トランスジェニック哺乳動物

トップ :: A 生活必需品 :: A01 農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業

【発明の名称】	トランスジェニック哺乳動物
【発明者】	【氏名】村上博【氏名】藤村達也【氏名】高萩陽一【氏名】豊村浩司【氏名】重久保
【要約】	【課題】臓器移植に好適に利用されるトランスジェニック哺乳動物を提供する。【解決手段】本発明は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子からなる導入遺伝子、または当該調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子とヒト補体制御因子の遺伝子からなる導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物である。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細胞のα-Gal抗原を減少している、またはα-Gal抗原を減少すると共にヒト補体制御因子発現しており、Discordant異種移植において問題となる超急性拒絶反応を抑制する上で非常に有効である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子からなる導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２】超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子及びヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子、並びに、ヒトの補体活性制御因子の遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３】補体制御因子が、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＭＣＰ、C1-インヒビター、C4バインディングプロテイン、H因子、I因子またはこれらの改変型補体制御因子である請求項２記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４】超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子が、β-アクチンのプロモーター、エンドセリンのプロモーター、トロンボモジュリンのプロモーター、ブタ補体制御因子(pMCP)のプロモーター、アルブミンのプロモーター、インスリンのプロモーター、エロンゲーションファクターのプロモーター、サイトメガロウイルスのエンハンサー及び／又はヒトDAF遺伝子の第一イントロンである請求項１～３の何れかに記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５】トランスジェニック哺乳動物が、家畜又は実験動物である請求項１～４の何れかに記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６】トランスジェニック哺乳動物が、トランスジェニックブタ又はトランスジェニックマウスである請求項５記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７】ヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIを発現するトランスジェニック哺乳動物とヒトの補体制御因子を発現するトランスジェニック動物を個別に作製し、両者を交配することによりヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の作製方法。

【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はトランスジェニック哺乳動物に関する。より詳細には、本発明はヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子を有しα-ガラクトース抗原を減少しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。更に、本発明はヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIの遺伝子を有しα-ガラクトース抗原を減少すると共に、ヒトの補体制御因子の遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】臓器移植は極めて有用な根治療法であり、近年、臓器の機能不全を治療するために腎臓移植、肝臓移植、心臓移植等の臓器移植が行われている。臓器移植には、同種移植（ドナーとレシピエントが同一の種に属する場合）と異種移植（ドナーとレシピエントが異なる種に属する場合）があり、各々長所と短所を併有している。同種移植は異種移植に比べて拒絶反応等の問題は少ないが、ヒトがレシピエントの場合には、ドナーの数に限りがあるという欠点がある。これに対し、近年、動物の臓器をヒトに移植する（異種移植）ための研究が欧米を中心に盛んに行われている。臓器を提供するドナー動物としては、ヒトに最も近い点でサルが好ましいが、サルは希少で知性の高い野生動物であることから、サルの利用は困難な状況にある。そこで、家畜、中でも臓器サイズ、形態がヒトに近く、繁殖や増産技術の確立しているブタの臓器を利用するための研究が行われるようになってきた。なお、異種移植のうち、近縁種間（例えば、ヒヒ－ヒト間）の移植はConcordant異種移植と呼ばれ、遠縁種間（例えば、ブタ－ヒト間）の移植はDiscordant異種移植と呼ばれている。
【０００３】ブタ－ヒト間のDiscordant異種移植の場合には、移植片は分単位で拒絶される。このような現象は超急性拒絶と呼ばれている。この超急性拒絶はヒト血清中の自然抗体がブタ移植片（臓器、組織、細胞など）の異種抗原と反応し、補体依存性細胞障害反応（補体反応）を惹起することにより生じる。異種抗原として最も重要視されている物は、ブタの細胞の糖鎖（糖タンパク質、糖脂質）の非還元末端に存在するGalα1,3Gal配列（以下、α-Gal抗原）であるとされている。α-Gal抗原はα-1,3-ガラクトース転移酵素（以下、α-1,3GT）の作用によりN-アセチルラクトサミン構造にガラクトースがα1,3結合されて合成される（図1参照）。一方、ヒト組織はα-Gal抗原を発現していない。哺乳類のうち今から2000万～3000万年前以降に系統発生した旧世界サル（アジア、アフリカに生息する）、類人猿（チンパンジー、ゴリラ、オランウータン）及びヒトの場合には、α-Gal抗原をつくり出すα-1,3GT遺伝子は点変異により生じたフレームシフトによって偽遺伝子（pseudogene）となっており（J. Biol. Chem., 265: 7055-7061 (1990)）、逆に、この糖鎖抗原に対して強い自然抗体をもっている。ヒトIgGの1％は、このα-Gal抗原に対する抗体であると言われている（Blood, 82: 2485-2493 (1993)）。
【０００４】一方、何らかの方法で超急性拒絶を克服した場合でも、移植数日後から数週間後には、血管内皮細胞の浮腫、虚血、血栓を特徴とする移植片の機能不全が生じる。組織学的には、血小板凝集、フィブリン沈着、血管内皮の活性化、活性化したマクロファージとＮＫの湿潤が生じる。このような現象は、急性血管型拒絶(AVR)または遅延型異種移植片拒絶(DXR)と呼ばれている。AVRが生じる原因として、異種抗原、補体、マクロファージ、NK細胞、好中球、血小板などが関与すると言われている。
【０００５】前述の超急性拒絶を回避する方法には、大別すれば、移植レシピエントに対する処置とドナーに対する処置がある。前者の例としては移植レシピエント血液中の自然抗体を免疫カラム等に吸着除去させる方法が挙げられ、後者の例としては補体反応を抑制する補体制御因子、特に移植レシピエントの動物種に由来する補体制御因子をドナー動物に発現させる方法、ドナー動物のα-Gal抗原自体を減少させる方法などが挙げられる。しかし、移植レシピエント血液中の自然抗体を完全に除去することは困難であるから、ドナーに対する処置が一般的に行われている。なお、異種抗原はAVRの惹起にも関与していると考えられているから、α－抗原の消滅はAVRの遅延又は回避の方策としても有効であろうと考えられている。
【０００６】上記のドナー動物のα-Gal抗原を減少させるための方法としては次のようなものが知られている。
（1）糖鎖末端のα-Gal抗原のα-ガラクトシド結合を切断するα-ガラクトシダーゼを作用させて、α-Gal抗原を減少させる方法この方法においては、従来から知られているコーヒー豆由来のα-ガラクトシダーゼが使用されるが、当該酵素の至適pHは6～6.5なので、生理的条件下でα-Gal抗原を除去させることは不可能であった。
【０００７】（2）α-Gal抗原の生成に係わるα-1,3GT遺伝子をノックアウト(KO)する方法α-1,3GT遺伝子KOマウスは作製されたが（Transplantation, 61：13-19 (1996)）、当該マウスは白内障を発症した。ブタの組織はマウスの組織以上に多量のα-Gal抗原を発現しているから、ブタのα-1,3GT遺伝子をKOした場合、ブタ生体への悪影響はマウス以上に大きいと考えられている。また、KOブタの作製に必要とされるブタの胚性幹（ES）細胞株が樹立されていないので、KOブタの作製自体が不可能であった。
【０００８】（3）α-1,3GTと基質（N-アセチルラクトサミン構造）が同一であるα-1,3GT以外の糖転移酵素を遺伝子導入してα-Gal抗原の発現を競合阻害させる方法（図1参照）α-1,3GTにより合成される糖鎖末端のα-Gal抗原（Galα1,3Gal配列）中のガラクトースをフコースに変換するために、α-1,2フコース転移酵素（α-1,2FT）遺伝子を導入して血液型H物質とする方法（WO095/34202A1）などが報告された。これらの方法では糖鎖非還元末端のガラクトースが他の糖に変換されるので、当該糖鎖のα-Gal抗原は消失する。しかし、導入遺伝子の発現量が内在性のα-1,3GT遺伝子の発現量を超越しない限り、細胞全体としてのα-Gal抗原の減少量は軽度であった。また、後述のN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIとは異なり、糖鎖の分岐本数自体及び細胞全体の糖鎖本数には変化を生じなかった。
【０００９】（4）N-結合型糖鎖の分岐の生成を阻害するN-アセチルグルコサミン転移酵素III（β-D-mannoside β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III, EC 2.4.1.144；以下、GnT-III）を強制発現させる方法GnT-IIIを強制発現させることにより、糖鎖の分岐を抑制し、ひいてはα-Gal抗原の減少を図る方法であり、以下図２を参照しながら、糖鎖の分岐機構とGnT-IIIによる糖鎖の分岐抑制の作用点を説明する。糖鎖はN-結合型糖鎖、O-結合型糖鎖、糖脂質糖鎖に大別される。各糖鎖にはそれぞれコア構造が存在し、そのコア構造から末端へ向かって糖鎖は伸長するが、α1-3ガラクトースが付加すると糖鎖の伸長は止まる。同様に、上述のα-1,2FTなどの糖転移酵素もN-アセチルラクトサミン構造を基質として糖鎖の伸長を止めるので、これらの糖転移酵素はα-1,3GTと拮抗関係にある（図１参照）。一方、GnT-IIIは他のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）転移酵素とともにN-結合型糖鎖のコア構造の形成に関与しており、先の糖転移酵素のようにα-1,3GTと基質を競合しない。N-結合型糖鎖はそのコア構造の分岐の度合いによって二本鎖、三本鎖、四本鎖として区分される。図２に示されるように、三本鎖、四本鎖糖鎖は前駆構造である二本鎖にGnT-IV及びGnT-Vが作用して分岐が導入されることによって合成される。なお、二本鎖の糖鎖は、N-結合型糖鎖のコアにGnT-I及びGnT-IIが作用して合成される。GnT-IIIによってコア構造のβマンノース（βMan）に付加されるGlcNAcからは鎖の伸長が起きないので、他のGlcNAcとは区別され、バイセクティング（bisecting）GlcNAcと呼ばれる。このbisecting GlcNAcが三本鎖、四本鎖構造に分岐する前の二本鎖構造に付加されると、GnT-IV及びGnT-Vがその構造を基質とすることができず、三本鎖、四本鎖糖鎖の合成が阻害される。図２において、四角の付された矢印は酵素反応が阻害されることを示す。また、bisecting GlcNAcを持つ二本鎖糖鎖を基質にする場合には、α-Gal抗原の合成に係わるβ-ガラクトシル化反応及びα-ガラクトシル化反応も低下し、α-Gal抗原自体も減少する（Glycobiol., 6: 691-694 (1996)）。要約すれば、GnT-IIIを強制発現させることによって、糖鎖の分岐数及び各分岐当たりのα-Gal抗原の数を減少させることができ、細胞全体の糖鎖本数及びα-Gal抗原を減少させることができる。
【００１０】GnT-III遺伝子を導入したトランスジェニック動物としては、ラットGnT-IIIのcDNAの上流にβ-アクチン・プロモーターとサイトメガロウイルス・エンハンサーを結合した導入用遺伝子を用いてトランスジェニックマウスが作出された（Transplant. Proc., 29: 895-896 (1997)）。当該トランスジェニックマウスの心臓、肺と肝臓では、通常マウスの臓器に比べて、GnT-IIIの比活性が上昇し、α-Gal抗原は減少した。しかし、腎臓におけるGnT-IIIは、通常マウスでも高発現しており（3,400 p mol/h/mg protein）、当該トランスジェニックマウスでは更に高発現したが（4,800 p mol/h/mg）、α-Gal抗原は減少しなかった。このように、当該トランスジェニックマウスはラットGnT-III遺伝子を有するものの、必ずしも総ての臓器において、特に腎臓において、α-Gal抗原を減少することはできなかった。
【００１１】一方、GnT-III遺伝子を導入したトランスジェニックブタは知られていなかった。α-Gal抗原は有袋哺乳類と霊長類を除く胎生哺乳類の細胞膜上に発現しているが、ブタ臓器に発現しているα-Gal抗原の量は特に多く、例えばブタ腎臓に発現しているα-Gal抗原量はラット腎臓に発現しているα-Gal抗原量の500～1000倍であると言われており、ブタの発生及び生存上必須であるとも、細菌の受容体をマスクして感染を防御しているとも考えられている（細胞工学, 19: 830-834(2000)）。また、後述するように、通常ブタの場合、腎臓を含む多くの臓器でGnT-IIIを発現していない。従って、ブタの臓器、組織または細胞に人為的にGnT-IIIを発現させα-Gal抗原を減少させることがブタの発生や生存に悪影響を生じるか否かは知られていなかった。また、導入遺伝子を構築する際に用いられるプロモーターのうち、狙いとする構造遺伝子をマウスで発現させることができても、ブタでは発現させられないプロモーターのあることが知られている（例えば、Theriogenol. 51: 422 (1999)）。このようなことから、ブタにヒトのGnT-III遺伝子を効率よく発現させるための遺伝子プロモーターは知られていなかった。より詳細には、（1）GnT-III遺伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生存トランスジェニックブタ産仔が得られるか否か、（2）ヒトGnT-III遺伝子を導入したトランスジェニックブタが得られた場合でも、その臓器でGnT-IIIが発現しα-Gal抗原量を減少させるか否か、（3）１動物個体中にGnT-III遺伝子と共にそれ以外の1以上の導入遺伝子を共発現させようとする場合に、生存トランスジェニックブタ産仔が得られるか否か、（4）当該トランスジェニックブタの臓器がヒトGnT-III遺伝子を発現すると共にα-Gal抗原を減少させ、更にGnT-III遺伝子以外の1以上の当該導入遺伝子を発現させ得るか否か、特に、(5)糖鎖修飾酵素をコードするGnT-III遺伝子と共に発現させる１以上の遺伝子が糖蛋白質（例えば、ヒトのDAF）である場合、糖鎖修飾酵素GnT-IIIの発現が糖蛋白質（例えば、ヒトのDAF）の発現に何らかの障害を生じるのか否か、は知られていなかった。
【００１２】超急性拒絶は局所の細胞（例えば、血管内皮細胞）で起こるから、超急性拒絶の生じる局所の細胞のN-結合型糖鎖の分岐数が少なく、α-Gal抗原の少ないトランスジェニック哺乳動物の作製が待ち望まれていた。また前述のように、超急性拒絶は補体依存性細胞障害反応（補体反応）を惹起することにより生じるから、当該補体反応を抑制するために、α-Gal抗原の少ないことに加えて、移植レシピエント種の補体反応を抑制する補体制御因子（レシピエントがヒトの場合にはヒト補体制御因子）を発現しているトランスジェニック哺乳動物が望まれていた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、本発明の第１の目的は、超急性拒絶の生じる局所の細胞でN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物（特にトランスジェニックブタ）を提供することにある。また、本発明の第２の目的は、超急性拒絶の生じる局所の細胞でN-結合型糖鎖の分岐数及びα-ガラクトース抗原を減少すると同時に、ヒトの補体制御因子を発現しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物（特にトランスジェニックブタ）を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するためになされた本発明は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とヒトのN-アセチルグルコサミン転移酵素III（以下、GnT-III）の遺伝子からなる導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物である（以下、便宜上第１の発明という）。係るトランスジェニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細胞でN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原が減少しているという特長を有する。また、本発明の他の発明は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とGnT-IIIの遺伝子、並びにヒトの補体制御因子の遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物である（以下、便宜上第２の発明という）。係るトランスジェニック哺乳動物は、α-Gal抗原を減少していると共にヒトの補体制御因子を発現しているという特長を有している。更に、本発明は、GnT-IIIを発現するトランスジェニック哺乳動物とヒトの補体制御因子を発現するトランスジェニック動物を個別に作製し、両者を交配することによりGnT-III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の作製方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】上記のように、本発明の第１の発明は、GnT-IIIの遺伝子を有し、超急性拒絶の生じる局所の細胞におけるN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物である。また、本発明の第２の発明は、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子とGnT-IIIの遺伝子、並びにヒトの補体制御因子の遺伝子を有し、N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少していると共にヒトの補体制御因子を発現しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物及びその製造方法を提供する。本発明における哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されず、各種の家畜、実験動物などが例示され、より具体的には、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、前述のようにヒトへの臓器移植に際してはブタが好適である。
【００１６】N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少させるために、本発明はヒトのGnT-IIIの遺伝子を用いる。該遺伝子は公知であり、ヒトのGnT-IIIを挿入した導入用ベクター（J. Biochem. 113: 692-698 (1993)）から適切なプライマーを用いてPCRで増幅して調製することもできる。なお、N-結合型糖鎖とはペプチド鎖中のアスパラギンの側鎖アミド基に糖鎖還元末端のGlcNAcがN-グリコシド結合で結合している糖鎖のことで、ペプチド鎖中のセリン又はスレオニンの水酸基に糖鎖還元末端が結合するO-型糖鎖や糖脂質糖鎖とは区別される。なお、ブタ血管内皮細胞においては、ヒト自然抗体が反応する主な標的はN-結合型糖鎖であるから（Transplantation, 50: 817-822 (1990)）、本発明の趣旨であるGnT-IIIの発現によるN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の減少は、超急性拒絶の軽減に有効である。
【００１７】本発明で用いる補体制御因子の遺伝子としては、DAF（CD55）、CD59、MCP(CD46)等のヒトの補体制御因子の遺伝子を用いることができ、係る遺伝子は既に公知である。なお、MCPの場合には、MCP分子のうち麻疹ウイルスの受容体としての機能を有するショートコンセンサスリピート（SCR）1を欠損させた蛋白質をコードする遺伝子、又はMCP分子のうちSCR1を欠損させると共に細胞膜貫通領域及び細胞内領域を欠損させ、代わりにグリコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）アンカーを付すべくシグナルペプチドを有するように改変された蛋白質をコードする遺伝子（特願2000-131862）を用いることもできる。また、補体制御因子の機能を有する限り、DAF（CD55）、CD59、MCP(CD46)のような膜結合型補体制御因子及びその機能を保持する改変型分子をコードする遺伝子に加えて、C1-インヒビター、C4バインディングプロテイン、H因子、I因子のような血液中を循環している可溶性補体制御因子を膜結合型に改変した改変型補体制御因子をコードする遺伝子を用いることもできる。後記の実施例が示すように、超急性拒絶の生じる局所の細胞においてN-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原を減少させることに加えて、ヒトの補体制御因子を発現させることによって、超急性拒絶による補体依存性細胞障害を相乗的に軽減させることができる。
【００１８】GnT-IIIの遺伝子及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子を超急性拒絶の生じる局所の細胞に発現させるために、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子が使用される。当該調節遺伝子としては、超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している蛋白質をコードしている遺伝子の調節遺伝子を用いることが好ましい。ここで「調節遺伝子」とは、遺伝子転写効率の増減に働くDNA上の配列を意味し、プロモーター、エンハンサー、上流活性化配列、サイレンサー、上流抑制配列、及びアテニュエーター等が含まれるが、これらに限定されない。上記のプロモーターとしては、GnT-III及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子を超急性拒絶の生じる局所の細胞で発現させ得るプロモーターであれば特に限定されず、例えば、β-アクチンのプロモーター、アルブミンのプロモーター、インスリンのプロモーター、エロンゲーションファクターのプロモーター、血管内皮細胞が関与する蛋白質であるエンドセリンやトロンボモジュリンのプロモーターなどが例示できる。なお、移植ドナー動物に目的の蛋白質を発現させるためのプロモーターとしては、移植ドナーの動物種に由来するプロモーターが好ましく、トランスジェニック哺乳動物がブタの場合には、ブタ補体制御因子(pMCP)のプロモーター（特開平10-66584号公報）がより好適に用いられる。ただし、後記の実施例から、β-アクチンのプロモーターはGnT-IIIをブタ血管内皮細胞に効率良く発現させ得ることが明らかにされた。上述のエンハンサーとしては、GnT-III及び／又はヒトの補体制御因子の遺伝子を超急性拒絶の生じる局所の細胞で発現させ得るエンハンサーであれば特に限定されず、サイトメガロウイルスのエンハンサー、ヒトDAF遺伝子の第一イントロンなどを例示することができる。
【００１９】本発明のトランスジェニック哺乳動物は、発明の構成に適合した導入用遺伝子を構築し、当該導入用遺伝子を用いて、慣用の方法で作製することができる。例えば、本発明の第１の発明においては、前述のGnT-IIIと超急性拒絶の生じる局所の細胞で機能している調節遺伝子からなる導入用遺伝子を構築して、トランスジェニック哺乳動物の作製に供される。上記の導入用遺伝子は、慣用の方法により作製することができる。例えば、調節遺伝子としてpMCPのプロモーター及びヒトDAF遺伝子の第一イントロンを有し、更にGnT-IIIを有する導入用遺伝子は下記の方法により調製することもできる。まず、適当なベクター(例えば、pGL-3ベーシックベクター、pBluescript等)の一部を制限酵素で抜き取り、そのベクター側の末端を常法に準じて平滑化しておく。一方、ブタゲノムファージライブラリーのpMCP遺伝子（特開平09-65887号公報）のプロモーターに相当する領域を切り出し、次いでプロモーター領域が0.9Kbの長さ（特願平09-142961号公報の配列番号１の塩基配列4498～5397番の配列を有する）になるまで短縮した後、末端を平滑化し、上記のベクターに挿入する。また、DAF遺伝子の第一イントロン領域を、ヒトゲノム遺伝子をテンプレートとして適当なプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅させ、得られた遺伝子を上記ベクターのpMCPプロモーター遺伝子の下流側に挿入する。更に、GnT-IIIのcDNA（J. Biochem. 113: 692-698 (1993)）にpolyAシグナル配列を付し、当該遺伝子を上記ベクターのDAF第一イントロンの下流側に挿入する。かくして調製されたベクターから、pMCPプロモーター、DAF第一イントロン及びGnT-IIIを含む領域を適当な制限酵素で切り出すことにより、導入用遺伝子を得ることができる。なお、GnT-III遺伝子と共にヒトの補体制御因子の遺伝子を有する導入用遺伝子は、上記の方法において、GnT-IIIの遺伝子の上流側又は下流側にヒトの補体制御因子の遺伝子を挿入すればよい。なお、上記の各工程における個々の手法は当業者に知られており、常法に準じて行うことができる。
【００２０】トランスジェニック哺乳動物は、上記で調製された導入用遺伝子を哺乳動物の受精卵（前核期卵）の前核にマイクロインジェクション法などの慣用の方法で導入し、当該受精卵を必要に応じて培養し、又は培養せず直ちに疑妊娠状態に同期化させておいた雌性哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、生存産仔を得ることにより作製される。なお、前核にマイクロインジェクションを行う際に、受精卵内の多量の脂肪粒の存在等により前核の確認が困難な場合には、常法に従って予め遠心処理を行う。作製された産仔がトランスジェニック哺乳動物であることの確認は、後記のドットブロッテング法、PCR法、免疫組織化学的方法、補体反応抑制試験などにより行うことができる。また、本発明のトランスジェニック哺乳動物は核移植技術の適用により作製することができる。より具体的には、下記の方法で作製することができる。
(1)胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の確立していない動物種（例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなど）の場合には体細胞（例えば、乳腺細胞、線維芽細胞、顆粒層細胞、卵丘細胞など）、ＥＳ細胞の確立している動物種（例えば、マウス）の場合にはＥＳ細胞又は体細胞を前記の導入用遺伝子又は前記の導入用遺伝子に抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を連結して構築した導入用遺伝子を用いて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などの公知の方法により形質転換する；
(2)形質転換に供した細胞と同一の種の動物から卵子を採取し、その核を取除く；
(3)上記(1)の形質転換細胞と上記(2)の除核卵子を融合し、又は上記(1)の形質転換細胞のkaryoplastを上記(2)の除核卵子に注入し、活性化し、培養し、借り腹の雌性動物の子宮又は卵管に移植し、懐妊させて生存産仔を得る。更に、GnT-IIIのみを発現するトランスジェニック哺乳動物とヒトの補体制御因子のみを発現するトランスジェニック動物を個別に作製し、性成熟に達した個体を交配することによってもGnT-III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するトランスジェニック哺乳動物を得ることができる。
【００２１】このようにして得られたGnT-IIIの遺伝子を有するトランスジェニック哺乳動物又はGnT-III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するトランスジェニック哺乳動物は、N-結合型糖鎖の分岐本数及びα-Gal抗原が減少しており、特に超急性拒絶の生じる局所の細胞において当該減少が生じている。ここで、α-Gal抗原を減少している状態とは、トランスジェニック哺乳動物の細胞に発現しているN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の量が、遺伝子導入操作をしていない通常動物又は野生型動物の対応する細胞に発現しているN-結合型糖鎖のα-Gal抗原の量に比べて、少なくとも30％以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、最も好ましくは70%以上減少している状態をいう。
【００２２】また、本発明のGnT-IIIの遺伝子またはGnT-III及びヒトの補体制御因子の両方を発現するトランスジェニック哺乳動物の臓器には、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、小腸等の消化管及び眼が含まれるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック哺乳動物の組織には、脳組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨、筋の組織が含まれるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック哺乳動物の細胞には、上記の臓器又は組織に分布する血管内皮細胞の外に、肝細胞、膵細胞、神経細胞、脳黒質線条体細胞、卵細胞、受精卵、及び胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
【発明の効果】本発明の第１の発明に係るトランスジェニック哺乳動物は、超急性拒絶の生じる局所の細胞のα-Gal抗原を減少しているので、Discordant異種移植時の超急性拒絶反応を抑制する上で有効である。また、本発明の第２の発明に係るトランスジェニック哺乳動物は、α-Gal抗原を減少するとともにヒトの補体制御因子を発現しているので、Discordant異種移植時の超急性拒絶反応を抑制する上で更に有効である。本発明のトランスジェニック哺乳動物の臓器（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓等）、臓器に付属する組織（例えば、冠状動脈、脳硬膜等）や細胞（例えば、肝細胞、インスリンを産生するランゲルハンス島、ドーパミンを産生する脳黒質線条体細胞等）等をヒト患者に移植すれば既にダメージを受け機能を失調させた患者臓器等の補完、あるいはその代用とすることができる。本発明のトランスジェニック哺乳動物の臓器の細胞（例えば、肝臓、腎臓などの臓器から採取した細胞、インスリンを産生するランゲルハンス島、ドーパミンを産生する脳黒質線条体細胞）を培養し、培養細胞を適宜器材装置等に組み入れ、対応する臓器の機能が失調しているヒト患者と体外循環系を介して接続すれば、失調している臓器の代替や治療として活用することができる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２５】実施例１pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジェニックブタ（a）導入用遺伝子の作製pMCPプロモーター、ヒトのDAF（以下、DAF）の第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を作製した。その構造を図３に示す。当該導入用遺伝子は次の手順で作製した。
（1）ブタゲノムファージライブラリーのpMCP遺伝子（特開平09-65887号公報）のプロモーターに相当する領域の約1.7 kbをBstEIIとBamHIの両サイトで切り出し、末端をT4 DNA polymeraseで平滑化し、pBluescript（Stratagene社製）のSmaIサイトに挿入した。更に、プロモーター部分より更に上流にあるpBluescript由来のBstXIとSpeIの両サイトを切断してプラスミドを直鎖状にし、Kilo-Sequence用Deletion Kit（Takara社製）を用いてプロモーター領域が0.9Kbの長さ（特願平09-142961号公報の配列番号１の塩基配列4498～5397番の配列を有する）になるまで短縮した。0.9 kbのプロモーター領域をBssHIIとEcoRIの両サイトで切り出し、T4 DNA polymeraseで平滑化した後、pGL-3ベーシックベクター（Promega社製）のSmaIサイトに挿入した。
（2）DAF遺伝子の第一イントロン領域をヒトゲノム遺伝子をテンプレートとして5’-TCCTCGAGCTGCCCCGGCTGCTGCTGCTGGTGCTGTTGTと5’-TCAAGCTTCTGGGGGAAGGCCACAGTCACCの両プライマーで増幅し、両側に XhoIとHindIIIのサイトを持つ断片として得た。それを上記ベクターのXhoIサイトとHindIIIサイトに挿入した。
（3）GnT-IIIのcDNA（J. Biochem. 113: 692-698 (1993)）にpolyAシグナル配列を付し、上記ベクターのHindIIIサイトとBamHIサイトに挿入した。
（4）上記ベクターからpMCPプロモーター、DAFイントロン及びGnT-IIIを含む領域をMluIとSalIの両サイトで切り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に4μg／mlの濃度に溶解した。
【００２６】(b)トランスジェニックブタの作製上記の導入用遺伝子を用いて、マイクロインジェクション法によりトランスジェニックブタを作製した。作製方法の概略は以下の通りである（特開平11-239430号公報参照）。ランドレース種、大ヨークシャー種及びデュロック種の交雑種の雌豚を採卵用豚とした。採卵用豚に過排卵処理（PMSGあるいはFSHとhCGの投与）した後、デュロック種の雄豚の精子を人工授精し、受精卵（前核期卵）を採取した。この前核期卵を遠心分離処理（12,000 x g, 8分間)した後、前記導入用遺伝子をマイクロインジェクション法により注入し、導入用遺伝子の注入された前核期卵を直ちにレシピエントブタの卵管に移植した。そして、産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生存トランスジェニックブタ産仔の得られることが確認された。なお、レシピエントブタとして、予め前述の過排卵処理を行いドナーブタと性周期を同期化しておいたブタ、あるいは受精卵を採取した後のドナーブタを供した。
【００２７】(c)トランスジェニックブタの同定と選別ブタ産仔の尾部から常法に従ってゲノムDNAを抽出し、下記の２つの方法によりトランスジェニックブタを同定し、トランスジェニックブタを選別した。
（1）ドットブロッティング法：供試DNA(10μg)をメンブレンに固定し、予めジゴキシゲニン標識（DIG核酸標識キット、ベーリンガー・マンハイム社製）しておいたGnT-IIIのcDNAの一部とハイブリダイゼズさせ、アルカリホスファターゼによる発色反応（DIG核酸検出キット、ベーリンガー・マンハイム社製）を行った。
（2）PCR法：供試DNAをテンプレートとして、GnT-IIIのcDNA由来の5'- GGTGGACGCCTTTGTGGTGTGCをセンスプライマー、同5'- GCCGGTGCGGTTCTCATACTGTをアンチセンスプライマーとするPCR反応を行い（条件；94℃ 30秒間、68℃ 2分30秒間、30回）、各サンプルをミニゲル（エチジウム・ブロマイド入り）で泳動し、導入遺伝子の組込みの有無を検出した。トランスジェニックと同定されたブタについては、常法に従って子孫を得て、本段落に記載の同定法によりトランスジェニックブタを選別した。
【００２８】実施例２pMCPプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジェニックブタpMCPプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を作製した。その構造を図４に示す。DAFの第一イントロンを欠如する以外は実施例１に準じた。そして、トランスジェニック産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生存トランスジェニックブタ産仔の得られることが確認された。
【００２９】実施例３サイトメガロウイスのエンハンサー、鶏βアクチンのプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジェニックブタサイトメガロウイスのエンハンサーと鶏βアクチンのプロモーター（pCXN2）及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を作製した。その構造を図５に示す。pMCPプロモーターとDAFの第一イントロン領域をpCXN2に代えた以外は実施例１に準じた。そして、トランスジェニック産仔を得た。即ち、GnT-III遺伝子（特に、ヒトGnT-III遺伝子）を導入した受精卵から生存トランスジェニックブタ産仔の得られることが確認された。
【００３０】実施例４pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジェニックマウス実施例１に記載の導入用遺伝子を用い、常法に従ってトランスジェニックマウスを作製した。
【００３１】比較例１pMCPプロモーター及びDAFのcDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジェニックブタpMCPのプロモータとヒトのDAFをコードするcDNAからなる導入用遺伝子を用いてトランスジェニックブタを作製した（特開平11-239430号公報参照）。
【００３２】比較例２pMCPプロモーター及びDAFのcDNAから成る導入用遺伝子を用いて作製したトランスジェニックマウス比較例１に準じて、pMCPのプロモータとヒトのDAFをコードするcDNAからなる導入用遺伝子を用いてトランスジェニックマウスを作製した（特開平11-239430号公報参照）。
【００３３】実施例５GnT-IIIとDAFの両遺伝子を有するトランスジェニックブタ上記実施例３に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニックブタ（ヘテロ型雄）と上記比較例１に記載のDAFを発現するトランスジェニックブタ（ヘテロ型雌、２頭）が性成熟に達するのを待って交配し、17匹の生存産仔を得た（全産仔数：１８）。得られた産仔について上記のGnT-III遺伝子の同定方法及び特開平11-239430号公報に記載のDAF遺伝子の同定方法により導入遺伝子の有無を調べた。得られた産仔は次の４つの遺伝子型に概ね１：１：１：１の割合で区分された：DAF（－）／GnT-III（－）（n=３）、DAF（＋）／GnT-III（－）（n=５）、DAF（－）／GnT-III（＋）（n=５）、DAF（＋）／GnT-III（＋）（n=４）。以上の結果から、１動物個体中にGnT-III遺伝子と共にそれ以外の１以上の導入遺伝子（本実施例ではDAF）を共発現する生存トランスジェニック産仔の得られることが確認された。
【００３４】実施例６GnT-IIIとDAFの両遺伝子を有するトランスジェニックマウス実施例４に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニックマウス（雌）と比較例２に記載のDAFを発現するトランスジェニックマウス（雄）を交配してGnT-IIIとDAFの両方を発現するトランスジェニックマウスを作製した。当該トランスジェニックマウスは実施例５に準じて、両遺伝子を保有することを確認した。
【００３５】試験例１トランスジェニックブタのGnT-III活性（a）GnT-III活性の測定方法：GnT-III活性をピリジルアミン化二分岐糖鎖（pyridylaminated biantennary-sugar chain）を基質として測定した。概略は次の通りである。供試トランスジェニックブタの各種臓器をリン酸緩衝液（PBS）中でホモジナイズし、蛋白質含量を測定した後、以下の反応溶液中でUDP（ウリジン２リン酸）-GlcNAcをドナー基質として、ピリジルアミン(PA)化２分岐糖鎖をアクセプター基質として、サンプル中のGnT-IIIによりbisecting GlcNAcが生成される反応を行わせ、GnT-IIIの比活性（p mol/h/mg）を測定した。すなわち、0.77 mM 2-ピリジルアミン（PA）化糖鎖、20 mM UDP-GlcNAc、10 mM MnCl2、 200 mM N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）及び0.5% Triton X-100 を含む125 mM 2-(N-morpholino) ethanesulphonate 緩衝液（pH 6.25）に各サンプルを加え、37℃で2時間インキュベートした。その後3分間煮沸して反応を止め、15000 gで5分間遠心分離した。反応後のbisecting GlcNAcを HPLC（島津製作所製HPLC装置SCL-6A）で測定した。HPLCの条件の一例を示せば、分離用カラム；ODS-80カラム（TOSOH社製)、溶出用緩衝液；0.25％（v/v）のbutan-1-olを含む20 mM 酢酸アンモニウム緩衝液（pH 4.0)、溶出条件；55℃で1.2 ml/min、検出条件；蛍光分光光度計（励起波長320 nm、蛍光波長400 nm）。399 p molのPA化二分岐糖鎖をスタンダードとしてbisecting GlcNAcを定量した。GnT-IIIの比活性は、個別に測定した３回の測定値を平均し、タンパク質mg当たり、時間当たりの転移GlcNAcのpモルとして表した（表１）。
（b）GnT-III活性の測定結果：実施例１、２、３及び５に記載のトランスジェニックブタ、並びに通常の非トランスジェニックブタの各種臓器についてGnT-III活性を測定した結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】

【００３７】Tanemuraらによって、通常マウスの肺及び腎臓はそれぞれ520と3,400 p mol/h/mgのGnT-III活性を発現していることが報告されたが（Transplant. Proc., 29:895-896 (1997)）、通常ブタの場合には、全供試臓器がGnT-IIIを発現していないことが今回明らかになった。一方、本発明のトランスジェニックブタの場合には、全供試臓器がGnT-IIIを発現していた。供試臓器間でGnT-IIIの発現量を比較すると、pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には（実施例１）、肝臓および脾臓でGnT-IIIの発現が促進された、一方サイトメガロウイスのエンハンサー、鶏βアクチンのプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には（実施例３と５）、肺、心臓、腎臓および脾臓でGnT-IIIの発現が促進された。実施例１のトランスジェニックブタの臓器のGnT-III活性値は、同様にpMCPプロモーターを用いた実施例2のトランスジェニックブタの臓器のGnT-III活性値に比べて明らかに高かったから、実施例1で用いられたDAFの第一イントロンがエンハサーとして機能することが確認された。
【００３８】試験例２トランスジェニックブタのα-Gal抗原量（a）トランスジェニックブタの臓器のα-Gal抗原量の測定方法（１）：供試トランスジェニックブタ臓器のα-Gal抗原の量を、当該抗原と特異的に結合するIB4レクチンを用いて検出した。概略は次の通りである。供試臓器の溶解物（3μg）を還元条件下でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（12％）し、ゲルをニトロセルロース膜に電気的に転写した。当該膜を3％のBSAを含むPBSでブロッキングし、ビオチン化したIB4レクチン（10μg/ml）を作用させ、洗浄した。その後、アビジン結合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Vector社製）を作用させ、洗浄し、ECL検出キット（Amersham社製）を用いて発色させた。発色の程度はイメージスキャナーで計測した。レクチンの付着率は、個別に測定した３回の測定値を平均し、通常ブタの臓器への付着率を100として相対値を計算した。
（b）トランスジェニックブタ血管内皮細胞のα-Gal抗原量およびGnT-III活性の測定方法（2）：供試トランスジェニックブタを犠牲死させて、大動脈を取り出し、大動脈内部を軽く擦って血管内皮細胞を採取し、Ham’s F-12培地で数回継代した。α-Gal抗原量はFITC標識IB4レクチンを反応させ、FACS(ベクトンディキンソン社製FACScan)により測定した。GnT-III活性は上記の方法で測定した。
（c）供試臓器のα-Gal抗原量の測定結果（１）：実施例１、３及び５のトランスジェニックブタ、並びに通常の非トランスジェニックブタの各種臓器についてα-Gal抗原量を測定した結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】

【００４０】実施例１、３及び５のトランスジェニックブタの場合には、通常ブタに比べてα-Gal抗原の減少が認められた。供試臓器間でGnT-IIIの発現量を比較すると、pMCPプロモーター、DAFの第一イントロン及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には（実施例１）、肝臓、腎臓および脾臓でα-Gal抗原の減少が促進された、一方サイトメガロウイスのエンハンサー、鶏βアクチンのプロモーター及びGnT-IIIのcDNAから成る導入用遺伝子を用いた場合には（実施例３と５）、肺および心臓でα-Gal抗原の減少が促進された。
【００４１】（d）供試血管内皮細胞のα-Gal抗原量およびGnT-III活性の測定結果（２）：実施例３及び５のトランスジェニックブタ、並びに通常の非トランスジェニックブタの血管内皮細胞のα-Gal抗原量（FACS mean shiftとして表す）およびGnT-III活性（p mol/h/mg）の測定結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】

【００４３】実施例３及び５のトランスジェニックブタの血管内皮ではGnT-IIIが発現しており、その結果としてα-Gal抗原量の減少していることが確認された。
【００４４】試験例３ブタ心臓の体外循環試験（1）心機能の延長時間の測定ヒトの血清を用いてトランスジェニックブタの心臓を環流し、GnT-IIIによる糖鎖抗原低減臓器の超急性拒絶反応に対する効果を検討した。試験には２週齢の通常ブタと実施例1のトランスジェニックブタ（それぞれn=5）を供した。鎮静剤であるストレスニル（2ｍｇ/ｋｇ）投与後、麻酔薬であるラボナール（0.5ml/kg）により麻酔を施した。腹部大動脈よりカテーテルを心臓に向かって挿入し、4℃に冷やしたcardioplegic solution (glucose, 0.39M; NaHCO₃, 8.3mM; KCl, 80mM; ヘパリン2000 U/l )を200ml注入して、拍動を停止させた。摘出した心臓はランゲンドルフ体外循環装置に結合させるまで４℃のcardioplegic solutionに浸しておいた。心臓は大動脈と肺静脈で装置に結合した後、35℃に保温したKrebs-Henseleit バッファー（NaCl, 118.33mM; KCl, 4.7mM; KH₂PO₄, 1.2mM; MgCl₂, 0.66mM; NaHCO₃, 25mM; CaCl₂, 0.167mM; glucose, 11.1mM）で環流を開始した。環流開始20分後に環流液を50％ヒト血清を含むK-H液に切り替え、心臓が拍動を停止するまでの時間を記録した。その際、心室の拍動の停止時を心機能の停止時とした。その結果を表４に示す。表４に示されるように、本発明のトランスジェニックブタは超急性拒絶を抑制することが確認できた。
【００４５】
【表４】

【００４６】（2）環流後の組織学的観察環流に使用した心臓組織の凍結切片を作製し、沈着している抗体と補体量を比較した。即ち、組織の一部を環流後直ちにOKTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、ドライアイス/エタノールに接触させて凍結した。クリオスタット切片は8μmの厚さとし、poly-L-lysinを塗布したスライドグラスに張り付けた後、乾燥、アセトン固定をおこなった。内因性のビオチンを「ブロッキングキット」（Vector Laboratories社製）で処理した後、抗IgG抗体（ビオチン化抗ヒトIgGモノクローナル抗体JDC10：サザンバイオテクノロジー社製）、抗IgM抗体（ビオチン化抗ヒトIgMモノクローナル抗体SA-DA4：サザンバイオテクノロジー社製）、抗C1q抗体（一次抗体；抗ヒトC1qポリクローナルウサギ抗体：コスモ・バイオ社製、二次抗体；ビオチン化抗ウサギIgGモノクローナル抗体D10E6：スプリングバレーラボラトリーズ社製）、抗C3抗体（一次抗体；抗ヒトC3ポリクローナルウサギ抗体：コスモ・バイオ社製、二次抗体；ビオチン化抗ウサギIgGモノクローナル抗体D10E6：スプリングバレーラボラトリーズ社製）と反応させた。免疫染色はVector Laboratories社製VECTASTEIN ABC Kitを使用しておこなった。ペルオキシダーゼの反応はdiaminobenzidine reagent set (Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を利用した。そして、各成分の沈着の程度を検鏡した。その結果を表５に示す。
【００４７】
【表５】

【００４８】表５に示されるように、本発明のトランスジェニックブタは超急性拒絶を抑制することが確認できた。より詳細には、α-抗原量の減少に伴う補体反応の初期段階の抑制（C1qの抑制）とそれに基づく補体反応の中期段階の抑制（C3の抑制）が確認された。
【００４９】試験例４GnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックマウスの赤血球を用いた補体反応抑制試験実施例４に記載のGnT-IIIを発現するトランスジェニックマウス、比較例２に記載のDAFを発現するトランスジェニックマウス、実施例６に記載のGnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックマウスのそれぞれから得られた子孫マウス、及び通常マウスを犠死させて血液を採取し、赤血球画分を得た。それぞれの赤血球をPBSにて希釈し、96穴マイクロプレートの各ウエルに30μlずつ分注し（1x10^７個／ウェル）、その後、補体含有量調整ヒト血清70μlを上記のウェルに滴下し、赤血球と反応させた（37℃、1.5時間）。その後、補体反応により生じた溶血の程度を405nmにおける吸光度で測定した。通常マウスの溶血の程度を100として、各供試検体における溶血の程度を表した。その結果を表６に示した。
【００５０】
【表６】

【００５１】表６に示されるように、本発明のトランスジェニックマウスは補体依存性細胞障害（補体反応）を抑制することが確認できた。また、GnT-IIIとDAFを同時に発現させることによって、補体依存性細胞障害を相乗的に抑制することが確認できた。更に、糖鎖修飾酵素であるGnT-IIIをマウスに発現させた場合でも、GPIアンカー型糖蛋白質であるDAFの機能発現に何らの障害を生じないことが確認できた。
【００５２】試験例５GnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックブタの血管内皮細胞を用いた補体反応抑制試験（a）補体反応抑制試験の方法：ブタの血管内皮細胞とヒト血清を反応させて、補体反応による細胞傷害の程度を調べた。実施例１、３及び５のトランスジェニックブタ並びに通常ブタを犠死させて大動脈を採取した。大動脈内皮部を軽く擦って血管内皮細胞を採取し、F-12培地にて増殖させ、更にDMEM培地で5-10回継代培養した。その後、96穴マイクロプレートの播種し（5x10^３細胞／ウエル）、一晩培養した。PBS(-)で洗浄した後、ヒト非働化血清またはヒト補体含有量調整血清（30％と50％）100μlを上記のウエルに滴下し、血管内皮細胞と反応させた（37℃、1.5時間）。生存した細胞数を乳酸脱水素酵素量を指標に測定した。生存率は、次式による求めた。生存率(%)＝（ヒト補体含有量調整血清と反応させた時の生存細胞数）／（ヒト非働化血清と反応させた時の生存細胞数）x100。その結果を表７に示した。
【００５３】
【表７】

【００５４】（b）細胞傷害抑制試験の結果：表７が示すように、本発明のトランスジェニックブタは補体依存性細胞傷害（補体反応）を抑制することが確認できた。また、GnT-IIIとDAFを同時に発現させることによって、補体依存性細胞傷害反応を相乗的に抑制することが確認された。更に、糖鎖修飾酵素であるGnT-IIIをブタに発現させた場合でも、GPIアンカー型糖蛋白質であるDAFの機能発現に何らの障害を生じないことが確認できた。
【００５５】試験例６GnT-IIIとDAFを共発現するトランスジェニックブタの血管内皮細胞のNK細胞による細胞障害への抵抗性試験試験例５と同様に実施例３及び５のトランスジェニックブタ並びに通常ブタから血管内皮細胞を調製し、96穴マイクロプレートに播種し（2x10^４細胞／ウエル）、一晩培養した。PBS(-)にて洗浄後、ヒト血液から分離したNK細胞懸濁液（4x10⁶細胞/ml）50μlを上記のウエルに滴下し、血管内皮細胞と反応させた（37℃、4時間）。生存した細胞数を乳酸脱水素酵素量を指標に測定した。生存率は次式により求めた。生存率(%)=（NK細胞と反応させた時の生存細胞数）／（NK細胞と反応させなかった時の生存細胞数）x100。その結果を表８に示した。
【００５６】
【表８】

【００５７】表８が示すように、本発明のGnT-IIIを発現するトランスジェニックブタはNK細胞に対する細胞障害を抑制することが確認された。AVRの生じる原因は必ずしも特定されていないが、異種抗原、補体、マクロファージ、NK細胞、好中球、血小板などが関与すると言われている。本発明のトランスジェニックブタの血管内皮細胞はヒトNK細胞による細胞障害に耐性を有すると共に、試験例２から、異種抗原（α-Gal抗原）量が減少しているので、本発明のトランスジェニックブタは急性血管型拒絶についても抵抗性を有すると思われる。
【００５８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Nippon Meat Packers, Inc.<120> Transgenic mammals<130> 0108NH73<150> JP 2000-256541<151> 2000-08-25<160> 4<210> 1<211> 39<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: primer<400> 1tcctcgagct gccccggctg ctgctgctgg tgctgttgt 39<210> 2<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: primer<400> 2tcaagcttct gggggaaggc cacagtcacc 30<210> 3<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: primer<400> 3ggtggacgcc tttgtggtgt gc 22<210> 4<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: primer<400> 4gccggtgcgg ttctcatact gt 22

【出願人】	【識別番号】０００２２９５１９【氏名又は名称】日本ハム株式会社
【出願日】	平成１３年８月２７日（２００１．８．２７）
【代理人】	【識別番号】１０００８５４８６【弁理士】【氏名又は名称】廣瀬孝美
【公開番号】	特開２００２－２９１３７２（Ｐ２００２－２９１３７２Ａ）
【公開日】	平成１４年１０月８日（２００２．１０．８）
【出願番号】	特願２００１－２５５４９８（Ｐ２００１－２５５４９８）