| 【発明の名称】 |
クルマエビの凍結保存法 |
| 【発明者】 |
【氏名】黒倉 寿
【氏名】照屋 和久
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| 【要約】 |
【課題】解凍後生存可能なクルマエビの凍結保存法の提供。
【解決手段】４〜６期のクルマエビノープリウスを、凍結保護物質含有水溶液に浸漬した後、０．２〜５℃／分の速度で少なくとも−３０℃まで冷却して凍結させ、次いで、−１５０℃以下に保持することを特徴とするクルマエビの凍結保存法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ４〜６期のクルマエビノープリウスを、凍結保護物質含有水溶液に浸漬した後、０．２〜５℃／分の速度で少なくとも−３０℃まで冷却して凍結させ、次いで、−１５０℃以下に保持することを特徴とするクルマエビの凍結保存法。
【請求項２】 ５又は６期のクルマエビノープリウスを用いるものである請求項１記載の凍結保存法。
【請求項３】 凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、エチレングリコール及びアドニトールから選ばれる１種又は２種以上である請求項１又は２記載の凍結保存法。
【請求項４】 凍結保護物質の濃度が０．５〜３．０mol／Ｌである請求項１〜３のいずれか１項記載の凍結保存法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、解凍後生存可能なクルマエビの凍結保存法に関する。
【０００２】
【従来の技術】解凍後生存可能な凍結保存方法については、細胞レベルでは成功しており、精子の保存、各種動物細胞の保存等に広く応用されている。しかし、細胞レベルでなく、生体の解凍後生存可能な凍結保存法についてはほとんど成功していない。
【０００３】ところで、クルマエビは養殖が広く行なわれているが、養殖場での各種細菌やウイルスへの感染は、その養殖場の閉鎖にもつながりかねないことから重要な問題である。当該感染の防止手段の開発のためには、未感染のクルマエビ生体がコントロールとして必要である。しかし、通常の環境で卵から生体を得ても全く感染しない生体はほとんど得ることができず、未感染の生体をくり返し、大量に得ることはほとんど不可能であった。これに対し、未感染の生体が得られた時に凍結保存できれば、感染実験のための材料が大量に確保できる。このようにクルマエビの生体を解凍後生存可能な凍結保存法が希求されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的は、クルマエビ生体の解凍後生存可能な凍結保存法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らはクルマエビの成長の種々の段階における凍結保存法を検討してきたところ、クルマエビの場合には、以前に本発明者らがフジツボで成功したノープリウスの前期では生存率は極めて低く、全く意外にもそれよりも成長した段階、すなわちノープリウスの後期において特定の条件下で凍結すれば解凍後の生存率が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、４〜６期のクルマエビノープリウスを、凍結保護物質含有水溶液に浸漬した後、０．２〜５℃／分の速度で少なくとも−３０℃まで冷却して凍結させ、次いで、−１５０℃以下に保持することを特徴とするクルマエビの凍結保存法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明において用いられるクルマエビは、ノープリウスの４〜６期であるが、５又は６期がより好ましい。ノープリウスの前期、すなわち、１〜３期では組織崩壊率が高く、解凍後の生残率が低下する。またノープリウスでなく、ゾエアでも組織崩壊率が高くなり、解凍後の生残率が低下する。
【０００８】クルマエビのノープリウスは、幼生であって、体がまだ頭胸部と腹部とに分化せず、正中線の前方に１個のノープリウス眼、その後方に口と消化管、左右に第一触角、第二触角、大顎の３対の付属肢をもつ段階である。その４期は、３期に出現した四対の腹肢が、外部に露出するのが特徴である。５期は、大顎の咀嚼面の始痕がほとんど球状となり、尾端の両側に１本の棘が増加し、計１２本となる。さらに尾端中央には紅色の色素胞がみられる。６期は、大顎の咀嚼面は臼状となり、内縁は鋸歯状となる。尾端の叉状は著しく発達し、左右の内側にそれぞれ１本の棘が出現し、合計１４本となる。卵黄はほとんど吸収される。
【０００９】本発明方法では、まずクルマエビノープリウスを凍結保護物質含有水溶液に浸漬する。ここで、凍結保護物質としては、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、エチレングリコール及びアドニトールから選ばれる１種又は２種以上が好ましい。このうち、エチレングリコールが特に好ましい。なお、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド又はエチレングリコールにアドニトールを組み合せて用いるのがより好ましい。
【００１０】凍結保護物質含有水溶液中の凍結保護物質濃度は、用いる凍結保護物質によって異なるが通常０．５〜３．０mol／Ｌが好ましい。浸漬時間は５〜６０分、特に５〜３０分が好ましい。この濃度範囲で少なくとも２段階、好ましくは２〜６段階、より好ましくは２〜４段階に順次濃度を上昇させた水溶液にノープリウスを一定時間、好ましくは２〜６０分、より好ましくは５〜３０分浸漬するのがより好ましい。例えば、１．０mol／Ｌ中に５分、次いで１．５mol／Ｌ中に１０分というように順次濃度が上昇した水溶液に浸漬する。かかる濃度段階的浸漬により、凍結保護物質水溶液にノープリウスが馴致し、生体に対する影響が少なくなる。
【００１１】次にクルマエビノープリウスを０．２〜５℃／分の速度で少なくとも−３０℃まで冷却して凍結する。凍結に至るまでの最も重要なことは、水の結晶のできる凝固点付近をうまく通過し、温度を下げることができるかである。すなわち、水が凍る時に熱を放出するため、凍る瞬間、一瞬温度が上昇する。その時の温度変化が小さいほど細胞に影響が少ない。そこで、上記の速度で冷却して凍結することにより凝固点前の保持時間をなくし、速やかに通過させることにより、解凍後の生残率を向上させることができる。より好ましくは、０．３〜５℃／分、さらに好ましくは０．５〜５℃／分の速度で−３５℃まで冷却して凍結させる。
【００１２】凍結したクルマエビノープリウスは、−１５０℃以下に凍結保持する。このように凍結されたクルマエビノープリウスは解凍後の生残率が５０％を超える。なお、生残率とは、生体の損傷がなく遊泳している個体及び生体の一部分が損傷していても、体の一部分が動いている遊泳個体も含む割合である。
【００１３】なお、本発明方法により凍結保存されたクルマエビノープリウスの解凍は、５０℃の水に５〜１０秒間、ストロー管ごと浸漬し、短時間で行うことが好ましい。そして解凍後は凍結保護物質含有水溶液に浸漬して海水溶液にもどすのが好ましい。当該浸漬は、凍結前の浸漬と逆の操作、すなわち高濃度の凍結保護物質含有水溶液に一定時間浸漬し、順次低濃度の海水溶液に変換していくのが好ましい。
【００１４】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１５】実施例１（１）３種類の凍結保護物質〔ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアアセトアミド、エチレングコール〕のクルマエビノープリウスに対する毒性を検討した結果、ＤＭＳＯは１〜１．５Ｍ（１．５モル濃度）で浸漬時間３０〜６０分の範囲で有効と考えられた。また、エチレングリコールは２Ｍで浸漬時間３０〜６０分で十分有効と考えられた。
【００１６】（２）凍結方法については２段階凍結方法（液体窒素（−１９６℃）に入れるまでの温度操作を１段階とし、−１９６℃へ入れた段階を２段階という）を用いた。
【００１７】（３）高濃度のＤＭＳＯへの浸漬は、浸透圧が大きくなり、生体へ影響することが示唆された（図１）。そのため、凍結保護物質の濃度を段階的に換え馴致する方法（表１）を用いたところ、生体には影響が少ないことがわかった（図２、図３）。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２１．５ＭのＤＭＳＯに、細胞内への浸透を助けるアドニトールを加えた液にノープリウスを浸漬して毒性試験を行った。その結果、１．５ＭのＤＭＳＯに０．４Ｍのアドニトールを添加するのが有効と考えられた。
【００２０】
【表２】
【００２１】１．５Ｍ ＤＭＳＯ及び０．４Ｍアドニトール含有水溶液に６０分間浸漬したノープリウス４期のクルマエビを、植水板と凍結板を有するプログラムフリーザーを用い、表３の冷却速度で冷却して凍結した。凍結ノープリウスを解凍して遊泳個体率を測定したところ、−２０℃において３５％程度の遊泳個体率を得ることができた（図４）。なお、解凍後は海水をスポイトで足して、徐々に凍結保護物質溶液の濃度を下げ、最終的に全海水にする。全海水にするまでの所要時間は１０〜１５分である。
【００２２】
【表３】
【００２３】実施例３次に分子量が小さく、体内への浸透の高い凍結保護物質のエチレングリコールを用いることとし、１〜４Ｍの範囲での経過時間に対する毒性試験をノープリウスの４期を用い再度行った。その結果、１〜２．５Ｍの範囲では、浸漬後６０分を経過した後も９０％以上の遊泳個体率が認められた。この結果を踏まえ、１．５Ｍ及び２．０Ｍのエチレングリコールへ１５分間の浸漬を行い、一次冷却でのノープリウスへの影響を調べた結果、２Ｍ浸漬の−２０℃で５４．４％の遊泳個体率を得ることができた。なおプログラムフリーザーは、表３に示した設定値を用いた。
【００２４】実施例４これまでの結果から、ノープリウスの齢期（１期〜４期）が進むにつれて生残率の向上や組織崩壊率が低下する傾向がみられることから、齢期ごとの検討を行った。凍結方法は、これまでの結果から２Ｍエチレングリコールを凍結保護物質として用い、浸漬時間は１５分とした。なおプログラムフリーザーの設定値は表４に示した。
【００２５】
【表４】
【００２６】幼生の齢期が進むにつれて一次冷却および凍結後の組織崩壊率は減少する傾向があり、凍結後では、最も低い幼生の齢期はノープリウスの６期であった（図５、図６）。それと比例して、生残率は幼生の齢期が進むにつれて高くなる傾向を示しており、凍結後の生残率では−３０℃および−３５℃まで一次冷却を行ったノープリウス５期、６期およびゾエアＩ期で５０％前後の生残率を示した（図７、図８）。一方、一次冷却中の遊泳個体率もノープリウスの齢期が進むにつれて高くなる傾向を示し、ノープリウス６期をピークにゾエアのＩ期では、再び減少した（図９）。凍結後では、ノープリウス６期の一次冷却温度−３０℃と−３５℃で１％の遊泳個体が観察されたが、その他の齢期では、遊泳個体は観察されなかったことから、凍結にはノープリウス６期が最も適していると考えられた（図１０）。
【００２７】
【発明の効果】本発明方法によれば、解凍後の生残率が高いので、未感染のクルマエビが大量かつ容易に確保できるので、解凍後は種々の感染実験用種苗として有用である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９２１１６３８３
【氏名又は名称】社団法人日本栽培漁業協会
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| 【出願日】 |
平成１３年１月２２日（２００１．１．２２） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６８７００
【弁理士】
【氏名又は名称】有賀 三幸 （外６名）
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２０９４６９（Ｐ２００２−２０９４６９Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年７月３０日（２００２．７．３０） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−１２７８１（Ｐ２００１−１２７８１） |
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