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【発明の名称】 ヒトＭＭＰ−１２トランスジェニックウサギ
【発明者】 【氏名】渡邊 照男

【氏名】范 江霖
【要約】 【課題】ＭＭＰ−１２に起因する動脈硬化等の疾患に対する予防法、治療法、新規治療薬のスクリーニング等に用いることができるトランスジェニックウサギを提供すること。

【解決手段】過剰排卵処理したドナーウサギ卵管より受精卵を採取し、ヒトマクロファージスカベンジャーレセプターエンハンサー／プロモーターにより発現誘導されるヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物が導入された受精卵を選別し、偽妊娠（仮親）雌ウサギの卵管内に移植することにより、トランスジェニックウサギを作製する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物が染色体上に導入され、酵素活性を有するヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２を発現することができるトランスジェニックウサギ。
【請求項２】 ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２をマクロファージ特異的に発現することを特徴とする請求項１記載のトランスジェニックウサギ。
【請求項３】 ＤＮＡ構築物が、ヒトマクロファージスカベンジャーレセプターエンハンサー／プロモーター、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２ｃＤＮＡ、及びヒト成長ホルモンテイルを含むことを特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニックウサギ。
【請求項４】 マクロファージの活性化剤を投与することにより、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２を分泌することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のトランスジェニックウサギ。
【請求項５】 マクロファージの活性化剤が、プラスミン、トリプシン、カリクレイン、キモトリプシンから選ばれる少なくとも１種の活性化剤であることを特徴とする請求項４記載のトランスジェニックウサギ。
【請求項６】 請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニックウサギ由来の組織、器官又は細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするヒトＭＭＰ−１２を過剰又は低発現することに起因する疾病の予防薬及び／又は症状改善剤のスクリーニング方法。
【請求項７】 請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニックウサギと、被検物質とを用いることを特徴とするヒトＭＭＰ−１２を過剰又は低発現することに起因する疾病の予防薬及び／又は症状改善剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動脈硬化、関節リウマチ、肺気腫などの研究に有用なヒト疾患モデルウサギ、より詳しくは、酵素活性を有するヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１２を発現することができるトランスジェニックウサギに関する。
【０００２】
【従来の技術】動物における初期発生、形態形成などの発生及び成長過程、創傷治癒、血管新生などの生理的過程、そして癌の転移、炎症、動脈硬化などの疾患発症の過程には、細胞の活発な増殖や移動が深く関与している。細胞が組織内あるいは組織間を移動するには、周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）層の局部的破壊が必須である。例えば、癌細胞が転移するには、癌細胞が血管内に入り込む「浸潤」が起きなければならない。この過程には種々のタンパク質分解酵素が関与しているが、これらの中でも特に、マトリックス構成成分に対して強力な分解活性を有する一群のマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases；ＭＭＰs）は、特に重要な役割を担うと考えられている［正札ら：化学と生物, 35：816(1997)］。ＭＭＰsは構造と機能に共通性を有する金属依存性のプロテアーゼで、細胞外及び細胞膜上で機能しており、現在までにヒトにおいては２７種類のＭＭＰ分子種が報告されている。
【０００３】上記ＭＭＰファミリーは、現在、ＭＭＰ−１、−８、−１３等のコラゲナーゼ群や、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９等のゼラチナーゼ群や、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１０等のストロメリシン群や、ＭＭＰ−１４、−１５、−１６、−１７等のＭＴ−ＭＭＰ（膜型ＭＭＰ）群や、ＭＭＰ−７、−１１、−１２等の上記４つの群に属さない群の５つのサブファミリーに分類されている。これらＭＭＰによるＥＣＭ分解は、（１）ＴＮＦ−αやＩＬ−１等の発現誘導物質又はＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、レチノイド、グルココルチコイド等の発現抑制物質によるＭＭＰの遺伝子発現制御、（２）proMMPからactive MMPへの活性化、（３）生体内内在性の阻害蛋白質であるＴＩＭＰｓによる酵素活性阻害の３つの段階で調節されており、ＭＭＰｓの酵素活性発現が厳密に制御されることで、細胞外マトリックスのみならず、生体内組織の恒常性も維持されている。
【０００４】ＭＭＰｓは、動脈硬化巣において最も頻繁に発現しており、ＥＣＭ分解により動脈硬化における少なくとも二つの病理学的イベントの発生が助長される。１つは平滑筋細胞の解放で、中膜に固定された平滑筋細胞が内膜へ遊走・増殖することにより、動脈硬化の進行病変である閉塞性病変へと進行する。もう１つは、粥腫性プラークの破綻であり、lipid coreをおおう線維性被膜fibrous capのコラーゲンやエラスチンなどのＥＣＭの分解により、プラークが破綻し、最も危険な動脈硬化の合併病変である血栓形成へとつながる。最近では、動脈硬化の進展において動脈を構成するＥＣＭであるエラスチンを分解する酵素（エラスターゼ）の発現が上昇することなどから、エラスチンについても動脈硬化の進展との関与が示唆されている。ＭＭＰファミリーのなかでエラスターゼ活性を有するＭＭＰ−２とＭＭＰ−９については、動脈硬化巣での発現が病理学的ならびに生化学的に検討されている（Am. J. Pathol. 148, 121-128, 1996、Am. J. Pathol. 145,1208-1218, 1994）が、同様にエラスチン活性をもつＭＭＰ−１２については、現在までにほとんど検討されていない。
【０００５】上記ＭＭＰ−１２はマクロファージ・メタロエラスターゼとも呼ばれ、１９８１年に炎症性マクロファージにより分泌されるエラスチン分解性金属プロテアーゼとして精製されている（Biochem. J. 193, 569-605, 1981）。マウスとヒトのＭＭＰ−１２遺伝子は、それぞれのマクロファージｃＤＮＡライブラリーより同定され、アミノ酸レベルで６４％の相同性を有している（J. Biol. Chem. 268,23824-23829, 1993）。このＭＭＰ−１２はＩ型コラーゲンに対しては全く活性がないが、エラスチン分解活性の他にファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸などに対する分解活性を示す（Biochem.Biophys. Res. Commun. 228, 421-429, 1996）。このことから、ＭＭＰ−１２は炎症時に基底膜を破壊し、炎症巣へのマクロファージや白血球の遊走を容易にすると考えられている。
【０００６】最近、本発明者らにより、大動脈におけるＭＭＰ−１２ｍＲＮＡの発現は正常ウサギには認められず、病変ウサギ（コレステロール摂食動脈硬化モデルウサギ）の大動脈にのみ認められ、ＭＭＰ−１２が他のＭＭＰｓに比べ非常に強く発現することや、病変をもたない大動脈あるいは正常大動脈由来の細胞の培養上清には検出されず、病変大動脈由来の細胞（マクロファージ由来泡沫細胞：ＭＦＣ）が４５ｋＤａの活性型ＭＭＰ−１２蛋白質を分泌していることを明らかにしている（Am. J. Pathol. 153, 109-119, 1998）。しかしながら、ＭＭＰ−１２が具体的にどのように動脈硬化に関与しているのかは未だ不明な点が多い。
【０００７】他方、発生工学の発展で、ヒト遺伝子を導入したトランスジェニックマウスがヒト疾患モデルとしてよく使われているが、マウスは小型の動物であり、とくに脂質代謝および動脈硬化の研究へ応用する場合にはいくつかの欠点がある。例えば、コレステロール食を投与しても血清コレステロール値の上昇は鈍く、動脈硬化も起こりにくい。そのため食餌にコール酸を添加したり、あるいはチオウラシルを併用して甲状腺機能を低下させるような手段がとられていた。また、動脈硬化が比較的起こりやすいとされるＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスでも病変発生部位は大動脈弁直上部に限局しており、ヒトにみられる病変の分布・程度とは大きく異なっている。さらに、マウスは体が小さいために大動脈においてさえ動脈硬化病変の病理学的観察、あるいは定量的分析が非常に困難で、冠状動脈硬化の研究を行う場合は病変そのものの発生を含め事態はもっと深刻であった。それに対し、トランスジェニックウサギはコレステロール食に敏感で数ヶ月で動脈硬化が発生する。これらの理由から、ヒト肝リパーゼ（Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 8724-8728）、アポリポ蛋白Ｂ−１００（Fan et al.,Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 1995; 15: 1889-1899）、アポＢｍＲＮＡエディティング蛋白（Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:8483-8487）、アポＥ（Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 15: 1889-1899）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（J Biol Chem 1996;271:4396-4402）及びアポＡ−Ｉ（Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996; 16: 1424-1429）などのいくつかのトランスジェニックウサギ・モデルが作製されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のように動脈硬化の発症、進展には未だ解明しなければならない点も多いが、動脈硬化は７５％以上の内腔狭窄が起こらなければ一般に血流量の減少は起こらないとされている。また、ヒトでは動脈硬化は小児段階で発症しており、一生の間に７５％以上の狭窄が起こらないようにすれば、動脈硬化性疾患を免れることも可能である。今後は、動脈硬化の４大危険因子である、「高脂血症」・「喫煙」・「高血圧」・「糖尿病」を排除して生活することにより、動脈硬化をひどくは進展させない、あるいは進展を遅らせる対処方法が有効な予防法とされており、緊急を要する研究課題となっている。そこで本発明者らは、動脈硬化及び冠状動脈硬化プラークの破綻や動脈瘤の形成に及ぼすＭＭＰ−１２の役割を解明するための研究用ヒト疾患モデルを開発することを目的として、ヒトＭＭＰ−１２を発現するトランスジェニックウサギの作製を試みた。本発明の課題は、ＭＭＰ−１２に起因する動脈硬化等の疾患に対する予防法、治療法、新規治療薬のスクリーニング等に用いることができるトランスジェニックウサギを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】トランスジェニックウサギの作製は、トランスジェニックマウスの作製に比べて高レベルの技術と飼育環境が必要であり、例えこれらの条件が整ったとしてもマウスに比較すると成功率が低く陽性トランスジェニックウサギの割合が極めて低いのが現状である。特に高純度で発現効率の高いＤＮＡ構築物の作製、ホルモン投与等による採卵技術や高い確率で妊娠をさせる技術、或いは遺伝子を注入した胚の分裂能力の向上などの基本的技術を整備するには特別の工夫と技術の開発が必要である。そこで本発明者らは、多数のウサギを用いて本発明者らが開発してきたトランスジェニックウサギ作製技術（Fan et al., Pathology International 1999;49: 583-594）を駆使してトランスジェニックウサギを作製し、導入遺伝子の存在およびその発現をそれぞれサザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法で確認し、酵素活性を有するヒトＭＭＰ−１２をマクロファージ特異的に過剰発現するモデルトランスジェニックウサギを樹立できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち本発明は、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物が染色体上に導入され、酵素活性を有するヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２を発現することができるトランスジェニックウサギ（請求項１）や、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２をマクロファージ特異的に発現することを特徴とする請求項１記載のトランスジェニックウサギ（請求項２）や、ＤＮＡ構築物が、ヒトマクロファージスカベンジャーレセプターエンハンサー／プロモーター、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２ｃＤＮＡ、及びヒト成長ホルモンテイルを含むことを特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニックウサギ（請求項３）や、マクロファージの活性化剤を投与することにより、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２を分泌することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のトランスジェニックウサギ（請求項４）や、マクロファージの活性化剤が、プラスミン、トリプシン、カリクレイン、キモトリプシンから選ばれる少なくとも１種の活性化剤であることを特徴とする請求項４記載のトランスジェニックウサギ（請求項５）に関する。
【００１１】また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニックウサギ由来の組織、器官又は細胞と、被検物質とを用いることを特徴とするヒトＭＭＰ−１２を過剰又は低発現することに起因する疾病の予防薬及び／又は症状改善剤のスクリーニング方法（請求項６）や、請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニックウサギと、被検物質とを用いることを特徴とするヒトＭＭＰ−１２を過剰又は低発現することに起因する疾病の予防薬及び／又は症状改善剤のスクリーニング方法（請求項７）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のトランスジェニックウサギとしては、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１２をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物が染色体上に導入された、酵素活性を有するヒトＭＭＰ−１２を発現することができるウサギ系統であれば特に制限されるものではないが、ヒトマクロファージスカベンジャーレセプターエンハンサー／プロモーター、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ−１２ｃＤＮＡ、及びヒト成長ホルモンテイル（ヒト成長ホルモン遺伝子の３′−フランキング領域）を含むＤＮＡ構築物が導入された、ヒトＭＭＰ−１２をマクロファージ特異的に発現することができるトランスジェニックウサギを具体的に挙げることができる。これらトランスジェニックウサギは、筑波大学基礎医学系病理学研究室において継代されており、一定の条件下で関係者は分譲を受けることができる。
【００１３】本発明の酵素活性を有するヒトＭＭＰ−１２をマクロファージ特異的に発現することができるトランスジェニックウサギは、動脈硬化症等のＭＭＰ−１２過剰発現に起因する各種疾病を早期に発症させることができるので、動脈硬化についての研究及び動脈硬化病巣に浸潤したマクロファージ由来の泡沫細胞から分泌される活性型ＭＭＰ−１２の役割についての研究をする上で有用であり、日本人の死因の約半数に関係するとされる動脈硬化症の成因、発生機序の解明、さらには、関節リウマチ、肺気腫などの炎症性疾患の発生及び作用機序の解明に寄与することが出来る。
【００１４】本発明のトランスジェニックウサギの樹立方法としては、本発明者らにより報告されている方法等（Fan et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1994;91:8724-8728、Fan et al.,Arterioscl.Thromb.Vasc.Biol. 1995;15:1889-1899）に準じて行うことができる。ヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡ（例えば、GenBank Accession number L23808）を、例えばヒトマクロファージスカベンジャーレセプターエンハンサー／プロモーターの下流に、かつヒト成長ホルモンテイルの上流に挿入した導入遺伝子を構築し、このＤＮＡ構築物をウサギ受精卵にマイクロインジェクションし、偽妊娠（仮親）雌ウサギの卵管内に移植し、生まれた仔ウサギから前記ヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡを有する仔ウサギを選択することによりトランスジェニックウサギを作製することができる。そして、ヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡを有する仔ウサギの選択は、ウサギの耳等よりゲノムＤＮＡを抽出し、導入したヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡに特異的な標識化プローブを用いたサザンブロット法や、特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００１５】上記ヒトＭＭＰ−１２遺伝子を発現するためのプロモーターとしては特に制限されるものではなく、例えば、ヒトマクロファージスカベンジャーレセプタープロモーター、トリβ-アクチンプロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスフォンヴィルブラントファクタープロモーター等を用いることができるが、ヒトＭＭＰ−１２遺伝子をウサギマクロファージに特異的に発現させるにはヒトマクロファージスカベンジャー受容体プロモーターを用いることが好ましく、また各種臓器で全身性に発現させるにはトリβ-アクチンプロモーターを用いることが好ましい。上記ＤＮＡ構築物で、特にトリβ-アクチンプロモーターを用いてヒトＭＭＰ−１２遺伝子の発現調節を行う際には、ヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡの上流域にウサギβ−グロビンイントロンを挿入することにより発現効率を高めることが出来る。同様に、ＭＭＰ−１２ｃＤＮＡの下流域にヒト成長ホルモンテイルを挿入することによりＭＭＰ−１２ｃＤＮＡの発現効率を安定して高めることが出来る。受精卵へのヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物をウサギ染色体上へ導入するための受精卵への該ＤＮＡ構築物の導入方法は特に限定されるものではなく、上記マイクロインジェクション法の代わりにエレクトロポレーション法等を用いてもよく、また、本発明者らにより開発されている体細胞核移植法（范 江霖：病理と臨床、１７：３２４、１９９９）等も用いることが出来る。
【００１６】また本発明のトランスジェニックウサギにマクロファージ活性化剤を投与することにより、腹腔内マクロファージからヒトＭＭＰ−１２蛋白を過剰分泌させ、該トランスジェニックウサギにおいて早期に動脈硬化を発症させることが可能である。マクロファージ活性化剤としては、プラスミン、トリプシン、カリクレイン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼ類や、ＭＭＰ−３等のＭＭＰファミリーを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。かかる動脈硬化を発症したトランスジェニックウサギは、動脈硬化及び冠状動脈硬化プラークの破綻や動脈瘤の形成に及ぼすＭＭＰ−１２の役割を解明するだけでなく、動物における初期発生、形態形成などの発生及び成長過程、創傷治癒、血管新生などの生理的過程、そして癌の転移、炎症、動脈硬化などの疾患発症の過程などの研究や、動脈硬化、関節リュウマチなどの慢性炎症、肺気腫あるいは癌の転移等の疾患に対する予防法、治療法等の研究に用いることができる。また、その他、ヒトＭＭＰ−１２を過剰発現することができるので、ヒトＭＭＰ−１２を過剰、または低発現することに起因する疾病や症状に対する予防薬剤、症状改善剤、新規治療剤等のスクリーニングに用いることができる。
【００１７】上記スクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニックウサギ由来の組織、器官又は細胞と、被検物質とを用いる方法や、本発明のトランスジェニックウサギと、被検物質とを用いる方法などを挙げることができる。トランスジェニックウサギ由来の組織、器官又は細胞と、被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニックウサギ由来の組織、器官又は細胞を被検物質の存在下で培養し、該組織、器官又は細胞のヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法がある。トランスジェニックウサギを用いる方法としては、被検物質を直接投与する方法や被検物質を過剰発現するトランスジェニックウサギを作製し該トランスジェニックウサギと交配して掛け合わせることにより、ヒトＭＭＰ−１２の発現量の測定・評価に加え、疾病に関連する各種症状に対する影響の測定・評価を行う方法がある。
【００１８】また、上記トランスジェニックウサギと、被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニックウサギに被検物質を投与し、該組織、器官又は細胞のヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法や、トランスジェニックウサギにあらかじめ被検物質を投与した後、該トランスジェニックウサギにプラスミン、トリプシン、カリクレイン、キモトリプシン等から選ばれる少なくとも１種のマクロファージ活性化剤を投与し、該トランスジェニックウサギから得られる組織、器官又は細胞のヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法や、トランスジェニックウサギにあらかじめ上記マクロファージ活性化剤を投与し、該トランスジェニックウサギから得られる組織、器官又は細胞を被検物質の存在下で培養し、該組織、器官又は細胞のヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法や、トランスジェニックウサギにあらかじめ上記マクロファージ活性化剤を投与し、該トランスジェニックウサギに被検物質を投与して該トランスジェニックウサギから得られる組織、器官又は細胞のヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法や、トランスジェニックウサギにあらかじめ被検物質を投与した後、該トランスジェニックウサギに上記マクロファージ活性化剤を投与し、該トランスジェニックウサギにおけるヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法や、トランスジェニックウサギにあらかじめ上記マクロファージ活性化剤を投与した後、該トランスジェニックウサギに被検物質を投与し、該トランスジェニックウサギにおけるヒトＭＭＰ−１２の発現量を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。なお、上記組織及び器官としては、脾臓、胸腺、肺、大動脈等を、細胞としては、マクロファージ、マクロファージ由来泡沫化細胞、白血球、平滑筋細胞等を具体的に挙げることができる。
【００１９】その他、本発明のトランスジェニックウサギに被検物質、必要に応じてマクロファージ活性化剤を投与し、該トランスジェニックウサギの大動脈又は大動脈から分岐し心臓を養う冠状動脈、脳の表面の動脈、四肢動脈等の病変組織の形態変化を単クローン抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価することにより、本発明のヒトＭＭＰ−１２を過剰、または低発現することに起因する疾病や症状に対する予防薬剤、症状改善剤、新規治療剤等をスクリーニングすることもできる。これらのスクリーニングに際して、ヒトＭＭＰ−１２の発現量や病変組織の形態変化を野生型ウサギ、特に同腹の野生型ウサギと比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。
【００２０】
【実施例】以下本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はかかる実施例により制限されるものではない。
実施例１（トランスジェニックウサギの作製）
トランスジェニックウサギは文献（Fan et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1994;91:8724-8728、Hammer et al., 1985、Taylor and Fan, 1997）記載の方法に準じて作製した。特定の病原体に汚染されていない（SPF）日本白ウサギ（東京実験動物株式会社製；日本ＳＬＣ社製）３６０羽を使用した。第１日目、ドナーウサギ（４〜６か月齢）に妊馬血清（Sigma社製）１５０ＩＵを筋肉注射して過剰排卵させた。第４日目、ドナーウサギを繁殖力のある雄ウサギと一緒にして、ヒト絨毛ゴナドトロピン（Sigma社製）１５０ＩＵを静脈注射し、１７〜１９時間後、筑波大学動物センターにて受精卵を卵管から取り出した。
【００２１】ヒトマクロファージスカベンジャーレセプターエンハンサー／プロモーター（ｐＡＬ−１；Horvai. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92. 5391-5395, 1995）、ヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡ（Shapiro, S.D. et al., J. Biol. Chem.268, 23824-23829, 1993；GenBank Accession number L23808）、ヒト成長ホルモンテイル（ｐＡＬ−１；カリフォルニア大学Dr. Glass, C.より）からなる７.４４ｋｂの発現ベクターを構築し（図１参照）、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び０．２５ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中に４〜８ｎｇ／μｌとなるように懸濁した。倒立微分干渉顕微鏡（オリンパス社製「ＩＸ７０」）を使用して２００倍の視野下、上記受精卵（２８０個）にマイクロインジェクションし、偽妊娠（仮親）雌ウサギの卵管内に移植したところ、２２羽の仔ウサギが産まれた。【００２２】実施例２（サザンブロット法によるヒトＭＭＰ−１２遺伝子の検出）
ゲノムＤＮＡを単離するために、生後１ヶ月のウサギの耳から生検用組織を切除し、消化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌプロテナーゼＫを含む０．５％ ＳＤＳ）において５５℃で一晩かけて消化させ、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ライフテックオリエンタル社製）を用いて抽出・精製した。得られたゲノムＤＮＡをＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより切断し、さらにＥｃｏＲＩにより切断することによって得られた１０μｇのゲノムＤＮＡを１％アガロースゲルで電気泳動し、ターボブロッターシステム（Schleicher and Schunell社製）によってナイロン膜に移した。次に、該膜上に固定したゲノム断片と、Prime-It IIランダム・プライマ・ラベリングキット（Stratagene社製）により合成された32ＰラベルのヒトＭＭＰ−１２ｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフィーにより外来導入遺伝子を検出した。
【００２３】生まれた２２羽中２羽（ファウンダー２及び３３）が、サザンブロット法により外来遺伝子が導入されたトランスジェニックウサギであることが明らかになった（図２参照）。また、ファウンダー２を正常ＪＷ系統野生型ウサギと掛け合わせることによって産み出されたＦ１ウサギの耳から生検用組織を切除し、上記と同様の方法でサザンブロット分析を行ったところ、ヒトＭＭＰ−１２遺伝子の存在を確認することができた（図２参照）。これらのことから、ヒトＭＭＰ−１２トランスジェニックウサギ（ファウンダー２及びファウンダー３３）は正常な繁殖能力を持ち系統化されていることがわかった。なお、これらトランスジェニックウサギは、筑波大学基礎医学系病理学研究室において継代されており、一定の条件下で関係者は分譲を受けることができる。
【００２４】実施例３（ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＭＭＰ−１２の発現解析）
ヒトＭＭＰ−１２のｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調べた。上記トランスジェニックウサギファウンダー２より得られたＦ１ウサギの肺胞マクロファージ及び腹腔内マクロファージからｍＲＮＡを抽出し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ライフテックオリエンタル社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡに対して、ヒトＭＭＰ−１２に対する特異的なプライマー［センスプライマー：5'-TTG GAG GGG ATG CAC ATT TC-3'（配列番号１）、アンチセンスプライマー：5'-AGT TTG GGA TAA CCA GGG TC-3'（配列番号２）］を用いてＰＣＲ反応を行った。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃で２分間変性させ、その後９４℃で３０秒間熱変性させ、５１℃で３０秒間アニーリングさせ、７２℃で２分間伸張するというサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間伸張を行った。その後、ＰＣＲ増幅産物を１．２％のアガロースゲル電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し２５４ｎｍの紫外線照射によりバンドを検出した。その結果を図３に示す。なお、図中のレーン１は野生型ウサギ由来の腹腔マクロファージ、レーン２は野生型ウサギ由来の肺胞マクロファージ、レーン３はトランスジェニックウサギ由来の腹腔マクロファージ、レーン４はトランスジェニックウサギ由来の肺胞マクロファージ、レーン５はヒト末梢血由来のマクロファージの結果をそれぞれ示し、ＭＷは分子量マーカーを意味する。この結果から、ヒトＭＭＰ−１２ｍＲＮＡはトランスジェニックウサギのマクロファージで特異的に発現していることがわかった。
【００２５】実施例４（ウエスタンブロット及び酵素活性解析）
ヒトＭＭＰ−１２の発現をタンパク質レベルで確認するために、抗ヒトＭＭＰ−１２抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。野生型ウサギ及びトランスジェニックウサギファウンダー２のＦ１から得られた腹腔内マクロファージをそれぞれ、１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（phorbol 12-myristate 13-acetate）存在下又は非存在下の無血清培地（RPMI-1640；日水製薬（株）社製）にて３７℃で２４時間培養し、培養上清をそれぞれ回収した。これらの培養上清を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、メンブレンフィルターにブロットし、抗ヒトＭＭＰ−１２ポリクローナル抗体を用いてヒトＭＭＰ−１２を検出した。その結果を図４に示す。なお、レーン１は野生型ウサギの腹腔マクロファージをＭＭＰ活性化剤であるＰＭＡ非存在下で培養したものであり、レーン２は野生型ウサギの腹腔マクロファージをＰＭＡ存在下で培養したものであり、レーン３はトランスジェニックウサギの腹腔マクロファージをＰＭＡ非存在下で培養したものであり、レーン４はトランスジェニックウサギの腹腔マクロファージをＰＭＡ存在下で培養したものである。この結果から、ＰＭＡで活性化されたトランスジェニックウサギのマクロファージからヒトＭＭＰ−１２タンパク質が分泌されていることがわかった。
【００２６】次に上記各培養上清を用いてZymography（酵素法）によりヒトＭＭＰ−１２の酵素活性を調べてみた。上記回収したそれぞれの培養上清を１ｍｇ／ｍｌのβ−カゼインを含む非変性１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ：Commassie Brilliant Blue）を用いて染色した。その結果を図５に示す。なお、図中の上の矢印は活性化したウサギＭＭＰ−１２によるカゼイン分解活性を示し、下の矢印は活性化したヒトＭＭＰ−１２によるカゼイン分解活性を示す。このことから、トランスジェニックウサギ由来のＰＭＡにより活性化されたマクロファージから分泌されたヒトＭＭＰ−１２がカゼインを消化し、酵素活性を持つことが確認できた。
【００２７】
【発明の効果】本発明のヒトＭＭＰ−１２を過剰発現するトランスジェニックウサギは、冠状動脈硬化プラークの破綻や動脈瘤の形成に及ぼすＭＭＰ−１２の役割を研究するためのヒト疾患モデル動物として有用であるばかりでなく、動脈硬化、関節リュウマチなどの慢性炎症、肺気腫あるいは癌の転移などの研究用ヒト疾患モデル動物としても有用である。
【００２８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION<120> Transgenic rabbits expressing human MMP-12<130> 11-255<140><141><160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Sense Primer<400> 1ttggagggga tgcacatttc 20 <210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Antisense Primer<400> 2agtttgggat aaccagggtc 20
【出願人】 【識別番号】３９６０２０８００
【氏名又は名称】科学技術振興事業団
【出願日】 平成１３年１月１８日（２００１．１．１８）
【代理人】 【識別番号】１００１０７９８４
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
【公開番号】 特開２００２−２０９４７２（Ｐ２００２−２０９４７２Ａ）
【公開日】 平成１４年７月３０日（２００２．７．３０）
【出願番号】 特願２００１−１０６７３（Ｐ２００１−１０６７３）