| 【発明の名称】 |
トランスジェニックマウス及び抗肥満薬スクリーニング方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】亀井 康富
【氏名】垣塚 彰
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| 【要約】 |
【課題】抗肥満薬又は肥満に関連する疾患を処置する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明の課題は、ＰＧＣ−1遺伝子を導入したトランスジェニックマウス、及びＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法であって、１)ＰＧＣ−１、２)ＰＰＡＲγ、及び３)応答配列、プロモーター、及び、該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポーター遺伝子を含むベクターを含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標としてＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の転写活性調節を検出することを含む方法により解決される。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１のＰＰＡＲγコファクター１（ＰＧＣ−1）遺伝子を導入し、ＰＧＣ−１を過発現するトランスジェニックマウスであって、野生型マウスに比べ体重が減少し、褐色脂肪組織の質量が増加し、エネルギー消費量が増大し、非共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）及び非共役タンパク質−３（ＵＣＰ−３）の発現量が増大したマウス。
【請求項２】 ＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法であって、１)ＰＧＣ−１、２)ＰＰＡＲγ、及び３)応答配列、プロモーター、及び、該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、を含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標としてＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の転写活性調節を検出することを含む方法。
【請求項３】 スクリーニングする物質が、ＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を増大させるものである、請求項２に記載のスクリーニング方法【請求項４】 抗肥満薬又は肥満に関連する疾患を処置する薬剤のスクリーニングに用いる請求項２に記載の方法。
【請求項５】 請求項1に記載のトランスジェニックマウスを用いることを特徴とする抗肥満薬又は肥満に関連する疾患を処置する薬剤のスクリ−ニング方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＰＰＡＲγコファクター１（ＰＧＣ−1）遺伝子を導入したトランスジェニックマウス、及びＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】先進国では飽食により肥満が増加している。肥満は糖尿病、高血圧、高脂血症などの様々な合併症をともなう。これらはいずれも慢性疾患であるために長期間にわたり個人の生活に影響する。またこのような慢性疾患の増加は、日本で問題となっている医療費の高騰の原因のひとつとなっている。このため、肥満に関連する疾患を処置する薬剤の開発は重要である。
【０００３】ＰＰＡＲγは核内レセプターファミリーのメンバーである。ＰＰＡＲγは脂肪組織に多く発現し、脂肪組織の形成に重要な役割をになう。加えて、ＰＰＡＲγは褐色脂肪組織における熱産生にも役割を持つことが報告されている。ＰＰＡＲγを介したシグナル伝達機構を解明することは脂肪組織の形成及び体熱産生（エネルギー消費）の分子的機構の理解につながるであろう。ＰＰＡＲγの属する核内レセプターファミリーには、ステロイドや、甲状腺ホルモン、レチノイン酸（ビタミンＡ）といった脂溶性の低分子生理活性のレセプターが挙げられる。活発な研究により、１）ステロイドホルモンや甲状腺ホルモン、レチノイン酸又はチアゾリンなどは、脂溶性のリガンドとしてそれぞれの特異的な核内レセプターに結合し、２）脂溶性のリガンドと結合した核内レセプターは、標的遺伝子のプロモーター上の特定の塩基配列に２量体として直接結合し転写活性化を起す、という分子メカニズムが明かにされてきた。
【０００４】さらに、近年、３）リガンド依存的に核内レセプターとタンパク質−タンパク質相互作用し、遺伝子発現を制御する分子、コファクター（共役転写制御因子）の発見がなされた（Glass, C. K., Rosenfeld, M. G., The coregulator exchange in transcription functions of Nuclear receptors, Genes Dev 14:121-141(2000)）。核内レセプターのコファクターは様々な組織、細胞にユビキタスに発現するが、ＰＧＣ１（ＰＰＡＲ gamma coactivator 1）は、寒冷ストレスを受けたマウスの褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）及び骨格筋細胞での発現量の顕著な誘導が認められ、熱産生に役割を持つことが示唆されている（Puigserver, P. A., Cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis, Cell 92:829-939 (1998)）。
【０００５】脱共役タンパク質（uncoupling protein）−１（ＵＣＰ−１）はミトコンドリアのタンパク質であって、プロトンの電気化学的ポテンシャルの勾配を消散させ、酸化的リン酸化反応における電子伝達とＡＴＰ合成反応を分断する機能を有する。ＵＣＰ−１の発現は寒冷ストレスを受けるとＢＡＴで顕著に増加することが知られている。しかしがら、インビボにおけるＰＧＣ１の発現とＵＣＰ−１の発現との関係については未だ明らかでない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＰＧＣ−１を過発現するトランスジェニックマウスを作成した。該トランスジェニックマウスはコントロールマウスと比較すると褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の量が増加し、特定の組織において、特にＢＡＴにおいてＵＣＰ−１及びＵＣＰ−３タンパク質の発現量が顕著に増加していることを見出した。また該トランスジェニックマウスはエネルギー消費量が増大し、体重が減少していた。これらの結果は、ＰＧＣ−１を活性化すると体内のエネルギー消費量が増加し、運動などしなくても体重の減少、すなわち肥満の解消が起こることを示すものである。ＰＰＡＲγとＰＧＣ−１との相互作用を増強あるいは、減弱させるような化合物を検索することにより、肥満を解消する薬剤や肥満に関連する疾患の治療薬をスクリーニングが可能となる。また本発明のトランスジェニックマウスを直接用いて上記薬剤の効果を確認することができる。
【０００７】即ち、本発明は、ＰＧＣ−1遺伝子を導入しＰＧＣ−1を過発現するトランスジェニックマウスであって、野生型マウスに比べ体重が減少し、褐色脂肪組織量が増加し、エネルギー消費量が増大し、ＵＣＰ−１及びＵＣＰ−３タンパク質の発現量が増大したマウスに関する。
【０００８】さらに本発明は、ＰＧＣ１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法であって、１)ＰＧＣ１、２)ＰＰＡＲγ、及び３)応答配列、プロモーター、及び、該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、を含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標としてＰＧＣ１-ＰＰＡＲγ複合体の転写活性調節を検出することを含む方法にも関する。
【０００９】更に本発明は、トランスジェニックマウスを用いることを特徴とする抗肥満薬のスクリ−ニング方法にも関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】（１）ＰＧＣ１遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの作成先ずマウスに導入すべきPGC1遺伝子を含むＤＮＡ構築物を調製する。そのようなＤＮＡ構築物は、例えば、PGC1を発現させるための適当なプロモター、例えばCAGプロモーター、プロモーターの下流に配置されたラビットβグロビンイントロン（Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-199）、イントロンの下流に配置されたPGC1遺伝子（配列番号１）、PGC1遺伝子の下流に配置されたウサギβグロビンポリA付加部位（Niwa, H., Yamamura, K., andMiyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-199）を含む（図１Ａ）。CAGプロモーターはチキンアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーからなる（Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-199）。CAGプロモーターおよび、ウサギβグロビンポリA付加部位はpCAGGSプラスミドに含まれている。pCAGGSは理化学研究所ライフサイエンスセンター筑波研究センター理研ジーンバンクより、誰でも入手可能である。次に、このＤＮＡ構築物をマウスに導入してトランスジェニックマウスを作成する。トランスジェニックマウスを作成する方法はよく知られており、羊土社「ジーンターゲッテイングの最新技術」やGordon, J. W. (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, P. M., and DePamphilis, M. L., Eds.), Academic Press, San Diegoなどに詳細に記載されている。簡単にその方法を説明すると以下のようである。
１）雌マウスにホルモンを注射して強制的に過剰排卵させ、受精を行い、交尾後１日目の卵管から受精卵を摘出する。
２）核が融合する前の時期の受精卵に顕微鏡下にPGC1遺伝子を含むＤＮＡ構築物を雄性全核中にマイクロインジェクションにより注入する。
３）こうした操作を施した受精卵を約２０個ぐらい、偽妊娠雌マウス（仮親）の子宮又は卵管内に移植する。
４）この雌マウスを通常通り飼育し、仔マウスを出産させる。PGC1遺伝子導入の成否を仔マウスの尾の先端を切り取って抽出したＤＮＡのサザンブロットにより確認する。
【００１１】（２）ＰＧＣ１遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの性質本発明のＰＧＣ１遺伝子を導入したトランスジェニックマウスは、非トランスジェニックマウス（対照マウス）に比べて以下のような特徴を有する。
（ｉ）対照マウスより大きいＢＡＴ質量を有する。
（ｉｉ）ＢＡＴの脂肪滴は対照マウスのそれより小さく、数が多い。
（ｉｉｉ）体重が小さい（ｉｖ）エネルギー消費量が大きい（ｖ）ＵＣＰ−１及びＵＣＰ−３の発現量が増加する。ＵＣＰ−１の発現量はＢＡＴ、腎臓細胞、骨格筋細胞で増加し、ＵＣＰ−３の発現量はＢＡＴ、腎臓細胞、骨格筋細胞で増加する。
これらの結果は、ＰＧＣ−１の発現量が増加すると、ＢＡＴ細胞などにおいてＵＣＰ−１の発現が増加して、電子伝達とＡＴＰ合成反応が分断され、その結果、脂肪が消費されて、熱が発生しエネルギー消費量が増加することを示すものである。ここにＰＧＣ１の発現とＵＣＰ−１の発現のインビボにおける関係がはじめて明らかになった。ＵＣＰ−１遺伝子のプロモーターはＰＰＡＲγの結合部位を有する（Sears, I. B. 等, Mol. Cell Biol., 16;3410-3419 (1996））ことを考慮すると、ＰＧＣ−1の発現の増加によりＰＰＡＲγ−ＰＧＣ−1複合体の転写活性が上昇しＵＣＰ−１の発現量が増加するものと考えられる。
【００１２】（３）ＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法本発明は、ＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法であって、１)ＰＧＣ−１、２)ＰＰＡＲγ、及び３)応答配列、プロモーター、及び、該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、を含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標としてＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の転写活性調節を検出することを含む方法にも関する【００１３】ＰＰＡＲγの遺伝子配列及びアミノ酸配列は公知である(Dreyerら、Cell、第68巻、第879〜887頁(1992年)；Zhuら、J.Biol.Chem.、第268巻、第26817〜26820頁(1993年)；Kliewerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、第91巻、第7355〜7359頁(1994年)；Mukherjeeら、J.Biol.Chem.、第272巻、第8071〜8076頁(1997年)；Elbrechtら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第224巻、第431〜437頁(1996年)；Chemら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第196巻、第671〜677頁(1993年)；Tontonozら、Genes&Development、第8巻、第1224〜1234頁(1994年)；Aperloら、Gene、第162巻、第297〜302頁(1995年))。ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の２種のアイソフォームが存在し、ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の30アミノ酸が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は同じであり、いずれも脂肪組織に発現していることが知られている。そのリガンド結合領域は、他の核内受容体とのホモロジー等から、ＰＰＡＲγ２では、Ｎ末端から約174番目から475番目までのアミノ酸を含む領域に相当すると推定される。
【００１４】本発明のＰＧＣ１-ＰＰＡＲγ複合体の相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法において、用いるＰＰＡＲγは全長アミノ酸配列を有する必要はなく、場合によっては全長より短いか、あるいは、長いものを用いることができる。また場合により、その機能を損なわない範囲で付加的な構成、或いは、その天然の配列とは異なる配列、即ち、欠失、置換または付加等を有していてもよい。
【００１５】ＰＰＡＲγを蛋白質として直接スクリーニング系に添加することもできるし、また、ＰＰＡＲγをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系中で該蛋白質が発現されるように系を構築することも可能である。
【００１６】マウスのＰＧＣ−１のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２に示す。遺伝子暗号の縮重の性質から、配列番号２のアミノ酸配列をコードする多数の異なる核酸配列を構築することが可能であることが理解される。配列番号１に記載のヌクレオチド配列は、可能な多数のＰＧＣ−１をコードする配列のうちの1つに過ぎない。従って、以下に記載の、並びに、付随する実施例中の本発明の好ましい核酸分子、ベクター等は例示的なものであり、本発明の範囲を減縮することを目的としたものではない。ＰＧＣ−１を蛋白質として直接スクリーニング系に添加することもできるし、また、ＰＧＣ−１をコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系中で該蛋白質が発現されるように系を構築することも可能である。
【００１７】これらの配列は、種々の方法により製造され得、そのため本発明はいかなる特定の製造手法にも限定されない。本発明の核酸配列は、ＤＮＡ合成、ｃＤＮＡクローニング、ゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、及び、これらの手段の組合せを含む多数の製法により製造され得る。これら、及び、その他の技術がManiatisらの『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』(ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989年))、または、『Current protocols in Molecular Biology』(F.M.Ausubelら、1989年及び増刊)に記載されている。
【００１８】ＰＰＡＲγをコードする遺伝子、並びに、ＰＧＣ−１をコードする遺伝子は、通常の遺伝子組換え技術により構築することができる。例えば、既知のアミノ酸配列及び塩基配列情報等をもとに設計し、合成したプライマーやプローブを用い、ＰＣＲ法やハイブリダイズ法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができる。これらを適当なプロモーターの下流に連結したベクターを作成することにより、適当な宿主中でＰＰＡＲγ、並びに、ＰＧＣ−１を各々発現させることができる。ベクターとしては、それらに限定されるわけではないが、プラスミド、コスミド、及び、ウイルス(ファージを含む)が含まれる。また、これらをコードするＤＮＡは、必要な機能を損なわない範囲で、1または数個の塩基の付加・欠失・置換等されていてもよい。ＰＰＡＲγをコードする遺伝子、及び、ＰＧＣ−１をコードする遺伝子を、それぞれ別に発現されるよう1つのベクターとして構築することも可能である。
【００１９】応答配列、プロモーター、及び、該プロモーターに発現可能に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターとしては、それらに限定されるわけではないが、プラスミド、コスミド、及び、ウイルス(ファージを含む)が含まれる。該ベクターにおいて応答配列、プロモーター、及びレポーター遺伝子は５’から３’方向に順次連結される。
【００２０】PPARγのような核内受容体は標的遺伝子のプロモーター上の応答配列とよばれる特異的な配列に結合し、リガンド依存的に転写を活性化すると考えられている。PPARγが結合する配列はPPRE(PPARγ Responsive Element、PPARγ応答配列）と呼ばれる。PPREの配列は公知である（配列番号１３）（Kliever SAら、Nature, 358: 771-754)。
【００２１】レポータープラスミドのプロモーターは用いる細胞で認識される種類のプロモーターであればいずれのプロモーターでも使用できる。好ましいプロモーターの例は、チミジンキナーゼプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーターがある。
【００２２】本発明のベクター中のレポーター遺伝子は、特に限定されないが安定でかつ活性の定量が容易なものが好ましい。場合によっては、転写されたｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等の手段により側定することも可能である。レポーター遺伝子として酵素の遺伝子等を用いた場合には、その酵素活性により容易に測定することができ好ましい。例えば、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００２３】該ベクターもまた、通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計、構築することができる。スクリーニングが細胞内で行われる場合、ベクターは細胞内にプラスミドとして染色体とは別個に存在させることもできるし、宿主の染色体内に相同組換え等の周知の技術を用い導入して用いることもできる。
【００２４】スクリーニング系で用いる細胞は、トランスフェクションが可能な細胞であればとくに種類は問わない。そのような細胞にはＣＶ−１細胞株（大日本製薬）を含む。
【００２５】上述のようにして得られた要素を含むスクリーニング系に被検物質を添加し、スクリーニング系がイン・ヴィトロの場合には直接レポーター遺伝子の発現を、イン・ビボの場合には必要であれば、細胞の培養を行ってからレポーター遺伝子の発現を測定することにより、ＰＧＣ１-ＰＰＡＲγ複合体の転写活性に影響を与える物質のスクリーニングを行うことができる。即ち、ある化合物を本発明のスクリーニング系に加えた場合、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子の発現量が増加（減少）したならば、その化合物はＰＧＣ−１とＰＰＡＲγとの相互作用を増大（減少）させた結果であると考えることができる。前述のようにインビボにおいてＰＧＣ−１の発現量が増加すると、ＢＡＴ細胞などにおいてＵＣＰ１の発現量が増加して、電子伝達とＡＴＰ合成反応が分断され、その結果、脂肪が消費されて、熱が発生しエネルギー消費量が増加することが本発明により明かになった。従って本発明のスクリーニング系によりスクリーニングされたＰＧＣ−１-ＰＰＡＲγ複合体の転写活性を増大させる物質はＵＣＰ１の発現量を増加させ抗肥満薬又は肥満に関連する疾患を処置する薬剤に用い得る。また本発明のトランスジェニックマウスに抗肥満薬又は肥満に関連する疾患を処置する薬剤のための候補物質を直接投与してその効果を確認することもできる。
【００２６】
【実施例】実施例１プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＰＧＣ１の作成pCAGGSプラスミドはCAGプロモーター（チキンアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーからなる）および、ウサギβグロビンポリA付加部位を含むDNAである。pCAGGSに組み込んだ遺伝子断片は、さまざまな細胞、組織で蛋白質を高発現することが可能である。（Niwa, H., Yamamura, K., andMiyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-199）pCAGGSは理化学研究所ライフサイエンスセンター筑波研究センター理研ジーンバンクより、誰でも入手可能である。マウスのＰＧＣ−１のｃＤＮＡはマウス胚ｃＤＮＡライブラリーをスクリ−ニングすることにより得、配列決定により確認した。ＰＧＣ−１のｃＤＮＡの完全長のコード領域（配列番号１）をｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＧＣ−１を構築した。
【００２７】実施例２トランスジェニックマウスの作成導入遺伝子断片をｐＣＡＧＧＳを制限消化（ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ）することによりｐＣＡＧＧＳ−ＰＧＣ−１から切りだし、電気泳動により精製した（２ｎｇ／μｌ）。この断片は５ｋｂを有する。ＰＧＣ１遺伝子はＣＡＧプロモーター（チキンのβ−アクチンプロモーター及びサイトメガロウイルスの前初期エンハンサーを有する）の支配下にあり、ラビットβ−グロビンイントロン及びそのポリアデニル化部位を含む（図１Ａ）。ドナーマウスを標準的な方法（２３）を用いて準備した。雄のＢＤＦ１と交配させた雌のＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２）から受精卵を回収し、標準的な方法により、マイクロインジェクションを行なった。即ち、凍結した受精卵（日本SLC、日本クレアなどから購入可能）を解凍し、顕微鏡のガラスチャンバー上にのせ、顕微鏡で針先を受精卵に近付け、DNA溶液をインジェクションマイクロマニピュレーター（Leica社)を用いて受精卵に注入する。その後、DNA溶液を注入した受精卵を、受容雌マウスの卵管内に移植した。この操作は羊土社「ジーンターゲッテイングの最新技術」やGordon, J. W. (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, P. M., and DePamphilis, M. L., Eds.), Academic Press, San Diegoなどに記載されており、それに従って行なった。受容雌マウスより、マウスを発生させる。この操作によりトランスジェニックマウスを作成した。導入遺伝子のコピー数を仔のマウスの尾のＤＮＡを用いるサザンブロッティングにより測定した。サザンブロッティングのために、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＧＣ−１の０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用いた。結果を図１Ｂに示す。各マウスの導入されたＰＧＣ−1遺伝子のコピー数を、サザンブロットからのオートラジオグラフィーのデンシトメトリックスキャンニングにより評価した。導入遺伝子の最高コピー数（１００以上）を有するマウスは、呼吸増加（荒い息）を示し、非常に痩せた後に８週齢で死んだ。最低のコピー数、たった２コピーを有するマウス（図１、ＢのラインＡ３）は導入遺伝子の検出可能なシグナルを示さなかった。従って以下の実験のためにラインＡ１（コピー数６４）及びＡ２（コピー数５３）を用い、類似の結果を得た。ファウンダーマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと共に飼育することによって子孫を生成させた。マウスを１２時間 光／１２時間 暗（午前６時点灯）に維持した。マウスのケアは規格化されたガイドラインに従って行なった。
【００２８】実施例３ＰＧＣ１遺伝子導入トランスジェニックマウスの性質（３−１）トランスジェニックマウスの形態学的、組織学的性質形態学的性質：ＰＧＣ−１を発現する確立されたマウスラインは正常な妊娠、誕生及びリッターサイズを有し、発育的に正常で、生育可能であり、外見上健康であるように見える。これらのトランスジェニックマウスの外観及び挙動も正常である。若いＰＧＣ−１トランスジェニックマウスは非トランスジェニックマウスのそれと似た体重を有していた。しかしがら、対照マウスにおいては体重の年齢依存的増加が観察されたのに対し、トランスジェニックマウス（２４週齢）は野性型のリッターメイトより有意に小さい体重であった（対照マウス２８．７±２．７ｇ及びトランスジェニックマウス２５．９±３．４ｇ、ｐ<０．０５）(図４Ａ）。この相違はエネルギー消費の制御におけるＵＣＰの生理学的機能に基づいて、トランスジェニックマウスにおけるエネルギー消費の増加の結果かもしれない。なお統計的比較はStudent's t-test を用いて行なった。統計的有意性をｐ＜０．０５として定義した（以下同じ）。
【００２９】ＢＡＴの組織学的分析マウスを左心室を介してＰＢＳ、その後に４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で灌流し、次にＢＡＴを除去し、パラフィンに埋め込んだ。脱パラフィンしたセクションをヘマトキシン及びエオシンで染色するか、免疫組織化学的方法で染色した。免疫パーオキシダーゼ染色は以前に報告されたＵＣＰ−１に対するポリクローナル抗体を用いて行なった。簡単に言えば、内因性のパーオキシダーゼ活性を、メタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２中で２０分間インキュベートすることによってブロックした。次に、一次抗体、即ち抗−ＵＣＰ−１抗体と共に８時間、４℃でインキュベートした後、組織セクションを１０分間２％の正常なヤギ血清にさらした。そのＵＣＰ−１抗体を使用のためＰＢＳで１：５００で希釈した。セクションを次にビオチニル化ヤギ抗ラビットＩｇＧ二次抗体と１０分間インキュベートした。そのセクションをアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）と次に５分間インキュベートし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の０．５ｍｇ／ｍｌの３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（Sigma, St. Louis, MO, USA）及び３μl／ｍｌＨ２Ｏ２での処理により視覚化した。各工程の間に、セクションをＰＢＳ中で３回洗浄した。免疫組織化学的特異性の対照として、抗−ＵＣP−１抗血清の代わりに同じ希釈度で正常なラビット血中でインキュベートしたセクションは認識し得るシグナルを与えなかった。脂肪滴及び核の数、又はＢＡＴの脂肪滴の平均直径は組織学的セクションの６つの顕微鏡的視野の計数又は測定に基づく。
【００３０】ＰＧＣ−１トランスジェニックマウスは非トランスジェニックマウスリッターメイト対照より大きいＢＡＴ質量を有する（図３Ａ，１２週齢でＰＧＣ−１トランスジェニックマウスにおいては０．７３±０．１４ｇ及び対照マウスでは０．４９±０．１２ｇ、ｐ<０．０５）。組織学的には対照マウスのＢＡＴは典型的な褐色脂肪細胞を示したが、対照的にＰＧＣ−１トランスジェニックＢＡＴ細胞は多数の細胞質の脂肪滴を有していた（図３Ｂ及びＣ）。これらの脂肪滴は、対照マウスに存在するものより小さく、（図３Ｄ，脂肪滴の平均直径：ＰＧＣ−１トランスジェニックマウスにおいては４．２±１．８μｍ及び対照マウスでは１０±３．２μｍ、ｐ<０．０５）、数が多い（図３Ｅ，ＰＧＣ−１トランスジェニックマウスにおいては細胞あたり１４．７±３．９脂肪滴及び対照マウスでは細胞あたり９．６±２．１脂肪滴、ｐ<０．０５）。これらはＰＧＣ−１トランスジェニックマウスのＢＡＴは活動亢進性の呼吸を行なっていることを示唆する。事実、ＵＣＰ−１タンパク質の発現は、ＵＣＰ−１タンパク質の免疫組織化学的分析により判断して、対照マウスのそれに比べＰＧＣ−１トランスジェニックマウスのＢＡＴセクションで有意に上昇した（図３、Ｃ）。
【００３１】（３−２）トランスジェニックマウスにおけるＰＧＣ１発現量ＰＧＣ−１導入遺伝子の発現をノーザンブロット分析により最初に評価した。ノーザンブロッティングは以前に記載されたように行なった（２４）グアニジンイソシアネートによる抽出、その後の５．７Ｍ ＣｓＣｌの層での遠心分離により細胞及びマウス組織から全ＲＮＡを単離した。２０μｇの全ＲＮＡを電気泳動により分離し、次にナイロン膜（アマーシャムファルマシアバイオテク、東京）に移した。その膜を、０．６５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＰＩＰＥＳナトリウム、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ＳＤＳ，ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、及びFicoll ４００各０．１％、並びにコウシの胸腺ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを含む５０％ホルムアミド中で４２℃で６時間予備ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはランダムプライマー−標識ｃＤＮＡプローブの存在下に同じ条件で一晩行なった。ハイブリダイゼーションの後、膜を２時間、６５℃で洗浄用緩衝液（０．２％ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で一定速度で攪拌しながら洗浄し、次にオートラジオグラフィーに付した。定量的な分析は、イメージアナライザー（ＦＬＡ２０００，富士フィルム）を用いて行なった。
【００３２】図２Ａは、８週齢のＰＧＣ−１トランスジェニックマウス（ラインＡ１）及び対照のリッターメイトマウスの組織から単離された全ＲＮＡに対するＰＧＣ−１プローブとのハイブリダイゼーションの強度を示す。導入遺伝子特異的なプローブ（図１Ａ，プローブ２）を用いた時、３ｋｂのバンド（矢印で示す）のみが検出された。ＣＡＧプロモーターはユビキタスな組織で活性が強いことが報告されている。しかしがら、予期しないことに、このプロモーターはＢＡＴ，心臓、腎臓、骨格筋等のいくつかの限られた組織ではＰＧＣ−1導入遺伝子を高発現するが、例えば肝臓中では低発現である（図２Ａ）。これらの発現プロフィールは内因性のＰＧＣ−１発現パターンによく対応する（図２Ａ）。この観察はＰＧＣ−１発現についての重要な組織特異的な調節シス因子が使用したＰＧＣ−１ｃＤＮＡにあるかもしれないことを示唆する。２つの独立なトランスジェニックライン（図１Ｂ，ラインＡ１及びＡ２）は類似の発現パターンを示し、導入遺伝子発現はマウスゲノムにおける挿入部位により大きく影響されないことを示唆する。
【００３３】（３−３）トランスジェニックマウスにおけるＵＣＰの発現量トランスジェニックマウス及び対照マウスの様々な組織におけるＵＣＰの発現に及ぼすＰＧＣ−１遺伝子発現の影響を調べた。この目的に、ＰＧＣ−１トランスジェニックマウス及びリッターメイト対照中のＵＣＰの発現をノーザンブロット分析により比較した。同じブロットを放射標識したＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、及びＵＣＰ−３ｃＤＮＡと一つづつハイブリダイズさせた（図２Ｂ−Ｅ）。
【００３４】マウスＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デハイドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｃＤＮＡ断片はマウスのＢＡＴ全ＲＮＡを用いる第１鎖ｃＤＮＡからポリメラーゼチエイン反応により得た。第１鎖ｃＤＮＡはＴ−プライムドファーストストランドキット（アマーシャムファルマシアバイオテク、東京）を用いて調製した。使用したポリメラーゼチエイン反応のプライマーは以下のようである。
【００３５】ＵＣＰ−１(Genbank Accession, U63419)（フォワード）5'-ACGCCTCTCTGCCCTCCAAGCCAG-3'（配列番号３）
（リバース）5'-TCAGTATCTCTTCCTCCAAGTTGC-3'（配列番号４）
ＵＣＰ−２(Genbank Accession, U82819)（フォワード）5'-GGGCTGGTGGTGGTCGGAGA-3'（配列番号５）
（リバース）5'-TCAGCATGGAGAGGCTCAGA-3'（配列番号６）
ＵＣＰ−３(Genbank Accession, AF001787)（フォワード）5'-GAGGGACTATGGATGCCTAC-3'（配列番号７）
（リバース）5'-TTGCCTTGTTCAAAACGGAG-3'（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ(Genbank Accession, M32599)（フォワード）5'-TCGTCCCGTAGACAAAATGG -3'（配列番号９）
（リバース）5'-TCTTACTCCTTGGAG GCCAT-3'（配列番号１０）
【００３６】更に、ブロットの長い曝露によりＵＣＰ−１発現は、ＢＡＴ中だけではなく、腎臓及び骨格筋を含む他の組織中でも誘導されることが示された（図２Ｃ）。ＵＣＰ−３のｍＲＮＡレベルは、トランスジェニックマウスのＢＡＴ，心臓、及び骨格筋中で増加した（図２Ｄ）。ＵＣＰ−２のｍＲＮＡの発現は心臓において野性型のそれの５６％まで減少し、骨格筋で僅かに増加した。（図２Ｅ）。ＰＧＣ−１トランスジェニックマウスのＢＡＴ中でのＵＣＰ−１のｍＲＮＡの誘導は、寒冷条件に曝露された場合の非トランスジェニックマウスのＢＡＴ中でのＵＣＰ−１のｍＲＮＡの誘導に匹敵するか、又はそれより大きい。これらのデータは生理学的に有意な量の機能的なＰＧＣ−１タンパク質がトランスジェニックマウスのＢＡＴで導入遺伝子から製造されることを示唆する。
【００３７】（３−４）トランスジェニックマウスにおけるエネルギー消費量酸素消費量及び二酸化炭素生成量を質量分析器及びコンピューターに結合した間接熱量計システムを用いて測定した。マウスをガス質量分析器（ＷＳＭＲ−１４００，Westron、Chiba, Japan）に連結したオープンサーキットのプラスチックの呼吸チャンバー（２４ｘ４６ｘ１８ｃｍ）に個別に置いた。空気流を２L／分に調節した。ガス分析を１０時から翌日の９時まで行なった。試料を対照としての部屋の空気中で２分ブロックで連続的にモニターした。運動活性を各呼吸チャンバーの下に置いたAnimex−III（Shimazu, Kyoto, Japan）により１０分ごとに自動的に記録した。エネルギー消費を計算した（Komenami, N. , J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo), 41:395-407)。生理学的測定についてのデータは雄のマウスから得た。雌のマウスからも同様の結果を得た。
【００３８】ＰＧＣ−１トランスジェニックマウスのエネルギー消費は１２週齢で対照マウスより有意に大きかった。（静止エネルギー消費：対照マウス７５．８±２．４ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５及びＰＧＣ−１トランスジェニックマウス９４．９±５．７ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５；自由運動状態を含む全エネルギー消費：対照マウス１４３±２．０ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５及びＰＧＣ−１トランスジェニックマウス１６５±６．６ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５、ｐ<０．０５）（図４、Ｂ及びＣ）。これらの結果は対照及びトランスジェニックマウス間の体重差はそれらのエネルギー消費の差によることを示唆する。
【００３９】実施例４ＰＰＡＲγをコードするベクター(ｐＣＭＸ-ＰＰＡＲγ)の構築(１)ＰＰＡＲγ１の遺伝子の単離ＰＰＡＲγ１のｃＤＮＡを、マウス脂肪細胞から調製したＲＮＡからの逆転写反応により得られたｃＤＮＡから、ＰＣＲ法によって取得した。ＰＣＲにはプライマーとして以下の配列番号１１及び１２に示した配列を用いた、これらプライマーは、遺伝子データベースGenbankのアクセッション番号MMU09138に記載されたマウスＰＰＡＲγの遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、ベクターに挿入するための制限酵素認識部位を付加した。得られた1518塩基対断片は完全長のマウスＰＰＡＲγをコードしている。
配列番号１１：ＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡ配列番号１２：ＣＴＡＡＴＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＡ(２)ＰＰＡＲγ蛋白質発現するためのプラスミドの構築このＰＰＡＲγ ｃＤＮＡは平滑末端処理し、ｐＣＭＸ(Formanら、Cell、第83巻、第803〜812頁)をＨｉｎｄIII認識部位によって切断し、平滑末端処理したベクターに挿入した。これによりＰＰＡＲγの蛋白質を発現するためのプラスミドｐＣＭＸ-ＰＰＡＲγを得た。
【００４０】実施例５リポータープラスミド (ＰＰＲＥ-ＴＫ-ｌｕｃ)の構築PPARγが結合する配列ＰＰＲＥ（配列番号１３）（Kliever SAら、Nature, 358: 771-754)および、相補鎖（配列番号１４）のオリゴヌクレオチドを合成し、混ぜ合わせ、チミジンキナーゼプロモーター（-105/+51)とルシフェラーゼ遺伝子を有するＴＫ-lucベクター（Formanら、Cell、第８３巻、第８０３ー８１２頁）をSalI認識部位によって切断したベクターに挿入した。これによりリポータープラスミドPPRE-ＴＫ-lucを得た。
PPRE配列： TCGAGAGGGAGGAGGACAAAGGTCACGTTCGGGAG （配列番号１３）
PPRE配列（相補鎖）： TCGACTCCCGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCCCCTGT （配列番号１４）
【００４１】実施例６スクリーニング系の構築細胞株ＣＶ-１(大日本製薬(株)製)を用い、これに、ＰＧＳ−１を発現するプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＰＧＣ１（実施例１）、ＰＰＡＲγを発現するｐＣＭＸ-ＰＰＡＲγ（実施例４）、およびリポータープラスミドＰＰＲＥ-ＴＫ-ｌｕｃ（実施例５）でトランスフェクトした。ＣＶ−１細胞を１０％のウシ胎児血清を補ったDulbeccoの改変Eagle培地（ＤＭＥＭ）に維持した。細胞をリン酸塩で緩衝化した生理的食塩水で洗浄し、０．１２５％のトリプシンで処理し、２４ウエルのディシュにプレートした。トランスフェクションの２時間前に培地を５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン及び０．０１％の脂肪酸を含有しないウシ血清アルブミンを補った新鮮なＤＭＥＭで置換した。トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法により行なった。細胞を、２５０ｎｇのリポータープラスミドＰＰＲＥ-ＴＫ-ｌｕｃ、２５０ｎｇの対照プラスミド（ｐＣＭＸ−βｇａｌ）、３０ｎｇのｐＣＭＸ-ＰＰＡＲγ、及び変化させた量（０ｎｇ〜６０ｎｇ）のｐＣＡＧＧＳ−ＰＧＣ１、及びウエルあたり全体で６００ｎｇのＤＮＡとなるような量の空のｐＣＡＧＧＳで、２４ウエル中で６時間トランスフェクションした。ＤＮＡ沈殿物を洗浄除去した後、細胞を血清を含まない培地（ウシ胎児血清を添加しないＤＭＥＭ）で３６時間インキュベートした。次に細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。ルシフェラーゼの活性を比光単位で測定し、β−ガラクトシダーゼ活性でノルマライズした。３回の実験結果を平均し、ＰＧＣ−１の存在しない場合を基準として結果を図５に示す。ＰＧＣ−１が増加するに従ってルシフェラーゼの発現量が増加する。ＰＧＣ−１がＰＰＡＲγと相互作用し、複合体を形成することによって、転写活性が増大したものと考えられる。従って、ある化合物を本発明のスクリーニング系に加えた場合、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子の発現量が増加（減少）したならば、その化合物はＰＧＣ−１とＰＰＡＲγとの相互作用を増大（減少）させた結果であると考えることができる。
【００４２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING〈110〉Osaka Bioscience Institute〈120〉Transgenic Mouse and Method for Screening Anti-obesity Drug〈130〉176973〈160〉【００４３】
〈210〉1〈211〉3029〈212〉DNA〈213〉mouse〈400〉1aattcggcac gaggttgcct gcatgagtgt gtgctgtgtg tcagagtgga ttggagttga 60 aaaagcttga ctggcgtcat tcgggagctg gatggcttgg gacatgtgca gccaagactc 120 tgtatggagt gacatagagt gtgctgctct ggttggtgag gaccagcctc tttgcccaga 180 tcttcctgaa cttgaccttt ctgaacttga tgtgaatgac ttggatacag acagctttct 240 gggtggattg aagtggtgta gcgaccaatc ggaaatcata tccaaccagt acaacaatga 300 gcctgcgaac atatttgaga agatagatga agagaatgag gcaaacttgc tagcggtcct 360 cacagagaca ctggacagtc tccccgtgga tgaagacgga ttgccctcat ttgatgcact 420 gacagatgga gccgtgacca ctgacaacga ggccagtcct tcctccatgc ctgacggcac 480 ccctccccct caggaggcag aagagccgtc tctacttaag aagctcttac tggcaccagc 540 caacactcag ctcagctaca atgaatgcag cggtcttagc actcagaacc atgcagcaaa 600 ccacacccac aggatcagaa caaaccctgc cattgttaag accgagaatt catggagcaa 660 taaagcgaag agcatttgtc aacagcaaaa gccacaaaga cgtccctgct cagagcttct 720 caagtatctg accacaaacg atgaccctcc tcacaccaaa cccacagaaa acaggaacag 780 cagcagagac aaatgtgctt ccaaaaagaa gtcccataca caaccgcagt cgcaacatgc 840 tcaagccaaa ccaacaactt tatctcttcc tctgacccca gagtcaccaa atgaccccaa 900 gggttcccca tttgagaaca agactattga gcgaacctta agtgtggaac tctctggaac 960 tgcaggccta actcctccca caactcctcc tcataaagcc aaccaagata accctttcaa 1020 ggcttcgcca aagctgaagc cctcttgcaa gaccgtggtg ccaccgccaa ccaagagggc 1080 ccggtacagt gagtgttctg gtacccaagg cagccactcc accaagaaag ggcccgagca 1140 atctgagttg tacgcacaac tcagcaagtc ctcagggctc agccgaggac acgaggaaag 1200 gaagactaaa cggcccagtc tccggctgtt tggtgaccat gactactgtc agtcactcaa 1260 ttccaaaacg gatatactca ttaacatatc acaggagctc caagactcta gacaactaga 1320 cttcaaagat gcctcctgtg actggcaggg gcacatctgt tcttccacag attcaggcca 1380 gtgctacctg agagagactt tggaggccag caagcaggtc tctccttgca gcaccagaaa 1440 acagctccaa gaccaggaaa tccgagcgga gctgaacaag cacttcggtc atccctgtca 1500 agctgtgttt gacgacaaat cagacaagac cagtgaacta agggatggcg acttcagtaa 1560 tgaacaattc tccaaactac ctgtgtttat aaattcagga ctagccatgg atggcctatt 1620 tgatgacagt gaagatgaaa gtgataaact gagctaccct tgggatggca cgcagcccta 1680 ttcattgttc gatgtgtcgc cttcttgctc ttcctttaac tctccgtgtc gagactcagt 1740 gtcaccaccg aaatccttat tttctcaaag accccaaagg atgcgctctc gttcaagatc 1800 cttttctcga cacaggtcgt gttcccgatc accatattcc aggtcaagat caaggtcccc 1860 aggcagtaga tcctcttcaa gatcctgtta ctactatgaa tcaagccact acagacaccg 1920 cacacaccgc aattctccct tgtatgtgag atcacgttca aggtcaccct acagccgtag 1980 gcccaggtac gacagctatg aagcctatga gcacgaaagg ctcaagaggg atgaataccg 2040 caaagagcac gagaagcggg agtctgaaag ggccaaacag agagagaggc agaagcagaa 2100 agcaattgaa gagcgccgtg tgatttacgt tggtaaaatc agacctgaca caacgcggac 2160 agaattgaga gaccgctttg aagtttttgg tgaaattgag gaatgcaccg taaatctgcg 2220 ggatgatgga gacagctatg gtttcatcac ctaccgttac acctgtgacg ctttcgctgc 2280 tcttgagaat ggatatactt tacgcaggtc gaacgaaact gacttcgagc tgtacttttg 2340 tggacggaag caatttttca agtctaacta tgcagaccta gataccaact cagacgattt 2400 tgaccctgct tccaccaaga gcaagtatga ctctctggat tttgatagtt tactgaagga 2460 agctcagaga agcttgcgca ggtaacgtgt tcccaggctg aggaatgaca gagagatggt 2520 caatacctca tgggacagcg tgtcctttcc caagactctt gcaagtcata cttaggaatt 2580 tctcctactt tacactctct gtacaaaaat aaaacaaaac aaaacaacaa taacaacaac 2640 aacaacaaca ataacaacaa caaccatacc agaacaagaa caacggttta catgaacaca 2700 gctgctgaag aggcaagaga cagaatgata atccagtaag cacacgttta ttcacgggtg 2760 tcagctttgc tttccctgga ggctcttggt gacagtgtgt gtgcgtgtgt gtgtgtgggt 2820 gtgcgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtactt gtttggaaag tacatatgta cacatgtgag 2880 gacttggggg cacctgaaca gaacgaacaa gggcgacccc ttcaaatggc agcatttcca 2940 tgaagacaca cttaaaacct acaacttcaa aatgttcgta ttctatacaa aaggaaaata 3000 aataaatata aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3029 【００４４】
〈210〉2〈211〉797〈212〉PRT〈213〉mouse〈400〉2Met Ala Trp Asp Met Cys Ser Gln Asp Ser Val Trp Ser Asp Ile Glu 1 5 10 15 Cys Ala Ala Leu Val Gly Glu Asp Gln Pro Leu Cys Pro Asp Leu Pro 20 25 30 Glu Leu Asp Leu Ser Glu Leu Asp Val Asn Asp Leu Asp Thr Asp Ser 35 40 45 Phe Leu Gly Gly Leu Lys Trp Cys Ser Asp Gln Ser Glu Ile Ile Ser 50 55 60 Asn Gln Tyr Asn Asn Glu Pro Ala Asn Ile Phe Glu Lys Ile Asp Glu 65 70 75 80Glu Asn Glu Ala Asn Leu Leu Ala Val Leu Thr Glu Thr Leu Asp Ser 85 90 95 Leu Pro Val Asp Glu Asp Gly Leu Pro Ser Phe Asp Ala Leu Thr Asp 100 105 110 Gly Ala Val Thr Thr Asp Asn Glu Ala Ser Pro Ser Ser Met Pro Asp 115 120 125 Gly Thr Pro Pro Pro Gln Glu Ala Glu Glu Pro Ser Leu Leu Lys Lys 130 135 140 Leu Leu Leu Ala Pro Ala Asn Thr Gln Leu Ser Tyr Asn Glu Cys Ser 145 150 155 160Gly Leu Ser Thr Gln Asn His Ala Ala Asn His Thr His Arg Ile Arg 165 170 175 Thr Asn Pro Ala Ile Val Lys Thr Glu Asn Ser Trp Ser Asn Lys Ala 180 185 190 Lys Ser Ile Cys Gln Gln Gln Lys Pro Gln Arg Arg Pro Cys Ser Glu 195 200 205 Leu Leu Lys Tyr Leu Thr Thr Asn Asp Asp Pro Pro His Thr Lys Pro 210 215 220 Thr Glu Asn Arg Asn Ser Ser Arg Asp Lys Cys Ala Ser Lys Lys Lys 225 230 235 240Ser His Thr Gln Pro Gln Ser Gln His Ala Gln Ala Lys Pro Thr Thr 245 250 255 Leu Ser Leu Pro Leu Thr Pro Glu Ser Pro Asn Asp Pro Lys Gly Ser 260 265 270 Pro Phe Glu Asn Lys Thr Ile Glu Arg Thr Leu Ser Val Glu Leu Ser 275 280 285 Gly Thr Ala Gly Leu Thr Pro Pro Thr Thr Pro Pro His Lys Ala Asn 290 295 300 Gln Asp Asn Pro Phe Lys Ala Ser Pro Lys Leu Lys Pro Ser Cys Lys 305 310 315 320Thr Val Val Pro Pro Pro Thr Lys Arg Ala Arg Tyr Ser Glu Cys Ser 325 330 335 Gly Thr Gln Gly Ser His Ser Thr Lys Lys Gly Pro Glu Gln Ser Glu 340 345 350 Leu Tyr Ala Gln Leu Ser Lys Ser Ser Gly Leu Ser Arg Gly His Glu 355 360 365 Glu Arg Lys Thr Lys Arg Pro Ser Leu Arg Leu Phe Gly Asp His Asp 370 375 380 Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Ser Lys Thr Asp Ile Leu Ile Asn Ile Ser 385 390 395 400Gln Glu Leu Gln Asp Ser Arg Gln Leu Asp Phe Lys Asp Ala Ser Cys 405 410 415 Asp Trp Gln Gly His Ile Cys Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gln Cys Tyr 420 425 430 Leu Arg Glu Thr Leu Glu Ala Ser Lys Gln Val Ser Pro Cys Ser Thr 435 440 445 Arg Lys Gln Leu Gln Asp Gln Glu Ile Arg Ala Glu Leu Asn Lys His 450 455 460 Phe Gly His Pro Cys Gln Ala Val Phe Asp Asp Lys Ser Asp Lys Thr 465 470 475 480Ser Glu Leu Arg Asp Gly Asp Phe Ser Asn Glu Gln Phe Ser Lys Leu 485 490 495 Pro Val Phe Ile Asn Ser Gly Leu Ala Met Asp Gly Leu Phe Asp Asp 500 505 510 Ser Glu Asp Glu Ser Asp Lys Leu Ser Tyr Pro Trp Asp Gly Thr Gln 515 520 525 Pro Tyr Ser Leu Phe Asp Val Ser Pro Ser Cys Ser Ser Phe Asn Ser 530 535 540 Pro Cys Arg Asp Ser Val Ser Pro Pro Lys Ser Leu Phe Ser Gln Arg 545 550 555 560Pro Gln Arg Met Arg Ser Arg Ser Arg Ser Phe Ser Arg His Arg Ser 565 570 575 Cys Ser Arg Ser Pro Tyr Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Gly Ser 580 585 590 Arg Ser Ser Ser Arg Ser Cys Tyr Tyr Tyr Glu Ser Ser His Tyr Arg 595 600 605 His Arg Thr His Arg Asn Ser Pro Leu Tyr Val Arg Ser Arg Ser Arg 610 615 620 Ser Pro Tyr Ser Arg Arg Pro Arg Tyr Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Glu 625 630 635 640His Glu Arg Leu Lys Arg Asp Glu Tyr Arg Lys Glu His Glu Lys Arg 645 650 655 Glu Ser Glu Arg Ala Lys Gln Arg Glu Arg Gln Lys Gln Lys Ala Ile 660 665 670 Glu Glu Arg Arg Val Ile Tyr Val Gly Lys Ile Arg Pro Asp Thr Thr 675 680 685 Arg Thr Glu Leu Arg Asp Arg Phe Glu Val Phe Gly Glu Ile Glu Glu 690 695 700 Cys Thr Val Asn Leu Arg Asp Asp Gly Asp Ser Tyr Gly Phe Ile Thr 705 710 715 720Tyr Arg Tyr Thr Cys Asp Ala Phe Ala Ala Leu Glu Asn Gly Tyr Thr 725 730 735 Leu Arg Arg Ser Asn Glu Thr Asp Phe Glu Leu Tyr Phe Cys Gly Arg 740 745 750 Lys Gln Phe Phe Lys Ser Asn Tyr Ala Asp Leu Asp Thr Asn Ser Asp 755 760 765 Asp Phe Asp Pro Ala Ser Thr Lys Ser Lys Tyr Asp Ser Leu Asp Phe 770 775 780 Asp Ser Leu Leu Lys Glu Ala Gln Arg Ser Leu Arg Arg 785 790 795 【００４５】
〈210〉3〈211〉24〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence〈400〉3acgcctctct gccctccaag ccag 24 【００４６】
〈210〉4〈211〉24〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence 〈400〉4tcagtatctc ttcctccaag ttgc 24 【００４７】
〈210〉5〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence 〈400〉5gggctggtgg tggtcggaga 20 【００４８】
〈210〉6〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence〈400〉6tcagcatgga gaggctcaga 20 【００４９】
〈210〉7〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence 〈400〉7gagggactat ggatgcctac 20 【００５０】
〈210〉8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence 〈400〉8ttgccttgtt caaaacggag 20 【００５１】
〈210〉9〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence 〈400〉9tcgtcccgta gacaaaatgg 20 【００５２】
〈210〉10〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial Sequence 〈400〉10tcttactcct tggaggccat 20 【００５３】
<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for PPARgamma<400> 11atgggtgaaa ctctgggaga 20 【００５４】
<210> 12<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for PPARgamma<400> 12ctaatacaag tccttgtaga 20 【００５５】
<210> 13<211> 35<212> DNA<213> Artificial Sequence<223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for PPARgamma<400> 13tcgagaggga ggaggacaaa ggtcacgttc gggag 35 【００５６】
<210> 14<211> 37<212> DNA<213> Artificial Sequence<223> Description of Artificial Sequence: primer sequence for PPARgamma<400> 14tcgactcccg aacgtgacct ttgtcctggt cccctgt 37 |
| 【出願人】 |
【識別番号】３９００００７４５
【氏名又は名称】財団法人大阪バイオサイエンス研究所
|
| 【出願日】 |
平成１３年４月６日（２００１．４．６） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６２１４４
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 葆 （外２名）
|
| 【公開番号】 |
特開２００２−３０６０２１（Ｐ２００２−３０６０２１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年１０月２２日（２００２．１０．２２） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−１０８６２９（Ｐ２００１−１０８６２９） |
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