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【発明の名称】 自己免疫疾患モデル動物の作製方法
【発明者】 【氏名】天谷 雅行

【氏名】西川 武二

【氏名】小安 重夫
【要約】 【課題】組換えＤｓｇ３タンパク質等の抗原タンパク質の調製を不要とし、かつ、Ｄｓｇ３-/-マウス等の自己免疫疾患の抗原遺伝子が欠損している非ヒト哺乳動物を免疫するステップを省略することができる、より簡便に短期間で尋常性天疱瘡等の自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物を作製する方法を提供すること。

【解決手段】自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物から調製した脾細胞等の免疫担当細胞の所定量を、抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植し、かかる抗原タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞を活性化させて、尋常性天疱瘡等の自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製方法であって、自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物から調製した免疫担当細胞の所定量を、抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植することを特徴とする非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２】 免疫担当細胞の移植が、免疫不全非ヒト哺乳動物に対して行われることを特徴とする請求項１記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項３】 免疫不全非ヒト哺乳動物が、Ｒａｇ２遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項２記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項４】 免疫担当細胞が、脾細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項５】 移植する免疫担当細胞の所定量が、２×１０7〜５×１０7個の脾細胞であることを特徴とする請求項４記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項６】 自己免疫疾患が尋常性天疱瘡であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項７】 抗原タンパク質がデスモグレイン３タンパク質であることを特徴とする請求項６記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項８】 非ヒト哺乳動物が齧歯類であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項９】 齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項８記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法により得られることを特徴とする自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、自己免疫疾患のモデル動物及びその作製方法、より詳しくは、尋常性天疱瘡のモデルマウス等の自己免疫疾患のモデル動物及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】尋常性天疱瘡（pemphigus vulgaris;ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の自己免疫水疱形成疾患であり、組織学的には表皮内の水疱形成により特徴付けられ、免疫病理学的にはケラチノサイトの細胞表面に対するＩｇＧ自己抗体により特徴付けられる（Stanley, J. R. Pemphigus. In Dermatology in General Medicine. I.M. Freedberg, A. Z. Eisen, K. Wolff, K.F.Austen, L.A. Goldesmith, S.I. Katz,and T.B. Fitzpatrick, eds. McGraw-Hill, New York, 654-666(1998)）。臨床的には、尋常性天疱瘡患者は、広範な弛緩性の水疱及びびらんを示す。これらは、あらゆる重層扁平上皮に生じうる。適当な治療を行わなければ、広範囲の皮膚に生じた病巣が体液の漏出又は二次的な細菌感染を引き起こすため、尋常性天疱瘡は致命的となることもある。コルチコステロイドの全身投与及び免疫抑制療法を用いることにより、天疱瘡の予後は改善されているが、治療の合併症による死亡のため、死亡率は依然としてかなり高い。
【０００３】尋常性天疱瘡の標的抗原は、最初、ケラチノサイト抽出物の免疫沈降により、１３０ｋＤの糖タンパク質として同定された（J. Clin. Invest. 70, 281-288,1982、J. Clin. Invest. 74, 313-320, 1984）。その後、尋常性天疱瘡抗原に特異的なアフィニティ精製自己抗体を用いて、ヒト・ケラチノサイト発現ライブラリーを免疫スクリーニングすることにより、尋常性天疱瘡抗原のｃＤＮＡが単離された（Cell, 67, 869-877, 1991）。塩基配列の解析により、尋常性天疱瘡抗原は、細胞間接着分子のカドヘリン・スーパー遺伝子ファミリーに属することが示された。尋常性天疱瘡抗原は、デスモソームの膜タンパク質であり（J. CellBiol. 122, 409-415, 1993）、デスモグレイン３（desmoglein3;Ｄｓｇ３）と名付けられた（Adv. Dermatol. 11, 319-352, 1996）。
【０００４】Ｄｓｇ３タンパク質に対するＩｇＧ自己抗体が尋常性天疱瘡の病因的役割を示す証拠は多数存在する。第一に、経時的な疾患の活性が、血中抗体力価と相関していることが、間接蛍光抗体法（Br. J. Dermatol. 84, 7-13, 1971）又はＥＬＩＳＡ（J. Immunol. 159, 2010-2017, 1997、Br. J. Dermatol. 140, 351-357,1999）により報告されている。第二に、尋常性天疱瘡を患う母親の新生児は、胎盤を介して移行した母親由来のＩｇＧのために一時的に疾患を有する（Pediatrics 78, 1102-1105, 1986）。母親由来のＩｇＧが異化されるにつれ、症状は軽快する。第三に、尋常性天疱瘡患者由来のＩｇＧは、組織培養された皮膚において、補体又は炎症細胞なしに水疱形成を誘導することができる（J. Invest. Dermatol. 67, 254-260, 1976、J. Exp. Med. 157, 259-272, 1983）。第四に、患者の血清由来のＩｇＧを新生マウスに受動移入すると、典型的な組織学的所見を伴う表皮内水疱形成が起こる（N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196, 1982）。第五に、患者の血清を、細胞外ドメインからなる組換えＤｓｇ３タンパク質（ｒＤｓｇ３）を用いて免疫吸収除去すると、血清の病原性が除去され、新生マウスにおける水疱形成が阻害される（J. Clin. Invest. 94, 59-67, 1994）。最後に、ｒＤｓｇ３でアフィニティ精製された抗体は、抗原性を有し、新生仔マウスにおいて尋常性天疱瘡の組織学的所見を伴う水疱を形成させる（J. Clin. Invest. 90, 919-926, 1992、J. Clin. Invest. 102, 775-782, 1998）。これらの研究から、尋常性天疱瘡は、特に自己抗体生成後の過程に関しては、最もよく特徴が決定された自己免疫疾患の一つとなっている。従って、尋常性天疱瘡は、現在では、自己抗体産出又は自己寛容の破壊の細胞メカニズムを研究するため、また、疾患特異的な治療法を開発するための、臓器特異的自己免疫疾患の良い疾患モデルとされている。
【０００５】実験的自己免疫疾患動物モデルの大部分は、様々なアジュバンドを用いて自己抗原を繰り返し注射することにより作製されている。しかし、重症筋無力症の場合のように、アセチルコリン・レセプター（T. カリフォルニカ（T. californica））で免疫されたマウスに疾患が発生する頻度は系統により極めて異なるため、この方法は、非常に経験に頼ったものである（Ann. N. Y. Acad. Sci. 377, 237-57, 1981）。また、その他の自己免疫疾患動物モデルの作製方法として、通常では自己免疫病を自然発症しないマウスの胸腺を新生時期に摘出することにより多くの近交系マウスにおいて複数の臓器に自己免疫疾患を発症させる方法や、ヌードマウスに正常マウスのＴリンパ球を注射することにより類似の病変を発症させる方法や、ヌードマウスに異種の胎仔胸腺を移植して該マウスに免疫能を獲得させ、多発性のきわめて激しい臓器特異的自己免疫疾患を発症させる方法が知られている（医学のあゆみ、Mar.別冊、２８２〜２８４頁、１９９５）。そして、上記方法のうち、ヌードマウスへの同系マウスのＴ細胞の注入による自己免疫疾患の導入方法については次のように言及されている。ヌードマウスには自己免疫疾患は自然発症しないが、雌雄のヌードマウスに同系の異性マウス又は新生時期去勢マウスの脾細胞あるいはリンパ節細胞を少量（１×１０5〜４×１０6個）注入することにより、自己免疫性の卵巣炎や前立腺炎を発症させることができる。ところが、同じドナーマウスの細胞を多量（４×１０7個）注入したヌードマウスには自己免疫病は発症しない。
【０００６】従来、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを尋常性天疱瘡患者由来のＰＢＭＣで再構築することにより、尋常性天疱瘡の実験モデルが開発されている（J. Clin. Invest. 92, 2401-7, 1993）。このモデルでは、患者由来のリンパ球が低力価の血中自己抗体を産出したが、マウス皮膚にヒトＩｇＧ沈着を伴う自発的な表皮内水疱が見られることは稀であった。ヒトの皮膚をＳＣＩＤマウスに移植した場合には、移植された皮膚に尋常性天疱瘡様の水疱が見られたが、このモデルにおける水疱発生の原因は、ヒトのＰＢＭＣ及び皮膚の組織不適合による炎症反応である可能性も否定できていない。このように確実な尋常性天疱瘡の活性疾患モデルは存在していなかったが、本発明者らは、マウス体内において病原性抗体が産生されないのは、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己寛容のためであるとの仮説の下、遺伝子ターゲティング技術により作製したＤｓｇ３欠損マウスは発生段階で免疫系がＤｓｇ３タンパク質に曝されず、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己寛容を獲得していないとの知見に基づき、尋常性天疱瘡の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製方法を開発した（特願平１１−９１４０８号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記本発明者らによる作製方法（特願平１１−９１４０８号）は、自己免疫疾患の抗原遺伝子（Ｄｓｇ３）が欠損している非ヒト哺乳動物（マウス）を自己免疫疾患の抗原タンパク質（ｒＤｓｇ３タンパク質）で免疫し、該免疫された非ヒト哺乳動物から脾細胞を調製し、該調製した脾細胞を抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植し、自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、自己免疫疾患（尋常性天疱瘡）の表現型を示す非ヒト哺乳動物を作製するというものであり、きわめて完成度の高い方法であるが、ｒＤｓｇ３タンパク質等の抗原タンパク質が必要とされ、また、Ｄｓｇ３-/-マウス等の自己免疫疾患の抗原遺伝子が欠損している非ヒト哺乳動物を免疫するステップも必要とされていた。本発明は、上記本発明者らによる作製方法（特願平１１−９１４０８号）の改良に関するものであり、本発明の課題は、組換えＤｓｇ３タンパク質等の抗原タンパク質の調製を不要とし、かつ、Ｄｓｇ３-/-マウス等の自己免疫疾患の抗原遺伝子が欠損している非ヒト哺乳動物を免疫するステップを省略することができる、より簡便に短期間で尋常性天疱瘡等の自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物を作製する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、まず、組換えＤｓｇ３タンパク質で免疫していないナイーブなＤｓｇ３-/-マウスの脾細胞を、前記作製方法（特願平１１−９１４０８号）における移植量と等量の一匹あたり１×１０7細胞に調整し、レシピエントマウス（Ｒａｇ２-/-）７匹に移植したところ、２ヶ月間の観察後でも、７匹中全てにおいて、ＥＬＩＳＡで血中抗体価の上昇は認められず、ＤＩＦにおいても表皮細胞間へのＩｇＧの沈着は認められなかった。また、観察期間を通してマウスに脱毛、糜爛、痂皮形成などの明らかな表現型は認められなかった。かかる結果より、ナイーブ脾細胞移植によるモデルマウスの作製は困難と考えられたが、ナイーブなＤｓｇ３-/-マウスの脾細胞の移植量を５倍に増やし、一匹あたり５×１０7細胞に調整し、レシピエントマウス（Ｒａｇ２-/-）に移植したところ、移植４週間で明らかな尋常性天疱瘡の表現型が認められることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製方法であって、自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物から調製した免疫担当細胞の所定量を、抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植することを特徴とする非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項１）や、免疫担当細胞の移植が、免疫不全非ヒト哺乳動物に対して行われることを特徴とする請求項１記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項２）や、免疫不全非ヒト哺乳動物が、Ｒａｇ２遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項２記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項３）や、免疫担当細胞が、脾細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項４）や、移植する免疫担当細胞の所定量が、２×１０7〜５×１０7個の脾細胞であることを特徴とする請求項４記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項５）や、自己免疫疾患が尋常性天疱瘡であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項６）や、抗原タンパク質がデスモグレイン３タンパク質であることを特徴とする請求項６記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項７）や、非ヒト哺乳動物が齧歯類であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項８）や、齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項８記載の非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項９）や、請求項１〜９のいずれか記載の非ヒト哺乳動物の作製方法により得られることを特徴とする自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物（請求項１０）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の非ヒト哺乳動物の作製方法としては、自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製方法であって、自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物から調製した免疫担当細胞の所定量を、抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植する方法であれば特に制限されるものではなく、ここで免疫担当細胞とは、体液性免疫や細胞性免疫などの一連の生体防御反応に関与するリンパ球やマクロファージ等の細胞をいい、また、免疫担当細胞の所定量とは、抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植した場合、自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生又はＴ細胞の活性化により、自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物を作製することができる免疫担当細胞の量をいう。免疫担当細胞を調製する非ヒト哺乳動物がマウスのような小動物の場合、かかる免疫担当細胞として脾細胞を有利に用いることができ、例えば、尋常性天疱瘡の抗原遺伝子Ｄｓｇ３を欠損しているマウスから調製した脾細胞を免疫不全マウスに移植する場合の所定量としては、１．５×１０7以上、好ましくは２×１０7〜５×１０7個の脾細胞を好適に例示することができる。
【００１１】本発明における自己免疫疾患としては、例えば、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、バセドー病、橋本病、グットパスチャー症候群、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症などの疾患を具体的に挙げることができるが、これらに制限されるものではなく、また、これら自己免疫疾患の抗原遺伝子としては、例えば、自己免疫疾患が尋常性天疱瘡であればＤｓｇ3遺伝子、重症筋無力症であればアセチルコリン受容体遺伝子、バセドー病や橋本病であればTSH受容体遺伝子、グットパスチャー症候群であればIV型コラーゲン遺伝子、多発性硬化症であればミエリン塩基性タンパク質遺伝子などを具体的に挙げることができるが、これらに制限されるものではない。そして、かかる自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物の作製は、当業者によって公知の方法で行うことができる。
【００１２】本発明においては、非ヒト哺乳動物から調製した脾細胞等の免疫担当細胞の所定量が、抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植されるが、かかる脾細胞等の免疫担当細胞を調製するための非ヒト哺乳動物（ドナー）と、脾細胞等の免疫担当細胞の移植を受ける非ヒト哺乳動物（レシピエント）とは、移入される脾細胞等に由来のリンパ球がレシピエントの組織を破壊するGVHDが発症しないようにするために、同種であり、遺伝子背景が同じであることが好ましい。また、レシピエントは、移入された脾細胞等に由来のリンパ球を拒絶しないようにするために、免疫不全非ヒト哺乳動物であることが好ましく、かかる免疫不全非ヒト哺乳動物として、Ｒａｇ２遺伝子が欠損した非ヒト哺乳動物を好適に例示できるが、この他、例えば、SCIDマウス、ヌードマウス、MHCノックアウトマウス、共通γ鎖ノックアウトマウスなどを例示することもできる。そして、ドナーからの脾細胞等の免疫担当細胞の調製やレシピエントへの脾細胞等の免疫担当細胞の移植は、公知の方法により行うことができる。そしてまた、上記ドナーとしては、遺伝子欠損動物を作製しうるものであれば特に制限されるものではなく、齧歯類、例えば、マウスやラットを好適に例示することができ、上記レシピエントとしては、自己免疫疾患の表現型を示すことができるものであれば特に制限されるものではなく、齧歯類、例えば、マウスやラットを好適に例示することができる。
【００１３】本発明により作製される非ヒト哺乳動物としては、自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生、好ましくは抗体の安定的な産生、又はＴ細胞の活性化、好ましくはＴ細胞の持続的な活性化により、自己免疫疾患の表現型を示すことができるモデル動物として有用であれば特に制限されるものではなく、かかる自己免疫疾患の表現型、特に主要な表現型としては、尋常性天疱瘡のモデル動物においては体重減少及び可逆的な脱毛など、重症筋無力症では筋力低下など、自己免疫性溶血性貧血では貧血など、バセドー病では甲状腺機能亢進など、橋本病では甲状腺機能低下など、グットパスチャー症候群では腎障害や肺障害など、自己免疫性糖尿病では糖尿など、多発性硬化症では神経麻痺などをそれぞれ例示することができる。
【００１４】これらのモデル動物は、自己免疫疾患の治療効果を検討したい所望の化合物を投与し、その表現型を観察することにより、該疾患に対する治療薬や治療法の開発に用いることができる。特に、本実施例において作製された尋常性天疱瘡のモデルマウスは、その主要な表現型が体重減少及び可逆的な脱毛であり、また表現型が６カ月以上に亘って持続するため、該マウスを屠殺することなく観察してそれぞれの治療薬や治療法の有効性を容易かつ客観的に評価することが可能である。また、これらのモデルマウスは、抗原タンパク質に対する抗体産生の細胞メカニズムを解明する上でも非常に有用である。
【００１５】
【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。実施例１（ナイーブＤｓｇ３-/-マウス脾細胞移植による尋常性天疱瘡モデルマウスの作製；図１参照）ｒＤｓｇ３で免疫せずにＤｓｇ３-/-マウスのナイーブな脾細胞がレシピエントマウス内において内在性のＤｓｇ３により刺激され、抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ抗体を産生し、尋常性天疱瘡の表現型を誘導するか検討した。ドナーマウスとしては、雄Ｄｓｇ３-/-マウスと雌Ｄｓｇ３+/-マウスの交配により得られたＤｓｇ３-/-マウスを用いた（Koch, P.J., et al., J. Cell Biol. 137:1091-1102(1997)）。また、レシピエントマウスとしては、タコニック社（Taconic、German Town,NY)より入手した、B6.SJL-ptprcに１０世代にわたり戻し交配させたＲａｇ２-/-マウスを用いた（Schulz, R. -J. et al., J. Immunol. 157:4379-4389(1996)）。このＲａｇ２-/-マウスは、Ｄｓｇ３タンパク質を発現しているが、Ｔ細胞レセプター又は免疫グロプリンの遺伝子を再編成することができず、これらのマウスには成熟Ｔ又はＢ細胞が存在しないため、移入した脾細胞が拒絶されない。
【００１６】ナイーブなＤｓｇ３-/-マウスから常法により脾細胞を分離した。脾細胞の養子移入にあたっては、単核細胞を、Ｄｓｇ３-/-マウスの脾臓から単離し、１０％のウシ胎児血清、０．２１％の重炭酸ナトリウム溶液（ｗ／ｖ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（GIBCO）、及び抗生物質を含む完全培地ＲＰＭＩ１６４０（Nissui Pharmaceuticals,Tokyo）に再懸濁させた。約２×１０7個の脾細胞と約５×１０7個の脾細胞をそれぞれＰＢＳに懸濁させ、尾静脈への静脈注射により各２０匹のＲａｇ２-/-マウスに移入した。抗体産生は、マウスｒＤｓｇ３（J. Clin.Invest. 105, 625-631, 2000）をコーディング用抗原として用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００１７】マウスｒＤｓｇ３をコーティング用抗原として用いる、マウスにおけるマウスＤｓｇ３タンパク質（ｍＤｓｇ３）に対する血中ＩｇＧのＥＬＩＳＡによる測定は、以下のようにして行った。マイクロタイター９６穴プレートを、４℃で一晩、１００μｌの５μｇ／ｍｌの精製マウスｒＤｓｇ３でコーティングした。全ての血清試料を５０〜５，０００倍に希釈し、室温で１時間、９６穴ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（MBL, Nagoya, Japan）と共に室温で１時間インキュベートした後、１ｍＭのテトラメチルベンジジンをペルオキシダーゼの基質として用いて発色させた（J. Immunol. 159, 2010-2017, 1997、Br. J. Dermatol. 140, 351-357, 1999）。各試料のＯＤ450の経時変化をデュープリケートで分析した。レシピエントマウス一匹あたり２×１０7個の脾細胞を移植したマウス＃７９９，＃８００及び＃３１７とレシピエントマウス一匹あたり５×１０7個の脾細胞を移植したマウス＃３１０及び＃３３７の結果を図２に示す。マウス＃３１７を除いては、Ｄｓｇ３-/-の脾細胞を移入してから１４日目にはレシピエントＲａｇ２-/-マウスの血中に抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧが検出された。抗体産生は迅速に増加し、２８日目付近でプラトーに達し、その後永続的に持続した。また、持続的な抗体産生は、６ヶ月以上にわたり、マウスが生存している限り観察された。
【００１８】さらに、Ｄｓｇ３タンパク質に対する抗体産生を、培養ケラチノサイトの免疫蛍光染色により試験した。マウス・ケラチノサイト細胞株ＰＡＭ２１２（CancerRes. 40, 4694-4703, 1980）を、３７℃で、５％のＣＯ2を含む加湿空気中で、３０分間、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭで２０倍に希釈したマウス血清試料と共にインキュベートした。次にＰＢＳ（−）で洗浄した後、−２０℃で２０分間、細胞を１００％のメタノールで固定化し、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（DAKO, Copenhagen, Denmark）と共に室温で３０分間インキュベートした。染色は、蛍光顕微鏡（Nikon, EclipseE800）で観察した。結果を図３（参考写真１参照）に示す。図３に示されるように、レシピエントＲａｇ２-/-マウスの重層扁平上皮のケラチノサイト細胞表面には、ｉｎ ｖｉｖｏのＩｇＧ沈着が見られた。
【００１９】レシピエントマウス一匹あたり２×１０7個の脾細胞を移植したマウスでは、移植後２週間で２０匹中１２匹に血中抗Ｄｓｇ３抗体の産生をＥＬＩＳＡ法で確認し、移植４週間で１１匹に明らかな天疱瘡の表現型を認めた。レシピエントマウス一匹あたり５×１０7個の脾細胞を移植したマウスでは、移植後２週間で２０匹中１６匹の血中抗体価が上昇し、移植３週間で１５匹に明らかな表現型を認めた。表現型を示したマウスの口蓋では粘膜上皮細胞間にＩｇＧの沈着を認め、病理組織学的に典型的な尋常性天疱瘡所見である基底膜直上での棘融解が確認された（図４；参考写真２参照）。また、表現型を示したマウスにおいては、広範囲にわたる脱毛や、顎下及び足底の糜爛、痂皮形成が認められた（図５；参考写真３参照）。以上の結果よりＤｓｇ３-/-マウスの脾細胞は、レシピエントマウスへ移植された後、インビボの状態で内在性のＤｓｇ３に接触し、活性化されて抗Ｄｓｇ３抗体を産生することが示された。
【００２０】これに対し、免疫していないＤｓｇ３-/-マウス脾細胞を一匹あたり１×１０7細胞に調整し、レシピエントマウス(Ｒａｇ２-/-)７匹に移植したところ、２ヶ月間の観察後でも、7匹中全てにおいて、ＥＬＩＳＡで血中抗体価の上昇は認められず、ＤＩＦにおいても表皮細胞間へのＩｇＧの沈着は認められなかった。観察期間を通してマウスに脱毛、糜爛、痂皮形成などの明らかな表現型は認められなかった。これらの結果より、ナイーブ脾細胞移植により尋常性天疱瘡モデルマウスを作製するには、所定量のナイーブ脾細胞の移植が必要であることがわかる。
【００２１】
【発明の効果】本発明により作製される尋常性天疱瘡モデルマウス等の自己免疫疾患の表現型を示すモデル動物は、自己免疫疾患の抗原タンパク質に特異的なリンパ球がレシピエント動物内で、いつ、どのように抗体産生能を獲得するのか、自己抗体産生機序を解析するのに有用なモデルとなる。またモデル動物作製の上でも、抗原タンパク質の調製が不要で、かつ、ドナー動物を免疫するステップも省略でき、より簡便に短期間で尋常性天疱瘡モデルマウス等の自己免疫疾患の表現型を示すモデル動物の作製が可能である。
【出願人】 【識別番号】８９９００００７９
【氏名又は名称】学校法人慶應義塾
【出願日】 平成１３年５月２４日（２００１．５．２４）
【代理人】 【識別番号】１００１０７９８４
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀 （外２名）
【公開番号】 特開２００２−３４５３６４（Ｐ２００２−３４５３６４Ａ）
【公開日】 平成１４年１２月３日（２００２．１２．３）
【出願番号】 特願２００１−１５６１２６（Ｐ２００１−１５６１２６）