| 【発明の名称】 |
ＩＬ−６誘導性細胞死の抑制剤およびＩＬ−６誘導性細胞死の抑制方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】橋本 修一
【氏名】小西 克利
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| 【要約】 |
【課題】炎症、慢性関節リウマチを治療・改善し得るIL-6誘導性細胞死抑制剤の提供、ならびにin vitroにおいてかかる物質を用いてIL-6誘導性細胞死を抑制する方法の提供。
【解決手段】IL-6誘導性の細胞死を抑制するペプチドを有効成分として含有するIL-6誘導性細胞死抑制剤、ならびにin vitroにおいて該ペプチドを用いる、IL-6 誘導性細胞死またはIL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、IL-6誘導性細胞死抑制剤。
【請求項２】 炎症性疾患の治療または改善のために使用する、請求項１記載のIL-6誘導性細胞死抑制剤。
【請求項３】 慢性関節リウマチの治療または改善のために使用する、請求項１記載のIL-6誘導性細胞死抑制剤。
【請求項４】 in vitroにおいて配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを用いる、IL-6 誘導性細胞死の抑制方法。
【請求項５】 in vitroにおいて配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを用いる、IL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、IL-6 が誘導する細胞死を抑制する物質の特定とその作用にもとづくIL-6誘導性細胞死抑制剤、ならびにin vitroにおいて前記物質を用いるIL-6誘導性細胞死の抑制方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、慢性関節リウマチ等の慢性炎症性疾患の病態には、サイトカインの異常産生が深く関わっていると考えられている。また、慢性炎症性疾患と深い関係のあるサイトカインとしては TNF-α、IL-1、IL-6 等が考えられており、確かにこれらのサイトカインに対する抗体、あるいは IL-1Ra、抗IL-6 レセプタ―抗体等がキャッスルマン病や慢性関節リウマチに有効であることがわかっている。
【０００３】さらに、近年、マウス抗IL-6抗体が慢性関節リウマチの治療に用いられ、一過性ではあるが効果を示すことが認められた(D. Wendingら、J. Rheumatol. 20: 259, 1993)。このことから、慢性関節リウマチの病態に、IL-6 の異常産生とそれに基づく IL-6 のシグナル伝達が深く関わっていることが示された。また、IL-6のシグナル伝達を阻害するヒト型化抗IL-6レセプター抗体が慢性関節リウマチの治療に有効であることが示され（吉崎和幸、サイトカインとケモカイン、第１５回 Woko ワークショップ講演要旨集、pp51、1999）、IL-6 が細胞に及ぼす作用が慢性関節リウマチの病態(慢性的な炎症)の原因になることも明らかになった。
【０００４】また、慢性関節リウマチの発症原因については未だ不明であるものの、その病態は、抗体産生の誘導、Ｔ細胞の活性化、急性期反応の誘導、巨核球成熟の誘導、破骨細胞の活性化、実質細胞の細胞死、等の事象と関係が深いと考えられている。そして、これらの事象はいずれも IL-6 のシグナル伝達を介して細胞に誘発される。
【０００５】こうした慢性関節リウマチの病態を改善するには、（１）サイトカインの異常産生の抑制、（２）サイトカインの細胞への結合阻止、（３）サイトカインによる細胞内シグナル伝達の阻害、によってサイトカインの作用を抑制する方法が考えられる。
【０００６】しかしながら、現在IL-6 の阻害剤として利用可能なものは、細胞外で作用する IL-6 や IL-6 レセプターの抗体のみであって、細胞内でIL-6 のシグナル伝達経路あるいはその産生物質による細胞への作用を阻害してIL-6誘導性細胞死を抑制するものは開発されてない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、IL-6 により誘導される細胞死を抑制し、それにより炎症、慢性関節リウマチを治療・改善し得るIL-6誘導性細胞死抑制剤を提供することを目的とする。また本発明は、in vitroにおいてかかる物質を用いてIL-6誘導性細胞死を抑制する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的を解決するために鋭意研究を重ねた結果、IL-6 が誘導する細胞死が、細胞膜透過性のある少なくとも二種類のオリゴペプチドにより阻害されることを見出し、さらにこれらの二つのオリゴペプチドが炎症性サイトカイン二種の組み合わせ(IL-6およびTNF-α)によって誘導される細胞死も阻害することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】すなわち、本発明は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、IL-6誘導性細胞死抑制剤である。また本発明は、in vitroにおいて配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを用いる、IL-6 誘導性細胞死またはIL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制方法である。
【００１０】
【発明実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１１】配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドは、細胞内におけるIL-6のシグナル伝達経路あるいはその産生物質による細胞への作用を阻害することにより、IL-6誘導性の細胞死を抑制する。慢性関節リウマチを含む慢性炎症性疾患の病態はサイトカインの異常産生が深く関わっていることから、前記効果を有するペプチドを有効成分として含有する本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤は、炎症性疾患または慢性関節リウマチを治療または改善する際に有用であると考えられる。
【００１２】配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列の一方のみを含むものであっても、これらのアミノ酸配列両方を含むものであってもよい。また前記ペプチドは、上記IL-6誘導性細胞死の抑制効果を有する限り、アミノ末端のアセチル化、グアニジル化、アミジン化、還元アルキル化、カルバモイル化、トリフルオロアセチル化、アシル化、トリニトロフェニル化、カルボキシ末端のアルデヒド化、N-アシル尿素化等の修飾が為された形態であってもよい。
【００１３】さらに、前記ペプチドは、アミノ酸１０個程度からなるオリゴペプチドであってもよく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドとしてはカスペース-3の阻害剤として知られるAc-DMQD-CHO (A. Takahashiら、Oncogene, 14 2741 (1997))、配列番号２のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドとしてはカスペース-3、-1、-7の阻害剤として知られるAc-DEVD-CHO (D.N. Nicholsonら、Nature 376, 37 (1995))を挙げることができる。尚、これらの２種のオリゴペプチドは、後述の本実施例に記載するように、アポトーシスの様相を示さないIL-6誘導性細胞死を抑制する。
【００１４】本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤における上記ペプチドの含有量は、これらの薬剤を投与した対象において、細胞内でIL-6のシグナル伝達経路を阻害するかまたはその産生物質による細胞への作用を阻害することのできる量であれば特に限定されないが、単独投与の場合、例えば、局所における濃度が50〜500μM、好ましくは100〜500μM、より好ましくは100〜250μMになる量とすることができる。
【００１５】また、本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤は、上記ペプチドの他に、例えば、安定剤、緩衝剤、希釈剤、等張剤、防腐剤などの賦形剤を適宜混合してもよいが、これらに限定されるものではなく、その含有量も目的に応じて適宜変更することができる。
【００１６】本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤を投与する対象としては、炎症性疾患（例えば炎症性腸疾患、自己免疫病、腎炎[Bright's disease]、慢性関節炎など）、慢性関節リウマチ、キャッスルマン病等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、その投与形態としては、例えば静脈注射、皮下注射、筋肉注射などの注射による投与、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、座剤による経腸投与、あるいは軟骨剤、クリーム剤、貼付剤等による局所投与等を挙げることができる。その使用量は症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択されるが、成人に対して、注射による投与の場合は有効成分量として１日当たり0.1 mg/kg〜5 mg/kg、好ましくは0.3 mg/kg〜0.5 mg/kg、経口投与の場合は1 mg/kg〜50 mg/kg、好ましくは3 mg/kg〜5 mg/kg、局所投与の場合は数十μg〜数mgとすることができ、さらにそれぞれ一回または数回に分けて投与することができる。例えば点滴で数十μg／mLの濃度で１日当たり1 mg〜100 mg、好ましくは20 mg〜30 mgを静脈内に投与したり、マイクロカプセルに封入した上記ペプチド(数mg〜数百mg)を皮下ないしは筋肉に投与することができるが、これらに限定されない。
【００１７】また、本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤は、抗IL-6抗体、抗IL-6レセプター抗体、非ステロイド系抗炎症剤(アスピリン等)、糖質ステロイド薬(酢酸コルチゾン等)、金剤等と併用することもできる。本発明のin vitroにおけるIL-6 誘導性細胞死またはIL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制方法は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを用いることを特徴とする。
【００１８】上記本発明のIL-6 誘導性細胞死またはIL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制方法は、IL-6またはIL-6およびTNF-αを添加した標的細胞に、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを添加することにより実施する。標的とする細胞は、上記ペプチドに対し透過性を示す細胞であれば特に限定されないが、例えば、炎症時に破壊される組織の実質細胞、軟骨、骨の細胞等を挙げることができる。
【００１９】配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドは、上記本発明のIL-6誘導性細胞死抑制剤の説明箇所において記載したペプチドと同じ意味を有するものとする。また、前記ペプチドを前記標的細胞に添加する際には、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド(例えば、オリゴペプチド[Ac-DMQD-CHO])および配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド(例えば、オリゴペプチド[Ac-DEVD-CHO])をそれぞれ単独で用いることもできるし、これらを組み合わせて用いることもできる。また、配列番号１および２の両方のアミノ酸配列を含む単一のペプチドを用いることもできる。
【００２０】配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドの前記標的細胞への添加量は、限定するものではないが、50〜500μM、好ましくは100〜500μM、より好ましくは100〜250μMとすることができる。あるいはまた、標的細胞に添加したIL-6またはIL-6およびTNF-αの量に対して、10,000〜100,000倍(重量比)、好ましくは20,000〜100,000倍(重量比)、より好ましくは20,000〜50,000倍(重量比)とすることができる。
【００２１】配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドによるIL-6 誘導性細胞死またはIL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制レベルは、前記ペプチドを添加し、適切な期間(例えば、88時間)インキュベートした後に、生細胞を適切な手法(例えば、クリスタルバイオレット染色法(Sugarman,B.J.ら、Science 230:943(1985))により測定することで決定することができる。
【００２２】具体的には、精製した KB 細胞由来ヒト IL-6(2ng／mL培地)を添加して15時間インキュベートしたヒト乳がん由来 SK-BR3 細胞(3×104細胞／0.1mL培地／ウェル)に、オリゴペプチド[Ac-DMQD-CHO]を添加することにより、IL-6誘導性細胞死が濃度依存的に抑制される(オリゴペプチド62.5μMで19％の抑制、125μMで26％の抑制、250μMで38％の抑制、500μMで40％の抑制がみられる)。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明する。〔実施例１〕IL-6誘導性細胞死抑制物質の特定IL-6、TNF-αをはじめとする炎症性サイトカインが炎症、慢性関節リウマチを誘発することは間違いないが、その機構についてはまだ解明されていない。一方、これらの炎症性サイトカインは細胞毒性を示す(すなわち、細胞死を誘導する)性質がある。
【００２４】従って、それらのサイトカインが誘導する事象(細胞死およびそれに伴う組織破壊)は炎症、慢性関節リウマチの病態と関係があると考えられ、かかる事象を抑制する物質を特定できれば、該物質は炎症・慢性関節リウマチの治療・改善に有用であると考えられる。そこで本発明者らは、サイトカインによる細胞死を抑制し得る物質を特定するため、以下の試験を行った。
【００２５】（サイトカイン誘導による細胞死の定量アッセイ）まず、IL-6 誘導による細胞死を定量できるシステムを作成した。IL-6のターゲット細胞としてヒト乳がん由来 SK-BR3 細胞(ATCC[American Type Culture Collection]、カタログ番号HTB-30）を選択した。該細胞を3×104細胞/0.1 mL/ウェルの濃度で96穴プレートに播種し、15 時間 CO2 インキュベーターで培養した。培養培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco'smodified Eagle's medium: DMEM）に10％ウシ胎児血清を加えたものを用いた。
【００２６】次に、サイトカインIL-6 として精製した KB 細胞由来ヒト IL-6(平成12年特許出願公開第184897号に記載)を、TNF-αとしてはヒトリコンビナントのもの(Rand D Systems社、カタログ番号210-TA)を使用し、これらを上記SK-BR3培養細胞に単独でまたは組合せて(IL-6単独、IL-6 + TNF-α、TNF-α単独または培地のみ（対照）)添加した。サイトカインは上記のDMEM-10％ウシ胎児血清培地に溶かし添加した。各添加濃度およびその後のインキュベート時間は次の通りである；
IL-6単独：IL-6を最終濃度で2.0ng／mL培地となるように添加した後、37℃で96時間インキュベーターで培養。
【００２７】IL-6 + TNF-α：IL-6を最終濃度で 2ng/mL培地となるように添加して７時間 CO2 インキュベーターで培養した後、TNF-αを最終濃度 2.5ng/mL培地となるように添加し、８９時間 CO2 インキュベーターで培養。
TNF-α単独：TNF-αを最終濃度で2.5ng／mL培地となるように添加した後、37℃で89時間インキュベーターで培養。
培地のみ(対照)：IL-6およびTNF-αは添加せず(各0ng／mL培地)、培地のみを添加し、37℃で96時間インキュベーターで培養。
【００２８】更に、（株）ペプチド研究所より入手した各種合成オリゴペプチド(予め DMSO中 40mM で溶解、−20℃で保存)を、上記のサイトカイン添加培地(DMEM-10％ウシ胎児血清培地)に最終濃度が0、62.5、125、250または500 μM となるように添加し、CO2 インキュベーター中37℃で 88 時間培養した。培養後、クリスタルバイオレット染色で生細胞を測定し（Lee, S.H.ら、J. Immunol. 133, 1083 (1984)）、これらのオリゴペプチドによる細胞死の抑制の度合いを調べた。尚、どのウェルも最終容量は 200μL/ウェルとした。
【００２９】（結果）使用したオリゴペプチドのうち、Ac-Asp-Met-Gln-Asp-H(アルデヒド)[Ac-DMQD-CHO]およびAc-Asp-Glu-Val-H(アルデヒド) [Ac-DEVD-CHO]が、IL-6または〔IL-6 + TNF-α〕により誘導される細胞死を濃度依存的に抑制することが示された。オリゴペプチド[Ac-DMQD-CHO]についての結果を図１に、[Ac-DEVD-CHO]についての結果を図２に示す。
【００３０】前記オリゴペプチド[Ac-DMQD-CHO]はカスペース-3の阻害剤として知られており（A. Takahashiら、Oncogene, 14 2741 (1997)）、またオリゴペプチド[Ac-DEVD-CHO]はカスペース-3、-1、-7の阻害剤として知られている（D.N. Nicholsonら、Nature 376, 37 (1995)）。このことから、IL-6 は少なくともカスペース-3の活性化を誘導し、それにより細胞死をもたらしているものと考えられる。従って、カスペース-3の上流あるいは下流に位置するカスペースの阻害剤もIL-6誘導性細胞死の抑制作用を有する可能性があり、こうした物質もまたIL-6誘導性細胞死の阻害剤として有用である。
【００３１】尚、AffordらによりIL-6がアポトーシスを誘導することが報告されているが(S.C.Affordら、J.Biol.Chem.vol.267,pp.21612-21616(1992))、本実施例において観察されたIL-6誘導性細胞死は、アポトーシスの様相(細胞の断片化[apoptoticbodyの形成]および染色体ＤＮＡの断片化[fragmentation])を示さなかった。このことは本実施例において初めて得られた知見である。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有するIL-6誘導性細胞死抑制剤が提供される。また本発明により、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むペプチドを用いるin vitroでのIL-6誘導性またはIL-6およびTNF-α誘導性細胞死の抑制方法が提供される。
【００３３】
【配列表】SEQUENCE LISTING<110> Toray Industries, Inc.<120> Drugs capable of inhibiting IL-6-induced-cell death and a method for preventing of IL-6-induced -cell death.<130> P00-0468<160> 2<170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 4<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Amino acid sequence contained in the synthesized oligopeptide capable of inhibiting cytokine-induced-cell death.<400> 1Asp Met Gln Asp1<210> 2<211> 4<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Amino acid sequence contained in the synthesized oligopeptide capable of inhibiting cytokine-induced cell death.<400> 2Asp Glu Val Asp1【００３４】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：サイトカイン誘導性細胞死を抑制することのできる合成オリゴペプチドに含まれるアミノ酸配列。
配列番号２：サイトカイン誘導性細胞死を抑制することのできる合成オリゴペプチドに含まれるアミノ酸配列。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００００３１５９
【氏名又は名称】東レ株式会社
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| 【出願日】 |
平成１３年２月２１日（２００１．２．２１） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００９１０９６
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外１名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２４９４３９（Ｐ２００２−２４９４３９Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年９月６日（２００２．９．６） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−４５０９０（Ｐ２００１−４５０９０） |
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