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【発明の名称】 外用剤組成物
【発明者】 【氏名】秋葉 俊一

【氏名】浜 正勝

【氏名】荒 勝俊

【氏名】斎藤 英一
【要約】 【課題】

【解決手段】シスタチンを含有する外用剤組成物、化粧料又はデオドラント剤。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 シスタチンを含有する外用剤組成物。
【請求項２】 シスタチンを含有する化粧料。
【請求項３】 シスタチンを含有するデオドラント剤。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトの不快な体臭の発生を抑制する外用剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ヒトの不快な体臭の防除技術には、制汗機能を有する素材による汗の制御技術、抗菌機能を有する素材による不快臭発生原因菌の増殖の制御技術、発生した不快な体臭を消臭する技術及び香りによるマスキング技術等がある。【０００３】制汗技術としては比較的強い収斂作用を有するパラフェノールスルホン酸亜鉛やクエン酸、各種のアルミニウムやジルコニウム塩を用いて発汗を抑制する方法が考案され、抗菌技術としては体臭の原因物質を作り出す原因菌(皮膚常在菌を含む)の増殖を抑制する機能を有するトリクロ酸、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩酸クロルヘキシジン、ハロカルバン等の抗菌剤を用いて臭気の発生を抑制する方法が考案されている。【０００４】また、消臭技術としては不快な体臭の原因物質の―つである低級脂肪酸を亜鉛華(酸化亜鉛)などにより金属塩に変えることでその特異的な臭気の発生を抑制する方法やフラボノイドやクロロフィルなど消臭効果を有する素材の配合が考案され、マスキング技術としては、香水やオーデコロンにより程度の弱い体臭をマスキングする方法等が考案されている。【０００５】しかしながら、従来の制汗技術、消臭技術及びマスキング技術は、効果の持続性という点で充分でなく、また抗菌技術は不快臭の発生原因菌以外に皮膚常在菌をも殺菌することで皮膚の一次バリアー機能を低下させるおそれが示唆されている。【０００６】本発明は、皮膚の常在菌を殺すことなく、不快な体臭を持続的に抑制できる外用剤組成物を提供することを目的とする。【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトの不快な体臭の原因物質の一つとされるアポクリン臭に着目し、その生成抑制について検討したところ、システインプロテアーゼ阻害剤の一つであるシスタチンがアポクリン臭の生成を抑制し、皮膚常在菌を殺すことなく不快な体臭の発生を抑制できる外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤として使用できることを見出した。
【０００８】すなわち本発明は、シスタチンを含有する外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤の有効成分であるシスタチンとは、システインプロテアーゼ阻害活性を有する蛋白性の物質であり、動物組織、細胞、血液中や尿中に見出され、これまでにラット表皮由来のシスタチンα、ラット肝臓由来のシスタチンβ、ヒト尿由来のシスタチンＣ、ヒト唾液由来のシスタチンＳ、卵白シスタチン、牛初乳由来シスタチン（特開平７−１２６２９４号公報）、サケ由来シスタチン（特開平５−２４７０９３）等が知られている。本発明においては、アポクリン臭抑制効果を有する限りこれらの何れをも包含するものであるが、効果の点からヒト唾液由来のシスタチンＳが特に好ましい。また、当該シスタチンは、天然型或いは遺伝子組換えにより産生された組換え体の何れでもよい。
【００１０】また、化粧料やデオドラント剤においては、皮膚のバリヤー機能の維持に関与する皮膚常在菌に対して抗菌性、望ましくは殺菌性を示さないものが好ましいが、皮膚常在菌に対して抗菌性を示さないシスタチンは、斯かる点においても好ましい。尚、ここでいう殺菌性を示さないとは、実施例１に示す方法によって調製した汗に被験物質を添加したものに皮膚常在菌を接種し、３７℃、２時間反応後に、胞子形成菌(Bacillus subtilis)はコントロールに対し菌数が１／１０以下に減少せず、通常細菌(Staphylococcus epidermidis、Corynebacterium minutissimumon及びBrevibacterium epidermidis)はコントロールに対し１／１００以下に減少しないことをいう(図３参照)。
【００１１】斯かるシスタチンには、これまでに抗アレルギー作用（特開平２−２２３５２９号公報）、抗ウイルス作用（特開昭６１−２２５１３０号公報）、ウイルスの増殖抑制作用（Biochem. Biopys. Res. Commun.127,1072(1985)）、骨からのカルシウムの遊離抑制作用（特開平２−２２３５２９号公報）、破骨細胞による骨吸収抑制作用（特開平７−１２６２９４号公報）等が報告され医薬としての使用が示唆されているが、体臭の発生を阻止し、デオドラント効果を有する外用剤組成物として使用できるという報告はこれまでにない。
【００１２】天然型のシスタチンは、例えばヒト唾液よりアフィニティークロマトグラフィーやＨＰＬＣなどの既知方法に従って精製することにより取得することができ、遺伝子の組換えによって得られるシスタチンは、既知の遺伝子を組み込んだプラスミド或いはベクターを導入した大腸菌や既存細胞株の産生蛋白を同様に精製することにより得ることが可能である。
【００１３】かくして得られるシスタチンは、後記実施例１に示すように体臭の発生を抑制し、また皮膚の常在菌を殺すことがないため、これを有効成分として含有する組成物は、皮膚の一次バリアー機能を低下することなく、不快な体臭の発生を抑制することができる外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤として有用である。
【００１４】本発明の外用剤組成物及びデオドラント剤は、化粧料、外用医薬品又は医薬部外品等の製剤、例えばクリーム、乳液、ローション、パウダー、スプレー、スティック等として用いることができる。
【００１５】本発明の外用剤組成物及びデオドラント剤を化粧料、外用医薬品又は医薬部外品として用いる場合のシスタチンの含有量は、一般的に０．００１〜１０重量％とするのが好ましく、特に０．００５〜１重量％とするのが好ましい。
【００１６】本発明の外用剤組成物及びデオドラント剤には、製剤化に通常用いられる各種成分、例えば化粧料成分として一般的に使用される油分、界面活性剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料等の他、紫外線吸収剤、美白剤、しわ改善剤、保湿剤、皮脂分泌抑制剤、柔軟剤、角質保護剤、薬効剤、酸化防止剤、溶剤等の成分を任意に組み合わせ配合して、化粧料、外用医薬品、医薬部外品として製剤化することができる。
【００１７】本発明の外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤は、足、腋、頭部、陰部等不快臭の発生しやすい箇所に局所的に適用することにより、不快臭の発生を制御することができる。斯かる場合の製剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが例えば液状製剤の場合皮膚面１ｃｍ2当たり１〜２０ｍｇ、固形状の製剤の場合、同じく１〜５０ｍｇとするのが好ましい。
【００１８】
【実施例】製造例１ シスタチンＳの製造（１）パパイン阻害活性の測定方法シスタチンＳのパパイン阻害活性はＢａｒｒｅｔら（Methods in enzymologyVol.80、pp771(1981)）に準じて測定した。１０ｍＭベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド（Benzoil-L-arginine-4-nitroanilide）ジメチルスルホキシド溶液を基質とし、２ｍＭのＥＤＴＡを含む、２００ｍＭリン酸緩衝液にＤＴＴを終濃度８ｍＭとなるように添加した。パパイン１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＴＴを含まない緩衝液に溶解した。また、反応停止用溶液として５％トリクロロ酢酸溶液を使用した。測定は以下の手順で行った。測定用チューブに１ｍＬ ＤＴＴを含む緩衝液と０．０５ｍＬのパパイン溶液、試料溶液０．５ｍＬおよび全量２ｍＬとなるよう蒸留水を入れ、２５℃で５分間インキュベートした。ついで基質溶液０．０５ｍＬを加え攪拌した。２５℃で１５分反応後、１ｍＬの反応停止液を加え、沈殿が生じた場合は１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清の４０５ｎｍの吸光度を測定した。相対阻害活性は次式（１）より求めた。
【００１９】
相対阻害活性（％）＝１００−（（Ａ0−ＡI）／Ａ0×１００） （１）
Ａ0：阻害剤フリーの吸光度ＡI：サンプルの吸光度【００２０】（２）シスタチンＳの組み換え大腸菌による培養ヒト唾液由来シスタチンＳは斎藤ら（J.Biochem.116,399-405(1994)）の方法に従って製造した。即ち、ヒトシスタチンＳのｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を宿主として組換え操作を行い、組換え体を作成した。組換え大腸菌の培養はアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）添加ＬＢ培地５０ｍＬにて前培養を行った。本培養はＭ９最小培地にシュークロース（４ｇ／Ｌ）、チアミン（２ｍｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4（１ｍＭ）、ＣａＣｌ2（０．１ｍＭ）とアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた培地１６Ｌを用い３０−Ｌ容ジャーファーメンターによって、前培養液１６ｍＬを添加後、培養温度３７℃、通気量４Ｌ／ｍｉｎ、攪拌数２５０ｒｐｍの条件で行った。培養４時間後（ＯＤ６００＝０．５）にイソプロピルチオガラクトシド（終濃度０．３ｍＭ）を添加してさらに４時間培養を行い、シスタチンＳを発現した。培養後、Ｆｒｅｉｊｅら（J.Biol.Chem.268,15737-15744(1993)）の方法によって菌体処理を行いペリプラズム画分を調製した。
【００２１】（３）シスタチンＳの精製シスタチンＳの精製はＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃ（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）によるイオンクロマトグラフィーによって行った。ペリプラズム画分を１０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８）にて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）にロードする。１０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８）で溶出洗浄後、１０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８）（２５０ｍＬ）、４％ＮａＣｌ溶解１０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８）（２５０ｍＬ）で形成されるグラジエントで溶出する。組換えシスタチンＳを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。
【００２２】パパイン阻害活性を有するフラクションを凍結乾燥後、再度６０ｍＬの蒸留水に溶解後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて２０ｍＬに脱塩濃縮を行った。さらに、４０ｍＬの蒸留水を添加して、同様に脱塩濃縮を２回行った。
【００２３】このようにして得られた組換えシスタチンＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示した。得られたシスタチンＳは単一のバンドを示し、分子サイズは約１５ｋＤａであることが確認された。また、プロテインアッセイ（バイオラッド社製）により牛血清アルブミンを標準として定量した結果、約１６ｍｇの組換えシスタチンＳを得た。
【００２４】実施例１ シスタチンＳによる体臭発生抑制効果の確認（１）汗の調製方法アポクリン臭を有する男性の脇の下を、蒸留水１．５ｍＬを湿らせた脱脂綿で拭き取った。１日に１回、３日間採取した。脱脂綿を絞り、回収した液(５７．５ｍＬ)を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥのセントリプレップ ＹＭ−１０で濃縮をし、再度蒸留水を添加して同様にセントリプレップ ＹＭ−１０で濃縮し、低分子を除去した。これを、濃縮汗とした。
【００２５】（２）官能評価上記方法によって調製した濃縮汗３ｍＬに精製組換えシスタチンＳ ０．３４ｍｇを添加した液にバッファー（ｐＨ７．２、２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー）で洗浄（３回）したBrevibacterium epidermidisを最終菌体量が約１０8ｃｆｕ／ｍＬになるように接種し、３７℃、２時間インキュベートした後、菌数を測定すると共に反応液の臭い成分を抽出（エーテルで抽出後、Ｎ2で固化）し、臭いの官能評価をした。尚、比較としてシスタチンを添加しないもの及びシスタチンＳの代わりにシステインプロテアーゼであるＥ−６４（シグマ社製）を添加したものについて同様に試験し評価した。また、菌数測定は、生理食塩水で希釈後、ＳＣＤＬＰ寒天培地に塗抹し、３０℃、２４時間培養し、コロニーをカウントすることにより行った。結果を図２及び図３に示す。これより、シスタチンＳを添加することにより、体臭の生成が抑制された。
【００２６】
【発明の効果】本発明の外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤は、皮膚の常在菌を殺すことなく、不快な体臭の発生を持続的に抑制できることから、優れた消臭効果と高い安全性を有する。
【出願人】 【識別番号】００００００９１８
【氏名又は名称】花王株式会社
【出願日】 平成１３年４月９日（２００１．４．９）
【代理人】 【識別番号】１０００６８７００
【弁理士】
【氏名又は名称】有賀 三幸 （外６名）
【公開番号】 特開２００２−３０８７４９（Ｐ２００２−３０８７４９Ａ）
【公開日】 平成１４年１０月２３日（２００２．１０．２３）
【出願番号】 特願２００１−１１０１８６（Ｐ２００１−１１０１８６）