシル吉草酸(以下、ＣＨＶＡと記載する)の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている(各割合は不明)。
【００３１】その収率等に関しては、ＣＨＢＡに対して、基質濃度トータル２０ｍｍol/Lの条件で、ＣＨＢＡとＮＡの量比を変化させ、表２に示すような結果を得たと報告されている。
【００３２】
【表２】
ＣＤＷ:乾燥菌体重量(ｍg/L)、ＰＤＷ:乾燥ポリマー重量(ｍg/L)、収率:ＰＤＷ/ＣＤＷ(％)しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。
【００３３】このように、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に見られるように、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【００３４】しかしながら、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチル-ＣoＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチル-ＣoＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまう点が大きな課題である。
【００３５】また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。前述の報告例では、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。
【００３６】この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。さらに、β酸化によるアセチル-ＣoＡの生成に基づいたエネルギー源の供給を前提とした方法では、微生物の増殖が遅く、ＰＨＡの合成に時間がかかる点、合成されたＰＨＡの収率が低くなりがちな点も大きな課題である。
【００３７】このため、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が有効と考えられ、一般的に用いられている。
【００３８】しかしながら、本発明者らの検討によれば、上記のようにオクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を増殖用炭素源とし、β-酸化経路を経て合成されたＰＨＡは、その純度が低く、得られるポリマーの 50％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)であるｍcl-３ＨＡモノマーユニット、すなわち「usual ＰＨＡ」のユニットである。これらのｍcl-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、本発明の目的とするＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。
【００３９】このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在は大きな課題である。
【００４０】この課題の解決手段としては、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍcl-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。
【００４１】さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍcl-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍcl-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００４２】このため、本発明者らは、機能性ポリマーへの応用を考慮した場合、「unusual ＰＨＡ」を高純度で得られる生合成方法の開発が是非とも必要であるとの認識を持つに至った。よって、前記のような機能性と生分解性とを兼ね備えた優れたポリマーと、当該ポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、当該ＰＨＡを高純度で効率的に生合成する方法の開発は極めて有用かつ重要であると考えられた。
【００４３】本発明は前記の課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)の提供、ならびに、当該「unusual ＰＨＡ」を微生物を利用して製造する方法の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。
【００４４】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、デバイス材料や医用材料等として有用な官能基を側鎖に有するＰＨＡの開発を目指して、各種のＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索、及び、このような微生物を用いた所望のＰＨＡの生産方法について鋭意研究を重ねてきた。その結果、化学式[１０]、【００４５】
【化３５】
(nは１から８の整数のいずれかである)【００４６】
【化３６】
(nは１から８の整数のいずれかである)で表される３-ヒドロキシベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物を前記化学式[８]で表されるベンゾイルアルカン酸と糖類の共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出した。さらに詳しくは、化学式[１２]、【００４７】
【化３７】
で表される４-ベンゾイル酪酸(以下、ＢzＢＡと略す場合もある)、化学式[１３]、【００４８】
【化３８】
で表される５-ベンゾイル吉草酸(以下、ＢzＶＡと略す場合もある)、化学式[１４]、【００４９】
【化３９】
で表される６-ベンゾイルヘキサン酸(以下、ＢzＨxＡと略す場合もある)、化学式[１５]、【００５０】
【化４０】
で表される７-ベンゾイルヘプタン酸(以下、ＢzＨpＡと略す場合もある)、化学式[１６]、【００５１】
【化４１】
で表される８-ベンゾイルオクタン酸(以下、ＢzＯＡと略す場合もある)の各々を原料として、それぞれ、化学式[５]、【００５２】
【化４２】
で表される３-ヒドロキシ-４-ベンゾイル酪酸(以下、３ＨＢzＢと略す場合もある)、化学式[６]、【００５３】
【化４３】
で表される３-ヒドロキシ-５-ベンゾイル吉草酸(以下、３ＨＢzＶと略す場合もある)、化学式[７]、【００５４】
【化４４】
で表される３-ヒドロキシ-６-ベンゾイルヘキサン酸(以下、３ＨＢzＨxと略す場合もある)、化学式[８]、【００５５】
【化４５】
で表される３-ヒドロキシ-７-ベンゾイルヘプタン酸(以下、３ＨＢzＨpと略す場合もある)、化学式[９]、【００５６】
【化４６】
で表される３-ヒドロキシ-８-ベンゾイルオクタン酸(以下、３ＨＢzＯと略す場合もある)をモノマーユニットとして含む新規なＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を見出し、さらに、これら微生物をＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、または、ＢzＯＡと、糖類との共存下で培養することにより、当該ＰＨＡを生合成することができること、それによって得られる当該ＰＨＡが比較的高純度であることを見出し、本発明を為すに至った。
【００５７】即ち、本発明は、下記式[１]で表されるモノマーユニット組成を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートに関するものである。
ＡxＢ(1-x) [１](ただし、上記式中、Ａは下記化学式[２]で表される少なくとも１つ以上であり、Ｂは下記化学式[３]または下記化学式[４]で表されるモノマーユニットから選択される少なくとも１つ以上であり、xは０.０１以上１未満である)【００５８】
【化４７】
(nは１から８の整数のいずれかである)【００５９】
【化４８】
(ただし、pは０から１０の整数のいずれかを表す)【００６０】
【化４９】
(ただし、qは３または５である)また、本発明は、化学式[１０]、【００６１】
【化５０】
(nは１から８の整数のいずれかである)で表されるベンゾイルアルカン酸を含む培地で微生物を培養することで、該微生物に、前記化学式[１１]、【００６２】
【化５１】
(ただし、式中ｍは、n、n−２、n−４、n−６からなる群より選択される少なくとも１つ以上であり、かつ、１以上の整数である)で表される対応するモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを産生させる工程を有することを特徴とする、該ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法についてのものである。
【００６３】なお、本発明の方法においては、糖類化合物、例えば、グルコースやフルクトース、マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡにはグルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類を用いたＰＨＡ微生物生産方法とは根本的に異なる。
【００６４】また、本発明では、微生物が生産した該ＰＨＡを単離する工程を更に有することが好ましい。
【００６５】
【発明の実施の形態】本発明のＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【００６６】＜糖類ならびにＴＣＡサイクルに関与する有機酸 従来技術との差異＞本発明のＰＨＡ製造方法の１つは、微生物を培養する際、培地に所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えて、当該アルカノエート以外の炭素源として糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することで、微生物が産生・蓄積するＰＨＡにおいて、目的とするモノマーユニットの含有率を著しく高いものとする、あるいは目的とするモノマーユニットのみとする点を特徴としている。この特定のモノマーユニットの優先化を促進する効果は、培地中に当該アルカノエート以外の炭素源として糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸のみを添加することにより得られている。
【００６７】すなわち、発明者らは、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸を共存基質として、所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと共に培養せしめたところ、ノナン酸やオクタン酸といったｍcl-アルカノエートを共存基質として用いた従来の方法に比べ、目的とするＰＨＡが格段に優れた収率および純度で得られること、そしてこのような効果が、微生物の炭素源ならびにエネルギー源であるアセチルＣoＡをβ酸化に拠らない方法により生成することが可能な培養方法であることにより得られるものであるとの知見を得て本発明に至ったものである。
【００６８】本発明の方法においては、糖類化合物、例えばグルコースやフルクトース、マンノース等は、微生物の増殖基質として利用されることになり、生産されるＰＨＡは、糖類に共存させている所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートから構成され、グルコース等の糖類に由来するモノマーユニットが全く含まれないか、極めて少量しか含まれない。このような点で、本発明の方法は、従来のグルコースなどの糖類そのものをＰＨＡに導入するモノマーユニットの原料基質として用いるＰＨＡ微生物生産方法とは構成及び効果ともに根本的に異なるものである。
【００６９】以下に、本発明のＰＨＡ、製造方法、微生物についてより詳しく説明する。
【００７０】＜ＰＨＡモノマーユニット供給系＞先ず、目的とするＰＨＡに混在してくるｍcl-３ＨＡモノマーユニットの供給系の１つである「脂肪酸合成経路」について詳細に説明する。グルコース等の糖類を基質とした場合、細胞成分として必要なアルカノエートは、糖類から「解糖系」を経て生産されるアセチルＣoＡを出発物質とした「脂肪酸合成経路」から生合成される。なお、脂肪酸合成には新規(de novo)合成経路と炭素鎖延長経路があり、以下にこれらについて説明する。
【００７１】１)新規(de novo)合成経路アセチルＣoＡカルボキシラーゼ(ＥＣ ６.４.１.２)と脂肪酸合成酵素(ＥＣ２.３.１.８５)の２つの酵素で触媒される。なお、アセチルＣoＡカルボキシラーゼは、ビオチンを介在し、最終的に以下の反応を触媒し、アセチルＣoＡからマロニルＣoＡを生成する酵素であり、反応は下記式[１７]で表わされる。
また、脂肪酸合成酵素は、転移-縮合-還元-脱水-還元の反応サイクルを触媒する酵素であり、全反応は次の反応式[１８]で示される。
アセチルCoA＋nマロニルCoA＋2nNADPH＋2nH+ ⇒CH3(CH2)2nCOOH＋nCO2＋2nNADP+＋(n-1)CoA [１８]なお、酵素の種類によって、反応産物が遊離酸、ＣoＡ誘導体、あるいはＡＣＰ誘導体の場合がある。
【００７２】ここで、アセチルＣoＡ及びマロニルＣoＡは以下の化学式[１９]及び[２０]で示される。
【００７３】
【化５２】
【００７４】
【化５３】
また、ＣoＡとは補酵素Ａ(co-enzyｍeＡ)の略称であり、以下の化学式[２１]で示される。
【００７５】
【化５４】
本反応経路のうち、以下に示す経路により、ＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が中間体として供給される。また、以下の反応式に示すように経路は炭素を２個ずつ付加しながら最終的にはパルミチン酸まで延長される。それゆえＰＨＡ生合成のモノマー基質としては「Ｄ-３-ヒドロブチリル-ＡＣＰ」から「Ｄ-３-ヒドロキシパルミチル-ＡＣＰ」の炭素数が偶数の７種類の「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が供給されることになる。
【００７６】
【化５５】
２)炭素鎖延長経路この経路は、アシル-ＡＣＰにマロニルＡＣＰが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシル-ＡＣＰ(及びＣＯ2)となる経路(経路Ａとする)と、アシル-ＣoＡにアセチルＣoＡが付加し、最終的に炭素鎖が２つ延長されたアシル-ＣoＡとなる経路(経路Ｂとする)の２経路に大別される。以下に各経路について説明する。
・経路ＡR-CO-ACP＋マロニル-ACP→R-CO-CH2-CO-ACP+CO2R-CO-CH2-CO-ACP→R-CHOH-CH2-CO-ACP→R-CH=CH-CO-ACP→R-CH2-CH2-CO-ACP・経路ＢR-CO-CoA＋アセチル-CoA→R-CO-CH2-CO-CoAR-CO-CH2-CO-CoA→R-CHOH-CH2-CO-CoA→R-CH=CH-CO-CoA→R-CH2-CH2-CO- CoAＡ,Ｂいずれの系も、中間体として「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」あるいは「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」が生じ、「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」はそのままＰＨＡ合成のモノマー基質として利用され、「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」はＡＣＰ-ＣoＡ転移酵素により「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」に変換された後に、ＰＨＡ合成のモノマー基質として利用されると考えられる。
【００７７】グルコース等の糖類を基質とした場合、微生物細胞中では以上のような「解糖系」及び「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。また、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸を基質とした場合、ピルビン酸からはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより直接アセチルＣoＡが生成する。ＴＣＡサイクル上の有機酸からは、例えば、リンゴ酸からはリンゴ酸デヒドロゲナーゼによりピルビン酸が生成し、さらに上記の反応によりアセチルＣoＡが生成する。オキサロ酢酸からはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりホスホエノールピルビン酸が生成し、ホスホエノールピルビン酸がピルビン酸キナーゼにより触媒されピルビン酸が生成、さらに上記反応によりアセチルＣoＡが生成する。これらの反応により生成したアセチルＣoＡが「脂肪酸合成経路」を経由してｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されると考えられる。
【００７８】ここで、例えばオクタン酸、ノナン酸等のｍcl-アルカノエート、あるいは、例えば、５-フェニル吉草酸、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸、６-フェニルヘキサン酸、４-フェノキシ酪酸、４-シクロヘキシル酪酸といった、末端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加されたアルカノエートはＣoＡリガーゼ(ＥＣ６.２.１.３等)によりＣoＡ誘導体となり、β酸化系を担う酵素群により直接的にＰＨＡ生合成のモノマー基質となる「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」となると考えられる。
【００７９】つまり、糖類あるいはＴＣＡサイクルに関与する有機酸から生成するｍcl-３ＨＡモノマーユニットが、きわめて多段階の酵素反応を経て(つまり間接的に)生成されるのに比較し、ｍcl-アルカノエートからはきわめて直接的にｍcl-３ＨＡモノマーユニットが生成されてくることになる。
【００８０】ここで、微生物の増殖を担うアセチルＣoＡの生成について説明する。目的とするモノマーユニット導入用のアルカノエートに加えてｍcl-アルカノエートを共存させる方法では、これらのアルカノエートがβ酸化系を経由することによりアセチルＣoＡが生成する。一般にバルキーな置換基を有するアルカノエート(フェニル基、フェノキシ基、シクロヘキシル基等の置換基を有するアルカノエート)に比較し、ｍcl-アルカノエートはβ酸化系の酵素群との基質親和性に優れていると考えられ、ｍcl-アルカノエートの共存により効果的にアセチルＣoＡが生成される。このため、アセチルＣoＡをエネルギー源及び炭素源として用いる微生物の増殖には有利となる。
【００８１】しかしながら、β酸化系を経由するｍcl-アルカノエートが直接的にＰＨＡのモノマーユニットとなるために、生産されるＰＨＡは、目的のモノマーユニットに加えてｍcl-３ＨＡモノマーユニットの混在が多いものとなってしまうことが大きな課題である。
【００８２】この課題を解決するためには、ｍcl-アルカノエート以外で、効果的にアセチルＣoＡあるいはエネルギー源及び炭素源を供給し得るような基質を選択し、目的とするアルカノエートと共存させる方法が望ましい。前述のように、アセチルＣoＡは脂肪酸合成経路を経ることによりＰＨＡのモノマーユニットとなり得るが、ｍcl-アルカノエートに比較すればより多段階の反応を経由する必要がある間接的なものであり、また、アセチルＣoＡを生成し得るような基質の濃度等、培養条件を適宜選択することにより、実質的にはｍcl-３ＨＡの混在のない、あるいは少ない製造方法の実現が可能である。
【００８３】また、１段階目で微生物の増殖のみを目的に培養し、２段階目においては炭素源として目的とするアルカノエートのみを培地に加える製造方法が汎用されている。ここで、当該アルカノエートをアシルＣoＡ化するベータ酸化系の初発酵素であるアシルＣoＡリガーゼがＡＴＰを要求することから、発明者らの検討によれば２段階目においても微生物がエネルギー源として利用し得る基質を共存させる製造方法がより効果的であるとの結果を得て、本発明を完成した。
【００８４】以下に、本発明において利用される微生物、培養工程などについて説明する。
【００８５】(微生物)本発明に用いる微生物としては、前記のＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、または、ＢzＯＡを原料とし、それぞれ対応する前記の３ＨＢzＢ、３ＨＢzＶ、３ＨＢzＨx、３ＨＢzＨp、または、３ＨＢzＯをモノマーユニットとして含むＰＨＡを産生可能であれば、いかなる微生物をも使用することができる。また、本発明の目的を達成できる範囲内で、必要に応じて複数の微生物を混合して用いることもできる。
【００８６】本発明者らは、ＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、または、ＢzＯＡを基質として用いて、それぞれ対応する前記の３ＨＢzＢ、３ＨＢzＶ、３ＨＢzＨx、３ＨＢzＨp、または、３ＨＢzＯをモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、本発明者らが土壌より分離した微生物であり、ＰＨＡの生産能力を有する、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ45)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ161)等が所望の能力を有することを見出した。なお、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7374」として、ＹＮ2株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7375」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ-7376」として、経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにそれぞれ寄託されており、特願平１１-３７１８６３号に記載されている微生物である。
【００８７】前記のＨ45株、ＹＮ2株およびＰ161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。また、Ｐ161株については、16ＳrＲＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
＜Ｈ45株の菌学的性質＞(１)形態学的性質細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.0〜1.2μｍ細胞の多形性 :なし運動性 :あり胞子形成 :なしグラム染色性 :陰性コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色(２)生理学的性質カタラーゼ :陽性オキシダーゼ :陽性Ｏ/Ｆ試験 :酸化型硝酸塩の還元 :陰性インドールの生成 :陰性ブドウ糖酸性化 :陰性アルギニンジヒドロラーゼ :陰性ウレアーゼ :陰性エスクリン加水分解 :陰性ゼラチン加水分解 :陰性β-ガラクトシダーゼ :陰性Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性４％ＮaＣlでの生育 :陰性ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(３)基質資化能ブドウ糖 :陽性Ｌ-アラビノース :陰性Ｄ-マンノース :陽性Ｄ-マンニトール :陽性Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性マルトース :陰性グルコン酸カリウム :陽性n-カプリン酸 :陽性アジピン酸 :陰性dl-リンゴ酸 :陽性クエン酸ナトリウム :陽性酢酸フェニル :陽性＜ＹＮ２株の菌学的性質＞(１)形態学的性質細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ細胞の多形性 :なし運動性 :あり胞子形成 :なしグラム染色性 :陰性コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明(２)生理学的性質カタラーゼ :陽性オキシダーゼ :陽性Ｏ/Ｆ試験 :酸化型硝酸塩の還元 :陰性インドールの生成 :陽性ブドウ糖酸性化 :陰性アルギニンジヒドロラーゼ :陰性ウレアーゼ :陰性エスクリン加水分解 :陰性ゼラチン加水分解 :陰性β-ガラクトシダーゼ :陰性Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性Ｔｗeen 80 の加水分解 :陽性(３)基質資化能ブドウ糖 :陽性Ｌ-アラビノース :陽性Ｄ-マンノース :陰性Ｄ-マンニトール :陰性Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性マルトース :陰性グルコン酸カリウム :陽性n-カプリン酸 :陽性アジピン酸 :陰性dl-リンゴ酸 :陽性クエン酸ナトリウム :陽性酢酸フェニル :陽性
(２)生理学的性質カタラーゼ :陽性オキシダーゼ :陽性Ｏ/Ｆ試験 :酸化型硝酸塩の還元 :陽性インドールの生成 :陰性ブドウ糖酸性化 :陰性アルギニンジヒドロラーゼ :陽性ウレアーゼ :陰性エスクリン加水分解 :陰性ゼラチン加水分解 :陰性β-ガラクトシダーゼ :陰性Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性(３)基質資化能ブドウ糖 :陽性Ｌ-アラビノース :陽性Ｄ-マンノース :陽性Ｄ-マンニトール :陽性Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性マルトース :陰性グルコン酸カリウム :陽性n-カプリン酸 :陽性アジピン酸 :陰性dl-リンゴ酸 :陽性クエン酸ナトリウム :陽性酢酸フェニル :陽性(培養工程)＜培養 一般＞これらの微生物を所望とするモノマーユニット導入用のアルカノエートと本発明の増殖用基質を含む培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【００８８】本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００８９】培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００９０】前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、３ＨＢzＢ、３ＨＢzＶ、３ＨＢzＨx、３ＨＢzＨpまたは３ＨＢzＯをモノマーユニットとして含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応するＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、ＢzＯＡと、微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。増殖用炭素源としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能であり、更に、糖類、例えば、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸やガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等のほか、ピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸等のＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸或いはその塩など、また、グルタミン酸等のアミノ酸或いはその塩等、β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍcl-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。 微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、ＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、または、ＢzＯＡを 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、ＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、または、ＢzＯＡを 0.01％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地で更に培養する方法がある。
【００９１】上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(Ｊ.Ｂiol.Ｃheｍ.，２１８，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００９２】なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【００９３】
Ｎa2ＨＰＯ4： ６.２gＫＨ2ＰＯ4 ： ３.０gＮaＣl ： ０.５gＮＨ4Ｃl ： １.０g(培地１リットル中、pＨ７.０)更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
【００９４】[微量成分溶液]ニトリロ三酢酸:1.5 ；ＭgＳＯ4:3.0 ；ＭnＳＯ4:0.5 ；ＮaＣl:1.0 ；ＦeＳＯ4:0.1 ；ＣaＣl2:0.1 ；ＣoＣl2:0.1 ；ＺnＳＯ4:0.1 ；ＣuＳＯ4:0.1 ；ＡlＫ(ＳＯ4)2:0.1 ；Ｈ3ＢＯ3:0.1 ；Ｎa2ＭoＯ4:0.1 ；ＮiＣl2:0.1(培地１リットル中、pＨ7.0)培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 14〜40℃、好ましくは 20〜35℃程度が適当である。
【００９５】具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05％から 5.0％程度、および、ＢzＢＡ、ＢzＶＡ、ＢzＨxＡ、ＢzＨpＡ、または、ＢzＯＡを 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【００９６】Ｄ-グルコースの代わりに同量の酵母エキスを与えても良い。その他、ポリペプトン、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等及びその塩)、及びそれらの組み合わせを用いてもよい。
【００９７】＜ＰＨＡの回収＞本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行われている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行われているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にアセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【００９８】なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【００９９】以下に実施例を示す。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１００】
【実施例】[実施例１]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＢＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。42時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表３に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１０１】
【表３】
このＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
＜測定条件＞測定核種:1Ｈ使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl3をキャピラリ封入でreferenceとして使用)共鳴周波数:1Ｈ＝400ＭＨz1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図１に示した。
【０１０２】図１に示した1Ｈ-ＮＭＲスペクトルから、前記化学式[２]で表されるモノマーユニットを有するＰＨＡが得られたことがわかった。さらに、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝18,000、Ｍｗ＝42,000 であった。
【０１０３】[実施例２]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＢＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＢＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。42時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１０４】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１０５】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表４に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＢをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１０６】
【表４】
[実施例３]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。42時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１０７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１０８】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表５に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１０９】
【表５】
このＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
＜測定条件＞測定核種:1Ｈ、13Ｃ使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl3をキャピラリ封入で reference として使用)共鳴周波数:1Ｈ＝400ＭＨz、13Ｃ＝100ＭＨz1Ｈ及び13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを図２及び図３に示した。
【０１１０】図２および図３に示した1Ｈ及び 13 Ｃ-ＮＭＲスペクトルから、前記化学式[３]で表されるモノマーユニットを有するＰＨＡが得られたことがわかった。その帰属結果(化学式[２２]参照)を表６に示した。
【０１１１】
【化５６】
【０１１２】
【表６】
さらに、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝330,000、Ｍｗ＝１,300,000 であった。
【０１１３】[実施例４]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ 45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。42時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１４】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１１５】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表７に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１１６】
【表７】
[実施例５]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＶＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＶＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。41時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１１７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１１８】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表８に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１１９】
【表８】
[実施例６]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＨxＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＨxＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１２０】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１２１】得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
＜測定条件＞測定核種:1Ｈ使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl３をキャピラリ封入で reference として使用)共鳴周波数:1Ｈ＝400ＭＨz1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図４に示した。図４に示した1Ｈ-ＮＭＲスペクトルから、前記化学式[４]で表されるモノマーユニットを有するＰＨＡが得られたことがわかった。
【０１２２】さらにこのＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表９に示す。
【０１２３】
【表９】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＢzＨxをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１２４】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝24,000、Ｍｗ＝62,000 であった。
【０１２５】[実施例７]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＨxＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＨxＡ０.１％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１２６】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１２７】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１０に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＨxをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１２８】
【表１０】
[実施例８]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＨxＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。46時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＨxＡ0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１２９】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３０】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１１に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＨxをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１３１】
【表１１】
[実施例９]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＨpＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ2株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＨpＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１３２】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３３】得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
【０１３４】＜測定条件＞測定核種:1Ｈ使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl3をキャピラリ封入で reference として使用)共鳴周波数:1Ｈ＝400ＭＨz1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図５に示した。
【０１３５】
【図５】図５に示した1Ｈ-ＮＭＲスペクトルから、前記化学式[５]で表されるモノマーユニットを有するＰＨＡが得られたことがわかった。
【０１３６】さらにこのＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表１２に示す。
【０１３７】
【表１２】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＢzＨpをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１３８】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝23,000、Ｍｗ＝53,000 であった。
【０１３９】[実施例１０]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＨpＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＨpＡ０.１％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１４０】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４１】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１３に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＨpをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４２】
【表１３】
[実施例１１]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＨpＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＨpＡ0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１４３】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４４】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１４に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＨpをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１４５】
【表１４】
[実施例１２]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＯＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＯＡ０.１％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１４６】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１４７】得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400)を用いて、下記の測定条件で分析した。
【０１４８】＜測定条件＞測定核種:1Ｈ使用溶媒:ＣＤＣl3(ＴＭＳ/ＣＤＣl3をキャピラリ封入で reference として使用)共鳴周波数:1Ｈ＝400ＭＨz1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図６に示した。
【０１４９】
【図６】図６に示した1Ｈ-ＮＭＲスペクトルから、前記化学式[６]で表されるモノマーユニットを有するＰＨＡが得られたことがわかった。
【０１５０】さらにこのＰＨＡについて、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表１５に示す。
【０１５１】
【表１５】
上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＢzＯをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５２】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソー ＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝41,000、Ｍｗ＝93,000 であった。
【０１５３】[実施例１３]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＯＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＯＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。
【０１５４】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５５】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１６に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＯをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５６】
【表１６ 】
[実施例１４]Ｄ-グルコース 0.5％、ＢzＯＡ 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。47時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％とＢzＯＡ 0.1％とを含む、窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に 30℃、125ストローク/分で振盪培養した。43時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【０１５７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１５８】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１７に示す通り、当該ＰＨＡは３ＨＢzＯをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確認された。
【０１５９】
【表１７】
【０１６０】
【発明の効果】本発明により、３-ヒドロキシベンゾイルアルカン酸をモノマーユニットとして含む新規ポリヒドロキシアルカノエートと、当該ポリヒドロキシアルカノエートを微生物を用いて生産する方法が提供される。これにより、機能性ポリマーとして有用な当該ポリヒドロキシアルカノエートが効率的に生産でき、デバイス材料や医用材料等の各分野への応用が期待できる。
【０１６１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Canon Inc.<120> Polyhydroxyalkanoate comprising 3-hydroxybenzoylalkanoic acid as monomer units, and its manufacturing method.<130> 4396021<160> 1<210> 1<211> 1501<212> DNA<213> Pseudomonas jessenii 161 strain.<400> 1tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg atgacgggag cttgctcctg 60aattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt 120ctcgaaaggg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc 180ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc 300agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc 360catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg 420cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg 480tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca 600ttcaaaactg acaagctaga gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa 660atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact gatactgaca 720ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780acgatgtcaa ctagccgttg ggagccttga gctcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt 840tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac 960atccaatgaa ctttccagag atggatgggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca 1020tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct 1080tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg 1140gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc 1200tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc acaaaaccga 1260tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1320gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt accacggtgt 1440gattcatgac tggggtgaag tcgtaccaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca 1500c 1501 |
| 【出願人】 |
【識別番号】０００００１００７
【氏名又は名称】キヤノン株式会社
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| 【出願日】 |
平成１３年１月３１日（２００１．１．３１） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８８３２８
【弁理士】
【氏名又は名称】金田 暢之 （外２名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−１７３５２１（Ｐ２００２−１７３５２１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年６月２１日（２００２．６．２１） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−２４１５７（Ｐ２００１−２４１５７） |
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