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【発明の名称】 魚類の免疫増強剤及び養魚用飼料
【発明者】 【氏名】小川 治雄

【氏名】把田 雅彦

【氏名】真許 勝弘

【氏名】酒井 正博
【要約】 【課題】養魚類の免疫作用を高め魚病の発生を抑制することができる、魚類用免疫増強剤、並びに該魚類免疫増強剤を含有する養魚用飼料を提供すること。

【解決手段】５’−ヌクレオチドを有効成分として含有する免疫増強剤、並びに免疫増強効果を有する養魚用飼料。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ５’−ヌクレオチドを有効成分とする魚類の免疫増強剤。
【請求項２】 請求項１記載の免疫増強剤を含む養魚用飼料。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は５’−ヌクレオチドを有効成分とする魚類の免疫増強剤、免疫増強剤である５’−ヌクレオチドを有効成分として含む免疫増強効果を有する養魚用飼料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年の養殖業においては、経営の効率化を目的に、養殖魚の過密飼育化がますます高まる傾向にある。こういう飼育状況ではいったん病気が発生してしまうと短期間にいけす全体に感染してしまい、すべての魚を失ってしまうといった事例も数多く報告されている。このため、魚病発生の防止は養殖魚経営に直接結びつく重要な課題である。
【０００３】そこで、魚病の発生防止・発症後の対応策として、ワクチンや抗生物質といった薬剤を使用するという方法が用いられている。しかしながら、ワクチンはある特定の魚病に対する効果しか得られないこと、抗生物質においては耐性菌の出現や周辺環境の汚染といったことが問題である。
【０００４】この様な問題の解決を目的として、養殖魚の免疫作用（病気に対する抵抗力）を高めて魚病を予防する各種の免疫増強剤が数多く市販され、実際の養殖現場で用いられている。
【０００５】例えばスエヒロタケ培養物（特開平７−１７０９１９）、哺乳動物乳汁中に含まれるラクトフェリン（特開平０７−４８２７４）、菌体の細胞壁成分であるペプチドグリカン（特開平１１−２５５６６４）などが知られている。しかしながら、前記の免疫増強剤では効果が十分でなかったり、経済的な負担が大きくなったりするため、充分に課題を解決しているとはいえない状況である。
【０００６】一方、新たな免疫増強物質として、核酸（デオキシリボ核酸、リボ核酸）並びに核酸関連物質が注目されてきている。例えば、人の栄養補助食品に利用する方法（特開昭６１−１９５６５１）や、新生児及び未熟児用調製乳に核酸関連物質を含有させる方法（特開平１０−３２７８０４）が開示されている。又、下痢の抑制を目的として、５’−ヌクレオチド類を家畜飼料に混和する方法（特公昭４３−１４３８８）も開示されている。
【０００７】しかしながら、これら核酸並びに核酸分解物の免疫増強剤としての利用は人を含めた哺乳動物に限定されている。核酸並びに核酸分解物を魚類の免疫増強剤として用いることは皆無である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は魚類において充分な効果を発揮し、安価な免疫増強剤を提供することを課題とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、哺乳動物に効果が限定されていた核酸並びに核酸関連物質の中で５’−ヌクレオチドに魚類の免疫を増強させる効果を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、５’−ヌクレオチドを投与することで魚類の免疫作用を増強することができる。
【００１０】又、該魚類用免疫増強剤は、経口投与で充分な効果を発揮するため、本発明は、該魚類用免疫増強剤を含有する養魚用飼料を提供することも可能である。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１２】本発明で使用する５’−ヌクレオチドとは、糖、プリン又はピリミジン塩基、エステル結合リン酸基から構成され、リン酸が５’位に結合しているものである。構成糖はリボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドは、５’−チミジル酸、５’−ウリジル酸、５’−アデニル酸、５’−グアニル酸、５’−シチジル酸、５’−イノシン酸といった物質を包括する呼称であるが、本発明でいう５’−ヌクレオチドとはこれら各種ヌクレオチドの任意な割合の混合物である。
【００１３】本発明における免疫増強剤は、その他の免疫増強剤や抗生物質との配合、或いは製造助剤と混合した形でも構わないが、５’−ヌクレオチドの免疫増強効果を発揮させるためには５’−ヌクレオチドを１０重量％以上含むことが望ましい。
【００１４】本発明における免疫増強剤は、他の免疫増強剤又は抗生物質と併用することも可能であり、これにより、他の免疫増強剤又は抗生物質の効果を増強したり、他の免疫増強剤又は抗生物質の使用量を削減することも期待できる。
【００１５】本発明で使用する５’−ヌクレオチドは、市販のリボ核酸を５’−ホスホジエステラーゼにより加水分解する事で容易に得ることができる。リボ核酸は、食用、飼料用として用いられている酵母、細菌等から抽出・精製することにより得ることができるが、そのいずれのリボ核酸でも用いることができるため、起源には限定されない。
【００１６】又、加水分解法のみならず、細菌を使った直接発酵法によっても得ることができ製造法には限定されない。
【００１７】又、構成糖が違うデオキシリボ核酸においても、デオキシリボ核酸の分解活性を持つ５’−ホスホジエステラーゼによる加水分解により市販のデオキシリボ核酸から容易に５’−ヌクレオチドを得ることができる。デオキシリボ核酸は、サケ・マス等の白子より抽出・精製することにより工業的に得ることができるが、デオキシリボ核酸であればいずれの起源のものでも本発明品の原料となり得るため、起源を魚類の白子に限定するものではない。
【００１８】本発明における５’−ヌクレオチドを有効成分として含む免疫増強効果を有する養魚用飼料は、市販の配合飼料に５’−ヌクレオチドを配合することにより得られる。添加率としては、０．０１から１０重量％が好ましい。５’−ヌクレオチドの添加率が０．０１重量％未満では、免疫増強効果が認められず、１０重量％を越えると添加効果が飽和すると共に、養魚用飼料としての栄養的価値が損なわれてしまう。
【００１９】本発明の対象となる養魚としては、コイ、アユ、ニジマス、ウナギ、ハマチ、タイ、ヒラメ等があげられる。これら養魚に対して、稚魚の段階から生魚にわたるまで、本発明品は免疫増強効果を発揮する。
【００２０】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する。
【００２１】［製造例１ ５’−ヌクレオチドの調製］市販のＲＮＡの５重量％溶液を調整後、リボヌクレアーゼ（天野製薬社製）をＲＮＡに対して１重量％を添加しｐＨ５、７０℃にて１０時間反応後、噴霧乾燥して５’−ヌクレオチドを得た。得られた５’−ヌクレオチドの各種ヌクレオチド組成をＨＰＬＣを用いた分析により求めた。分析結果を表１に示す。尚、本品の５’−ヌクレオチド純度は８８．０％であった。
【００２２】
【表１】（表１）

【００２３】［製造例２ ５’−ヌクレオチドの調製］市販のＤＮＡの５重量％溶液を調整後、リボヌクレアーゼ（天野製薬社製）をＤＮＡに対して１重量％を添加しｐＨ５、７０℃にて１０時間反応後、噴霧乾燥して５’−ヌクレオチドを得た。得られた５’−ヌクレオチドの各種ヌクレオチド組成をＨＰＬＣを用いた分析により求めた。分析結果を表２に示す。尚、本品の５’−ヌクレオチド純度は９１．０％であった。
【００２４】
【表２】（表２）

【００２５】［実施例１］
（食細胞の貪食能の測定）民間の養魚場から購入した、コイ（平均体重１５０ｇ）各５尾を用い、製造例１の方法で調整した５’−ヌクレオチドを生理食塩水に溶解しゾンデを用いて強制的に経口投与させた。投与量は０．０７５ｍｇ、０．７５ｍｇ、７．５ｍｇ（それぞれ１尾当たりの投与量）とした。尚、対照区には同量の生理食塩水のみを投与した。１日後にコイの腎臓から白血球を分離、一定数に調製した後、ラテックスビーズ懸濁液と混合し２時間反応させた後、ラテックスビーズを取り込んだ白血球の数をカウントした。その結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】（表３）

【００２７】５’−ヌクレオチドを投与した区全てに、対照区との有意差が認められた。従って、５’−ヌクレオチドにコイ白血球の貪食能を上昇させる効果が認められた。
【００２８】［実施例２］
（食細胞の殺菌作用の測定）民間の養魚場から購入した、コイ（平均体重１５０ｇ）各５尾を用い、製造例１の方法で調整した５’−ヌクレオチドを生理食塩水に溶解しゾンデを用いて強制的に経口投与させた。投与量は０．０７５ｍｇ、０．７５ｍｇ、７．５ｍｇ（それぞれ１尾当たりの投与量）とした。尚、対照区には同量の生理食塩水のみを投与した。１日後にコイの腎臓から白血球を分離し９６穴のマイクロプレートに付着させ、ＰＭＡを加えて刺激し、貪食細胞内で殺菌作用に関与する過酸化水素発生をＮＢＴ試薬の色変化（６２０ｎｍの吸光度）で測定した。その結果を、表４に示す。
【００２９】
【表４】（表４）

【００３０】５’−ヌクレオチド７．５ｍｇ／尾を投与した区に、対照区との有意差が認められた。従って、５’−ヌクレオチドにコイ白血球の殺菌作用を上昇させる効果が認められた。
【００３１】［実施例３］
（リゾチーム活性の測定）民間の養魚場から購入した、コイ（平均体重１５０ｇ）各５尾を用い、製造例２の方法で調整した５’−ヌクレオチドを生理食塩水に溶解しゾンデを用いて強制的に経口投与させた。投与量は７．５ｍｇ（１尾当たりの投与量）とした。尚、対照区には同量の生理食塩水のみを投与した。１日後に血清を採取し、Micrococcus lysodeikticusの加熱死菌体懸濁液を混合し、４５℃で３０分間反応させ、供試液の濁度減少を測定し血清のリゾチーム活性を測定した。減少した濁度０．０１当たりを１ｕｎｉｔとした。その結果を表５に示す。
【００３２】
【表５】（表５）

【００３３】５’−ヌクレオチドを投与した区に、対照区との有意差が認められた。従って、５’−ヌクレオチドにコイ血清中のリゾチーム活性を上昇させる効果が認められた。
【００３４】［実施例４］
（補体活性の測定）民間の養魚場から購入した、コイ（平均体重１５０ｇ）各５尾を用い、製造例２の方法で調整した５’−ヌクレオチドを生理食塩水に溶解しゾンデを用いて強制的に経口投与させた。投与量は７．５ｍｇ（１尾当たりの投与量）とした。尚、対照区には同量の生理食塩水のみを投与した。１日後に血清を採取し、補体活性を次のようにして測定した。１０mMのＭｇＣｌ2と１０mMＥＧＴＡ（ethyleneglycol-bis tetraacetic acid）を含む０．１％ゼラチン−ベロナール緩衝液で段階的に希釈した血清に、ウサギ赤血球を混合し４５℃で３０分間反応させ、それぞれの系での溶血程度を吸光度計で測定した。この時のウサギ赤血球の５０％溶血させる血清の希釈倍数を補体価（ＡＣＨ５０）とした。その結果を表６に示す。
【００３５】
【表６】（表６）

【００３６】５’−ヌクレオチドを投与した区に、対照区との有意差が認められた。従って、５’−ヌクレオチドにコイ血清中の補体活性を上昇させる効果が認められた。
【００３７】［実施例５］
（魚病細菌の感染試験）民間の養魚場から購入した、コイ（平均体重１５０ｇ）を各区１２尾用い、生理食塩水に溶解した５’−ヌクレオチドをゾンデを用いて強制的に経口投与させた。投与量は７．５ｍｇ（１尾当たりの投与量）とした。尚、対照区には同量の生理食塩水のみを投与した。１日後に魚病細菌であるAeromonas hydrophiaを１尾あたり３×１０7CFU接種し、血液・腎臓・肝臓中の菌数の変化を感染後２、４、８、１２時間目に各区３尾の血液・腎臓・肝臓を採取・混合して菌数をカウントすることで測定した。その結果を表７〜９に示す。
【００３８】
【表７】（表７）

【００３９】
【表８】（表８）

【００４０】
【表９】（表９）

【００４１】魚病細菌を接種したコイの１２時間後の血液・腎臓・肝臓中の菌数はいずれも、５’−ヌクレオチドを投与した区で、対照区と比較して低下した。従って、５’−ヌクレオチドに、コイにおける魚病細菌の除去作用を上昇させる効果が認められた。
【００４２】［実施例６］
（５’−ヌクレオチドを配合した養魚用飼料の調製）表１０に示す養魚用飼料に製造例１の５’−ヌクレオチド及び製造例２の５’−ヌクレオチドを０．５重量％の割合で配合し、養魚用飼料Ａ、Ｂを調製した。
【００４３】
【表１０】（表１０）

【００４４】［実施例７］
（５’−ヌクレオチドを配合した養魚用飼料を与えたコイの食細胞活性）実施例６の養魚用飼料Ａ、Ｂを５日間、コイに与えた後（各区１０尾）、実施例１の方法によりコイの食細胞活性を測定した。尚、対照は、表１０に示した養魚用飼料を与えた。結果を表１１に示す。
【００４５】
【表１１】（表１１）

【００４６】５’−ヌクレオチドを添加した養魚用飼料Ａ、Ｂを与えた区は対照区との有意差が認められた。従って、５’−ヌクレオチドを添加した養魚用飼料にコイ白血球の貪食能を上昇させる効果が認められた。
【００４７】［実施例８］
（５’−ヌクレオチドを配合した養魚用飼料を与えたコイのリゾチーム活性）実施例６の養魚用飼料Ａ、Ｂを５日間、コイに与えた後（各区１０尾）、実施例３の方法によりコイのリゾチーム活性を測定した。尚、対照は、表１０に示した養魚用飼料を与えた。結果を表１２に示す。
【００４８】
【表１２】（表１２）

【００４９】５’−ヌクレオチドを添加した養魚用飼料Ａ、Ｂを与えた区は対照区との有意差が認められた。従って、５’−ヌクレオチドを添加した養魚用飼料にコイのリゾチーム活性を上昇させる効果が認められた。
【００５０】
【発明の効果】本発明により提供される５’−ヌクレオチドを有効成分とする魚類免疫増強剤、並びに５’−ヌクレオチドを有効成分として含む免疫増強効果を有する養魚用飼料は、養魚類の免疫作用を高め、効果的に魚病発生を抑制することができ、極めて有用である。
【出願人】 【識別番号】０００１８３４８４
【氏名又は名称】日本製紙株式会社
【出願日】 平成１３年３月１３日（２００１．３．１３）
【代理人】 【識別番号】１０００７４５７２
【弁理士】
【氏名又は名称】河澄 和夫
【公開番号】 特開２００２−１７３４２９（Ｐ２００２−１７３４２９Ａ）
【公開日】 平成１４年６月２１日（２００２．６．２１）
【出願番号】 特願２００１−７０００４（Ｐ２００１−７０００４）