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【発明の名称】 ヒトのオキサリル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ
【発明者】 【氏名】ヘンリック・オルセン
【氏名】ティモシー・エイ・コールマン
【氏名】マーク・ディ・アダムス
【課題】ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)を提供する。

【解決手段】ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造するための方法、およびそのようなポリペプチドに対する抗体を製造するための方法を開示する。尿結石形成およびシュウ酸過剰尿症の治療のために治療上有効な量のポリペプチドを提供するための、本発明のポリペプチドと適当な薬学的担体との組合わせもまた開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼが必要である患者を治療するための方法であって、治療上有効な量の、（ｉ）第１〜６図の推定アミノ酸配列（配列番号２）を有するオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７１５号のcＤＮＡによりコードされるオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチド、並びに該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択されるポリペプチドを患者に投与することからなる方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼである。
【０００２】尿中でのカルシウム−オキサレート結石の形成がカルシウムとオキサレートの両方の飽和レベルに依存することを、証拠は示唆することから、尿路での結石形成(尿結石形成)を起こしやすい個体では、これらのイオンの一方または両方の管理が重要であるらしい。尿結石形成は、米国人の１０％以上を冒している一般的な尿路問題である(Ｓierakowski,Ｒ.ら、Ｉnvest.Ｕrol.、１５：４３８−４４１（１９７８）)。尿路結石は、通常、それらの組成により分類されるが、シュウ酸カルシウム単独またはリン酸カルシウムが混ざったシュウ酸カルシウムからなるカルシウム結石が最も多く現れる(７０％)。シュウ酸カルシウムの沈降は、準安定状態でのカルシウムとオキサレートの両方のイオンで飽和される尿に依存するが、オキサレートイオン濃度が尿シュウ酸カルシウム結石の形成により重要であることが議論されている。
【０００３】血漿および尿中のオキサレートの大部分は、アスコルビン酸、グリオキシレートの、またより少ない程度でトリプトファンの内因性代謝に由来する(Ｎath,Ｒ.ら、Ｐergamon Ｐress、５５−５８頁（１９８４）)。さらに、尿オキサレートの１０％〜２０％は、特に、葉の多い野菜および植物の摂取によって、食物から吸収される。幸いにも、大抵の食物オキサレートは、管腔内カルシウムにより結合されるらしく、また不溶性塩として排泄される。従って、摂取されるカルシウムと吸収されるオキサレートとの間には、逆の関係がある。(Ｅrnest,Ｄ.Ｌ.ら、Ｇastroenterology、６６：１１１４−１１２２（１９６４）)。
【０００４】オキサレートの異常合成または過剰吸収のいずれかが、シュウ酸過剰尿症と呼ばれる重篤な病態をもたらし得る(Ｌiedtke,Ｒ.Ｒ.ら、Ｕrol.Ｒes.、１６：１８８−１８９（１９８８）)。この病態は遺伝学的根拠を有し得るが、事例の非常に大部分は依然として特発性のままである(Ｎath,Ｒ.ら、Ｐergamon Ｐress、５５−５８頁（１９８４）)。基礎となる原因がカルシウム代謝の妨害であろうと、または単なるオキサレートレベルの増加であろうとも、ヒトにおける尿オキサレートレベルの増加とシュウ酸カルシウム結石疾患との間には、強い関連がある。
【０００５】尿路での結石形成の根拠およびこの障害を治療するための方法は、近年、集中的な研究課題となっている。血漿および尿オキサレート濃度を低下させる方法として、植物から得られたオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子がヒトの細胞に挿入されている。オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子は、細菌Ｏxalobacter formigenesからクローン化されている。Ｌung,Ｈ.Ｙ.ら、Ａm.Ｊ.Ｋidney Ｄis.、１７：３８１−５（１９９１）。
【０００６】従って、血漿、また続いて尿中のオキサレートレベルを低下させる酵素は、シュウ酸カルシウム結石形成の発生率を減少させるであろう。
【０００７】本発明の一態様により、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼである新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドである。
【０００８】本発明の別の態様により、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を提供する。
【０００９】本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造するための方法を提供する。
【００１０】本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを治療目的、例えば、カルシウム−オキサレート結石形成およびシュウ酸過剰尿症を予防するのに利用するための方法を提供する。
【００１１】本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。
【００１２】本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。
【００１３】以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００１４】第１〜６図は、成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な３文字略号を使用する。
【００１５】第７及び８図は、細菌 Ｏxalobacter formigenes由来のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ(上の列)と本発明のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド(下の列)との間のアミノ酸配列の比較である。
【００１６】第９図は、インビトロにおいて転写／翻訳した後、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをゲル上で電気泳動した結果を示す。レーン１は、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードするプラスミドテンプレートである。レーン２は、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードする、ＰＣＲから生じたテンプレートであって、Ｍは、分子量マーカーを表す。
【００１７】本発明の一態様により、第１〜６図の推定アミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年３月１８日にＡＴＣＣ寄託番号第７５７１５号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。
【００１８】本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの膵臓から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。それは、５７８アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードする開放読み枠(オープンリーディングフレーム)を含む。本発明のタンパク質は、細菌Ｏxalobacter formigenes由来のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼに対し、アミノ酸レベルで約５０−６０％相同である。相同性は、細菌酵素のアミノ酸【００１９】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１〜６図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１〜６図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。
【００２０】第１〜６図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロプロテイン配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。
【００２１】従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。
【００２２】本発明はさらに、第１〜６図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。
【００２３】従って、本発明には、第１〜６図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１〜６図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体および付加並びに挿入変異体が含まれる【００２４】先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１〜６図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。
【００２５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細胞宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。
【００２６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１〜６図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。
【００２７】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。
【００２８】本発明はさらに、第１〜６図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
【００２９】第１〜６図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。
【００３０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。
【００３１】第１〜６図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
【００３２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。
【００３３】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。
【００３４】宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。
【００３５】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
【００３６】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。
【００３７】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。
【００３８】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。
【００３９】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
【００４０】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
【００４１】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。
【００４２】さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecular Ｂiology（１９８６）)。
【００４３】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
【００４４】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。
【００４５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【００４６】通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子並びにＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。
【００４７】細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、並びにＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。
【００４８】代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。
【００４９】適当な宿主株をトランスフオーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
【００５０】細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。
【００５１】タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。
【００５２】組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。【００５３】オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。【００５４】本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。
【００５５】本発明のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチドを使用して、オキサレートイオンの血漿および尿レベルを減少させることにより、尿結石形成を予防することができる。
【００５６】本発明のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチドを使用して、シュウ酸過剰尿症をまた治療または予防することもできる。シュウ酸過剰尿症は、オキサレートの異常合成または過剰吸収のいずれかにより特徴付けられ、これは、オキサレートイオンの分解により予防することができ、またこれが、この障害の予防となり得る。
【００５７】本発明のポリペプチドは、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定するのに有用である。スクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。
【００５８】本発明は、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼの、その基質に対する相互作用を高める薬物(アゴニスト)を同定するために、薬物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼの、その基質に対する親和性を増加させる。例として、オキサレートイオンを薬物の存在下に標識化オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼとインキュベートする。次いで、薬物がこの相互作用を高める能力を、当業界で既知の方法により測定することができるであろう。
【００５９】オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチドはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。
【００６０】従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。
【００６１】同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。
【００６２】本発明のポリペプチドは、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。
【００６３】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と共に使用することができる。
【００６４】該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼは、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。
【００６５】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。
【００６６】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡのコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。
【００６７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。
【００６８】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。
【００６９】ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。
【００７０】次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。
【００７１】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。
【００７２】冒された個体と冒されていない個体との比較は、通例、染色体スプレッドから見ることができるか、またはそのcＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを利用して検出することができる、欠失またはトランスロケーションといったような、染色体における構造変化を先ず探す。最後には、変異の存在を確認するために、また変異を多型性から区別するために、幾つかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定が必要とされる。
【００７３】ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。
【００７４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。
【００７５】モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。
【００７６】単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。
【００７７】本発明はまた、シュウ酸過剰尿症に対する感受性を検出するための診断アッセイにも関する。そのようなアッセイは、血液または血清試料、尿等といったような試料中のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼレベルを検出することにより達成することができる。オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼレベルは、例えば、当業界で既知の方法によるイムノアッセイ技術により検出することができる。そのようなアッセイの例は、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ抗原に、特異的な２つの抗体、好ましくは、それらの抗体の１つが、例えば、指示酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのような、適当な標識を結合させることにより標識されているモノクローナル抗体を利用するサンドイッチアッセイである。未標識化抗体は、固形担体上にあるのが好ましい。抗原が存在するなら、抗原は両方の抗体に結合するであろう。ペルオキシダーゼが結合した抗体を抗原に結合させた後、そのペルオキシダーゼを利用して、測定可能である着色生成物を生成させることができ、またその濃度は、試料中の抗原の量と関係がある。酵素の触媒的性質のため、その系はシグナルを大きく増幅する。低レベルのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼは、シュウ酸過剰尿症に対する感受性を表す。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載するが、しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。
【００７８】以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。
【００７９】「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。【００８０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。
【００８１】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
【００８２】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。
【００８３】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。
【実施例】
【００８４】実施例 １オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼの細菌発現および精製最初に、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５７１５号を、処理したオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼタンパク質の５'および３'配列(シグナルペプチド配列なし)に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅し、Ｎco ＩおよびＢgl IIに対応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に加えた。ＰＣＲフラグメントの生成に使用したプライマーは、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードする配列中の制限部位の他に、ＯmpＡリーダー配列をコードするであろう。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
を有し、ＢspＨ Ｉ制限酵素部位、続いて、２１ヌクレオチドの、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子を含む；３'配列は、
であり、Ｂgl II制限酵素部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、および少なくとも２０ヌクレオチドの、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードする配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−６０(Ｑiagen,Ｉnc. ９２５９ Ｅton Ａve.、Ｃhatsworth、ＣＡ ９１３１１)上の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pＱＥ−６０をＮco ＩおよびＢgl IIで消化した。増幅された配列をpＱＥ−６０にライゲートして、ヒスチジンタグをコードする配列およびＲＢＳと共に枠内に挿入した。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｑiagenから商標Ｍ１５／rep４で入手可能なＥ.coli.株 Ｍ１５／rep４をトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋanｒ)も与える。トランスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.６００)まで増殖した。次いで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド)を、最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離(６０００Ｘｇで２０分)により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼを精製した。(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｇenetic Ｅngineering、Ｐrinciples ＆Ｍethods、１２：８７−９８（１９９０）)。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、幾つかのプロトコルにより成し遂げることができる。(Ｊaenicke,Ｒ.およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−Ａ Ｐractical Ａpproach、ＩＲＬ Ｐress、ニューヨーク（１９９０）)。６モルのグアニジンＨＣl(pＨ ５.０)中、そのカラムからオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ(純度 ９５％)を溶出し、また再生の目的には、３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン(還元されている)および２ミリモルのグルタチオン(酸化されている)に調節した。
【００８５】実施例 ２インビトロにおける転写および翻訳によるヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼの発現ＴＮＴ Ｃoupled Ｒeticulocyte Ｌysate Ｓystem(Ｐromega、Ｍadison、ＷＩ)を用いて、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼのインビトロにおける転写および翻訳を行った。オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードするcＤＮＡをＥcoＲＩ〜ＸhoＩまで方向性に従ってクローン化し、ＥcoＲＩ部位は遺伝子の５'末端を規定し、またＸhoＩ部位は遺伝子の３'末端を規定する。遺伝子をＴ３の方向で挿入した。Ｔ３は、特異的プロモーターを認識して、ＤＮＡをmＲＮＡに転写する、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを定義する。ウサギの網状赤血球ライゼートにＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを補い、メッセージを転写するためにＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを、また新生ＲＮＡを翻訳するために網状赤血球ライゼートを利用して、Ｔ３プロモーターによりタンパク質の発現を行わせる。放射性アミノ酸を翻訳された生成物に取り入れることにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて、オートラジオグラフィーを利用して、タンパク質発現を分析することができる。より具体的には、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼＤＮＡを含むプラスミド１μgを、網状赤血球ライゼート、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよび[３５Ｓ]−メチオニンと共に、３０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、翻訳物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。主要な翻訳生成物は、約５５Ｋdで見ることができた。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、追記する請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができる。
【００８６】
【配列表】（１） 一般的情報 ：（i） 特許出願人 ： オルセン等（ii） 発明の名称 ： ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ（iii） 配列の数 ： ２（iv） 連絡先 ：（Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラン，セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン（Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番（Ｃ） 市 ： ローズランド（Ｄ） 州 ： ニュージャージー（Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国（Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８（v） コンピューター解読書式 ：（Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット（Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２（Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１（vi） 本出願のデータ ：（Ａ） 出願番号 ：（Ｂ） 出願日 ： 同日（Ｃ） 分類 ：（vii） 先行技術データ ：（Ａ） 出願番号 ：（Ｂ） 出願日 ：（viii） 弁理士／代理人情報 ：（Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ（Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４（Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−８０（ix） 電話連絡先情報 ：（Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００（Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４（２） 配列番号１の情報 ：（i） 配列の特徴（Ａ） 長さ ： １,８８２塩基対（Ｂ） 型 ： 核酸（Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖（Ｄ） トポロジー ： 直鎖状（ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ（xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ：
（２） 配列番号２の情報 ：（i） 配列の特徴 ：（Ａ） 長さ ： ５７８アミノ酸（Ｂ） 型 ： アミノ酸（Ｃ） 鎖の数 ：（Ｄ） トポロジー ： 直鎖状（ii） 配列の種類 ： タンパク質（xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ：
【出願人】 【識別番号】５９７０３４３５８
【氏名又は名称】ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＯＭＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．
【出願日】 平成６年５月１８日（１９９４．５．１８）
【代理人】 【識別番号】１０００６２１４４
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 葆 （外２名）
【公開番号】 特開２００２−１２５５４（Ｐ２００２−１２５５４Ａ）
【公開日】 平成１４年１月１５日（２００２．１．１５）
【出願番号】 特願２００１−１４９０４５（Ｐ２００１−１４９０４５）