| 【発明の名称】 |
成熟種子胚軸を用いた遺伝子導入方法および遺伝子導入植物の作出方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】日高 操
【氏名】吉田 泰二
【氏名】寺内 英貴
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| 【要約】 |
【課題】遺伝子導入植物を簡便かつ効率的に得るため方法の提供。
【解決手段】成熟種子を水に浸漬し、該成熟種子の胚軸を切断して胚軸切片を作製し、得られた胚軸切片にアグロバクテリウム属の微生物を接種し、さらに接種後の胚軸切片を共存培養用培地で共存培養することを含む、植物への遺伝子導入方法、ならびに該方法により作出された植物。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 成熟種子胚軸を用いることを特徴とする、植物への遺伝子導入方法。
【請求項２】 以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１記載の遺伝子導入方法；
（ａ）成熟種子を水に浸漬する工程、（ｂ）水に浸漬した成熟種子の胚軸を切断して胚軸切片を作製する工程、（ｃ）胚軸切片にアグロバクテリウム属の微生物を接種する工程、（ｄ）接種後の胚軸切片を共存培養用培地で共存培養する工程。
【請求項３】 胚軸切片が０.５〜１.５mmの長さである、請求項２記載の遺伝子導入方法。
【請求項４】 胚軸切片が１mmの長さである、請求項３記載の遺伝子導入方法。
【請求項５】 胚軸切片が子葉節切断面を含む胚軸切片である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の遺伝子導入方法。
【請求項６】 植物がマメ科植物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子導入方法。
【請求項７】 マメ科植物がダイズである、請求項６記載の遺伝子導入方法。
【請求項８】 成熟種子胚軸を用いることを特徴とする、遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項９】 以下（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項８記載の遺伝子導入植物の作出方法；
（ａ）成熟種子を水に浸漬する工程、（ｂ）水に浸漬した成熟種子の胚軸を切断して胚軸切片を作製する工程、（ｃ）胚軸切片にアグロバクテリウム属の微生物を接種する工程、（ｄ）接種後の胚軸切片を共存培養用培地で共存培養する工程、（ｅ）共存培養後の胚軸切片を栄養培地上で培養して芽を再分化させる工程、（ｆ）再分化した芽を栄養培地上で発達させて植物体を作出する工程。
【請求項１０】 胚軸切片が０.５〜１.５mmの長さである、請求項９記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１１】 胚軸切片が１mmの長さである、請求項１０記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１２】 工程（ｅ）において、胚軸切片が子葉節切断面を含む胚軸切片であり、該胚軸切片の種皮側が下になるように、該胚軸切片を栄養培地に埋める、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１３】 工程（ｅ）において、胚軸切片が子葉節切断面を含む胚軸切片であり、該胚軸切片の根側が下になるように、該胚軸切片を栄養培地に置く、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１４】 工程（ｅ）において、胚軸切片が子葉節切断面を含まない胚軸切片であり、該胚軸切片の根側が上になるように、該胚軸切片を栄養培地に置く、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１５】 工程（ｅ）において、胚軸切片が子葉節切断面を含まない胚軸切片であり、該胚軸切片の根側が下になるように、該胚軸切片を栄養培地に置く、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１６】 工程（ｄ）において、胚軸切片を共存培養用培地に埋めて培養する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１７】 工程（ｅ）において、胚軸切片を軸に対して垂直に２つに切断した後、元の切断面が栄養培地に接するように該培地上に置く、請求項１６記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１８】 遺伝子導入植物がマメ科植物である、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の遺伝子導入植物の作出方法。
【請求項１９】 マメ科植物がダイズである、請求項１８載の遺伝子導入植物の作出方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、成熟種子胚軸を用いて植物に遺伝子を導入する方法、および成熟種子胚軸から遺伝子導入植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組み換えダイズはすでに未熟種子（Christou,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,86,7500-7504(1989)；McCabe,D.E.ら、Bio/technology,6, 923-926(1988)；Parrot,W.A.ら、Plant Cell Reports,7,615-617(1989)；Sato,S.ら、Plant CellReports,12,408-413(1993)）、未熟種子由来カルス（Finer,J.ら、In Vitro Cell. Dev. Biol.,27P,175-182(1991)；Liu,W.ら、Plant Cell, Tissue and OrganCulture,47,33-42(1996)；Samoylov,V.M.ら、Plant Cell Reports,18,49-54(1998)；Sato,S.ら（上掲）；Stewart,C.N.ら、Gene.Plant Physiol.,112,121-129(1996)）および発芽種子(幼植物体または苗ともいう)の子葉節（Chee,P.P.ら、Plant Physiol.,91,1212-1218(1989)；Di,R.ら、Plant Cell Reports,15,746-750(1996)；Meurer,C.A.ら、Plant Cell Reports,18,180-186(1998)）を用いて作出されている。しかし、未熟種子由来カルスおよび発芽種子子葉節からの植物体については、各種の変異が発生していることが報告されている（Barwale,U.B.ら、Plant CellReports,6,365-368(1987)；Graybosch,R.A.ら、Crop Sci,27(803-806)(1987)；Hawbaker,M.S.ら、Theor.Appl.Genet.,87,49-53(1993)；Amberger,L.A.ら、CropSci.,32,1103-1108(1992)）。また、発芽種子子葉節を用いた場合、形質転換されていない既存の芽原基から芽が発生し、再生植物体に形質転換細胞と非形質転換細胞が混在すること（キメラ現象）が指摘されている(McCabe,D.E.ら（上掲）；Christou.P.ら（上掲）；Sato,S.ら(上掲))。また、いずれの方法も、操作が煩雑で、また、形質転換効率が低いこと、形質転換植物体が得られるまで長期間かかることが指摘されている。
【０００３】芽原基を含まない胚軸を材料として用いた場合、形質転換植物体がキメラになる率が低いと推測され、形質転換の材料として有力であると考えられる。胚軸を材料として用いた例としては、最近、発芽後14日目の苗の胚軸からの芽形成がサイトカイニンを用いて報告されているが（Kaneda,Y.ら、Plant Cell Reports,17,8-12(1997)）、形質転換植物体作出の報告例はない。
【０００４】成熟種子を材料に用いた場合、操作が簡便であるが、植物体再生の報告は少ない。例えば、１晩水に浸漬した成熟種子の子葉の基部からの植物体の再生の報告があるが（Mante,S.ら、In Vitro Cellular & Developmental Biology,25(4),385-388(1989)）、形質転換植物体の報告例はない。また、子葉の基部は成長点に近い部位であるので既存の芽原基が生長する可能性があり、形質転換の材料に用いた場合、キメラ現象が起こる可能性が推測される。成熟種子胚軸を材料とする植物体再生の報告はない。
【０００５】従って、今後、ダイズの形質転換の効率化を図るためには、再分化植物体が変異を含まないこと、キメラ現象を少なくすること、操作が簡便で、短期間で結果が得られることが重要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、植物、特にダイズに効率的に遺伝子を導入する方法を提供すると共に、遺伝子導入植物、特に遺伝子導入ダイズを効率的に作出する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するために本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、従来は植物体再生が認められなかった成熟種子胚軸を材料として用い、該胚軸を切断して０.５mm〜１.５mm、好ましくは１mmの長さの胚軸切片とすることにより、その切断面から芽が形成されることを見出した。さらに、該胚軸切片の置床条件を検討することにより、芽を再分化させようとする切断面に応じて置床条件を変更することで極めて高い芽形成効果があることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】すなわち本発明は、成熟種子胚軸を用いることを特徴とする、植物への遺伝子導入方法である。また本発明は、成熟種子胚軸を用いることを特徴とする、遺伝子導入植物の作出方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の植物への遺伝子導入方法は、成熟種子胚軸を用いることを特徴とする。また、本発明の遺伝子導入方法は、以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする；
（ａ）成熟種子を水に浸漬する工程、（ｂ）水に浸漬した成熟種子の胚軸を切断して胚軸切片を作製する工程、（ｃ）胚軸切片にアグロバクテリウム属の微生物を接種する工程、および（ｄ）接種後の胚軸切片を共存培養用培地で共存培養する工程。
【００１０】本発明の遺伝子導入方法に用いる植物は、その成熟種子胚軸が利用可能である限り特に限定されるものではないが、例えば、マメ科植物であるインゲンマメ、エンドウ、ササゲ、ソラマメ、ダイズ、ナンキンマメ、ヒヨコマメ属、ウリ科植物であるカボチャ、メロン属、バラ科植物であるリンゴ、ナシ、サクラ属の植物を挙げることができる。また、限定するものではないが、ダイズ属（Glycine）としては例えばダイズ（Glycine max）を挙げることができる。成熟種子胚軸を利用し得るダイズ品種としては、例えば、おおすず、エンレイ、コスズ、スズカリ、スズユタカ、タチユタカ、タマホマレ、Fayette、Ilosoy、Jack、Lee、Williamsを挙げることができるが、これに限定されない。これらの成熟種子は、必要に応じて農林水産省農業生物資源研究所遺伝資源第２部遺伝資源管理情報科或いは東北農業試験場作物開発部育種工学研究室から分譲により入手することができる。
【００１１】以下、各工程について詳しく説明する。
（ａ）成熟種子を水に浸漬する工程成熟種子を当業者に公知の手法に従い、例えば７０％アルコールで３０秒、引き続いて１０％アンチホルミン（次亜塩素酸ナトリウム溶液有効塩素５％以上、和光純薬工業株式会社）で１５分処理して滅菌、水洗する。次に、成熟種子を種子の上面から水面までの幅が５mm程度に水に浸漬する。種子を完全に水中に浸漬することにより、種子の発芽を抑制できる。また、乾燥した種子を浸漬することにより、種子が膨潤し、種子、子葉、幼芽と胚軸の分離および胚軸の切断を容易にすることができる。浸漬する期間は、２時間〜１週間、好ましくは２時間〜３日間とする。長時間の浸漬が雑菌の汚染を招く場合、浸漬時間を２〜６時間とすることができる。
【００１２】（ｂ）水に浸漬した成熟種子の胚軸を切断して胚軸切片を作製する工程次に、種皮、子葉、幼芽を取り除いて成熟種子胚軸を得る。この時点で、約６〜７mm長の胚軸が得られる。この胚軸を当業者に公知の手法により、胚軸の軸の方向に対して垂直に切断して、遺伝子導入材料とする胚軸切片を作製する。本発明の遺伝子導入方法において用いる胚軸切片としては、限定するものではないが、０.５〜１.５mm、好ましくは１mmの長さの胚軸切片がその遺伝子導入効率および芽形成能の点から好ましい。また、該胚軸切片は、子葉節からの距離が０〜１mmである(すなわち子葉節切断面を含む)胚軸切片、および子葉節からの距離が１〜２mmである胚軸切片が好ましい。
【００１３】（ｃ）胚軸切片にアグロバクテリウム属の微生物を接種する工程胚軸切片へのアグロバクテリウム属の微生物の接種は、当業者に公知のアグロバクテリウム法に従って、例えば、目的とする遺伝子を含むベクターを導入したアグロバクテリウム属の微生物を含む接種用培地に前記胚軸切片を漬け、その後これを培養することにより実施する。
【００１４】アグロバクテリウム属の微生物としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciences)が好ましく、特にEHA101株(名古屋大学 中村研三博士より、必要に応じて分譲により入手可能）が好ましいが、これに限定されない。アグロバクテリウム属の微生物に導入するベクターとしては、pBI121（Clontech）等の一般的なベクターを用いることができるが、これに限定されない。
【００１５】またベクターは、目的とする遺伝子の他に、例えばレポーター遺伝子、選抜マーカー遺伝子、プロモーター遺伝子等の他の遺伝子を含有していてもよい。レポーター遺伝子としては、例えばGUS遺伝子を挙げることができるが、これに限定されない。選抜マーカー遺伝子としては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を挙げることができるが、これに限定されない。また、プロモーター遺伝子としては、例えばオメガ（Mitsuhara,I.ら、Plant Cell Physiol.,37,49-59(1996)）を挙げることができるが、これに限定されない。
【００１６】具体的には、本発明の方法で使用するベクターとして、pBE7133GUS(Mitsuhara(1996))のGUS遺伝子をイントロンGUS遺伝子(Ohta(1990))に変えたベクターpBE7133intronGUSを挙げることができる。尚、該ベクターは本発明者らにより構築されたものである。目的とする遺伝子および他の遺伝子の前期ベクターへの組み込み、このベクターのアグロバクテリウム属の微生物への導入は、当業者に公知の手法により実施することができる。
【００１７】接種用培地としては、植物細胞を培養するために通常用いられている培地を用いることができるが、遺伝子導入効率を上げるため、アセトシリンゴン等のフェノール化合物を接種用培地に添加することが必要である。
【００１８】具体的には、接種用培地として、例えばＢ５無機塩(Gamborg,O.L.ら、Exp.cell Res.,50,151-158(1968))、ＭＳビタミン(Murashige,T.ら、Physiol.Plant.,15,473-497(1962))、４μMチジアズロン（TDZ）、２％ショ糖および１００μMアセトシリンゴンからなる培地(ｐＨ５.７)を用いることができるが、これに限定されない。尚、この培地を用いる場合、アセトシリンゴンのみジメチルスルホキシドに溶かし、規定濃度になるようオートクレーブ後に前記培地に加える。
【００１９】接種用培地における前記微生物の濃度は、前記微生物により前記胚軸切片に十分に遺伝子導入が行われる濃度であれば特に限定されないが、例えば、接種用培地１mLあたり１０9個の微生物菌体とすることができる。
【００２０】前記接種用培地への胚軸切片の処理方法は、胚軸の活性および芽形成能が低下しない条件であれば特に限定するものではないが、例えば、胚軸切片を５mLの接種用培地の入った５０mL試験管中で処理することが好ましい。処理した前記胚軸切片の培養条件は、例えば、２２℃、暗黒下で、時々アグロバクテリウム属の微生物と該胚軸切片とがなじむように穏やかに振りながら５〜３０分の培養、とすることができるが、これに限定されない。
【００２１】（ｄ）接種後の胚軸切片を共存培養用培地で共存培養する工程さらに、接種を確実にするため、上記接種処理の終わった胚軸切片を共存培養用培地で培養する。共存培養は、胚軸切片の遺伝子導入したい切断面を培地上に接するように置くかまたは培地中に埋めることにより行う。
【００２２】共存培養用培地は、植物細胞を培養するために通常用いられている培地を用いることができるが、該胚軸のもつ芽形成能を低下させないため、サイトカイニン（例えば、TDZ、べンジルアミノプリン、カイネチン、ゼアチン）を加えることが好ましい。また、遺伝子導入効率の向上のため、アセトシリンゴン等のフェノール化合物を共存用培地に添加することが必要である。
【００２３】具体的には、例えばＢ５無機塩、ＭＳビタミン、４μM TDZ、２％ショ糖、１００μMアセトシリンゴン、１.４％寒天、ｐＨ５.７からなる培地を用いることができるが、これに限定されない。共存培養条件は、植物培養の際に用いられる条件であれば特に限定されないが、好ましくは温度条件は２２℃以下とする。また光条件は０〜３０００lux、好ましくは０luxとする。さらに、共存培養の日数は２〜５日、好ましくは３日とすることができるが、これに限定されない。
【００２４】以上の操作により、植物（胚軸切片）に遺伝子が導入される。尚、植物に目的とする遺伝子が導入されたか否かは、当業者に公知の手法により、例えば、接種開始３〜６日後のGUSトランジェントアッセイ（GUS遺伝子の発現ベクターの導入された細胞が、青色に呈色する反応を利用して、遺伝子の導入効率を測定する方法で、具体的には、GUS遺伝子導入処理ダイズの胚軸を、反応溶液（１mM X-gluc〔5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Cyclohexylammonium Salt〕、50mMリン酸ナトリウム緩衝液〔pH7.0〕、10mM EDTA、0.1%Triton X-100、0.1%Sarkosyl、10mM２−メルカプトエタノール）に、３７℃、２４時間浸けた後、遺伝子導入効率を測定する）により確認することができる。この際、遺伝子導入細胞はいずれの切断面でも観察されるが、共存培養用培地に埋まっているか接している切断面での遺伝子導入効率が高く、空気中にある切断面での遺伝子導入効率は低い。また、子葉節切断面(すなわち胚軸において子葉節から０mmの切断面)では全体的に遺伝子導入効率が高いが、特に茎頂分裂組織周辺の組織で高い。一方、子葉節以外の胚軸切断面(例えば、子葉節から１または２mmの距離にある切断面)では、該切断面の周囲部分の遺伝子導入効率が高い。従って、遺伝子導入植物体は子葉節では茎頂分裂組織周辺、子葉節以外の胚軸切断面では該切断面の周囲部分で効率的に得られる。
【００２５】本発明の遺伝子導入植物の作出方法は、成熟種子胚軸を用いることを特徴とする。また本発明の遺伝子導入植物の作出方法は、以下(ａ)〜（ｆ）の工程を含むことを特徴とする；
（ａ）成熟種子を水に浸漬する工程、（ｂ）水に浸漬した成熟種子の胚軸を切断して胚軸切片を作製する工程、（ｃ）胚軸切片にアグロバクテリウム属の微生物を接種する工程、（ｄ）接種後の胚軸切片を共存培養用培地で共存培養する工程、（ｅ）共存培養後の胚軸切片を栄養培地上で培養して芽を再分化させる工程、および（ｆ）再分化した芽を栄養培地上で発達させて植物体を作出する工程。
【００２６】本発明の遺伝子導入植物の作出方法により得られる植物は、その成熟種子胚軸が由来する植物である限り特に限定されるものではないが、例えばマメ科植物であるインゲンマメ、エンドウ、ササゲ、ソラマメ、ダイズ、ナンキンマメ、ヒヨコマメ属、ウリ科植物であるカボチャ、メロン属、バラ科植物であるリンゴ、ナシ、サクラ属の植物を挙げることができる。また、限定するものではないが、ダイズ属（Glycine）としては例えばダイズ（Glycine max）を挙げることができる。
【００２７】以下、工程（ｅ）および（ｆ）について説明する。尚、工程（ａ）〜（ｄ）については、本発明の遺伝子導入方法の説明箇所において既に詳述してある。
【００２８】（ｅ）共存培養後の胚軸切片を栄養培地上で培養して芽を再分化させる工程まず、前述の工程（ｄ）において共存培養した胚軸切片に付着しているアグロバクテリウム属の微生物を除菌し、その後栄養培地を用いて、遺伝子導入した胚軸切片から芽を再分化させる。除菌は、例えば、前記の共存培養培地をカルベニシリン、セフォタキシム等の抗生物質を含んだ液体培地で洗浄することにより実施することができるが、これに限定されない。この洗浄はアグロバクテリウム属の微生物による白濁が見られなくなるまで行う。その後、さらに除菌の効果を上げるため、低速の振とう培養を行うこともできる。この振とう培養は、例えば、１〜３日間程度、３〜４回培地を交換することにより実施できるが、これに限定されない。目安としては、培地が白濁し始めたと同時に培地を交換し、１日以上培養して液が透明な場合のみ次のステップに進むこととする。
【００２９】除菌に使用する培地の種類は、植物細胞の培養に通常用いられる培地であって、かつ胚軸切片の芽形成能を低下させない培地であれば特に限定されるものではないが、サイトカイニン、例えば、TDZ、ベンジルアミノプリン、カイネチン、ゼアチン等を加えることが好ましい。具体的には、かかる培地として、例えばＢ５無機塩、ＭＳビタミン、４μM TDZ、２％ショ糖、５００mMカルベニシリン、ｐＨ５.７からなる培地を用いることができるが、これに限定されない。
【００３０】除菌後、栄養培地を用いて、遺伝子導入した胚軸切片から芽を再分化させる。使用する栄養培地としては、上記同様に、植物細胞の培養に通常用いられる培地であって、かつ胚軸切片の芽形成能を低下させない培地であれば特に限定されないが、サイトカイニン、例えば、TDZ、ベンジルアミノプリン、カイネチン、ゼアチン等を加えることが好ましい。特にTDZを加えることが好ましい。
【００３１】さらに、遺伝子導入された組織(胚軸切片)を選抜するために、前記栄養培地中に選抜マーカーを加えることができる。選抜マーカーとして抗生物質を用いる場合、限定するものではないが、例えば、カナマイシン、ハイグロマイシンBを栄養培地中に加える。この場合、栄養培地１L当たりの抗生物質の濃度は、カナマイシンでは５０〜１５０mg／L、ハイグロマイシンBでは２０〜３０mg／Lとすることが好ましいが、これに限定されない。
【００３２】また、アグロバクテリウム属の微生物の増殖を防ぎ、除菌を完全にするため、前記栄養培地にカルベニシリン、セフォタキシム等のアグロバクテリウム除菌用の抗生物質を加えることが望ましい。この場合、栄養培地１L当たりの抗生物質の濃度は、５０〜２５０mg／Lとすることが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】具体的には、前記栄養培地として、例えばＢ５無機塩、ＭＳビタミン、４μMTDZ、２％ショ糖、１００mg／Lカナマイシン、１００mg／Lカルベニシリン、１.４％寒天、ｐＨ５.７からなる培地を用いることができるが、これに限定されない。
【００３４】胚軸切片の前記栄養培地への置床方法は、芽を再分化させることのできる方法であれば特に限定されないが、例えば、胚軸切片が子葉節切断面を含む胚軸切片である場合には、該胚軸切片の種皮側が下になるようにして栄養培地に埋めるか、または該胚軸切片の根側が下になるようにして栄養培地に置くことが好ましい。種皮側が下になるように栄養培地に埋めた場合、特に該胚軸切片の子葉節切断面から芽が効率的に再分化される。また根側が下になるように栄養培地に置いた場合、該胚軸切片の根側の切断面から芽が効率的に再分化される。あるいは、胚軸切片が子葉節切断面を含まない胚軸切片である場合には、該胚軸切片の根側が上になるようにして栄養培地に置くか、または該胚軸切片の根側が下になるようにして栄養培地に置くことが好ましい。この場合には、それぞれ子葉節側の切断面および根側の切断面から芽が効率的に再分化される。
【００３５】さらに、前述の工程（ｄ）において胚軸切片を共存培養用培地に埋めて培養する場合、この胚軸切片を軸に対して垂直に２つに切断した後、元の切断面が栄養培地に接するように該培地上に置くことが好ましい。これは、胚軸切片を培地中に埋めることにより該胚軸切片の両切断面の細胞が遺伝子導入されるからである。
【００３６】上記の栄養培地および置床条件を使用して、胚軸切片を、通常の植物細胞の培養条件下で、例えば２５℃、３０００ルックス（１６時間日長）で３０日間培養することにより、胚軸切片の切断面から芽が再分化される。再分化された芽は、子葉節切断面では、主に茎頂分裂組織あるいは茎頂分裂組織の周辺組織から形成される。一方、子葉節以外の切断面では、切断面の周囲で芽が形成される。これは、先に述べた高いGUS活性の部位と一致する。
【００３７】形成された芽をさらに生育させるため、茎の伸長を促すホルモンを加えた培地に移植する。十分生育させた後、発根に有効なホルモンを加えた培地に移植し発根させることにより、遺伝子導入植物体を得ることができる。
【００３８】茎の伸長を促すホルモンとしては、例えばジベレリン酸を挙げることができるが、これに限定されない。また、発根に有効なホルモンとしては、例えば３−インドール酪酸、３−インドール酢酸を挙げることができるが、これに限定されない。芽の生育および発根条件は、それぞれ例えば、培地としてＢ５無機塩、ＭＳビタミン、１μMジベレリン酸、２％ショ糖、０．４％寒天、ｐＨ５．７からなるものを用い、２５℃、１６時間の日長（３０００lux）で培養（芽の生育条件）、および培地としてはＢ５無機塩、ＭＳビタミン、１μM３−インドール酪酸、２％ショ糖、０.２％ゲルライト、ｐＨ５.７からなるものを用い、２５℃、１６時間の日長（３０００lux）で培養（発根条件）とすることができるが、これに限定されない。
【００３９】上記操作により得られた遺伝子導入植物体における遺伝子の導入および発現の確認は、当業者に公知の手法に従って、例えば該遺伝子の配列を元に作成したプライマーを用いて、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法またはノーザンハイブリダイゼーション法により実施することができる。さらに、当業者に公知の組織化学的手法、例えばGUS活性測定法（GUS遺伝子の発現ベクターを導入した組織が、青色に呈色する反応を利用して、遺伝子の導入および発現の強弱を測定する方法）によって導入した遺伝子の活性を確認することにより、該遺伝子の発現を確認することができる。
【００４０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕成熟種子胚軸からの芽形成条件の検討東北地域の主要奨励ダイズ品種である「おおすず」の成熟種子を７０％エタノール液に３０秒、１０％アンチホルミン液に１５分浸け、その後滅菌水で洗浄することにより殺菌し、これを滅菌水で４〜６時間浸漬した。成熟種子を水に浸漬することにより、本来は直径８mm前後の大きさの成熟種子が長さ１５mm、幅１０mm程度にまでふくらんだ。この成熟種子から種皮、子葉、茎頂を取り除いて胚軸を得た。得られた胚軸は長さの平均は６.８１mmであった。成熟種子を浸漬することにより、乾燥した成熟種子に比較して、種皮、子葉、茎頂と胚軸の分離および胚軸の切断が容易になった。次に、得られた成熟種子胚軸を、子葉節からの距離が１mmおよび２mmの距離にある所で、胚軸の軸に対して垂直に切断して、２種の胚軸切片(各１mm)を作製した。
【００４１】上記２種の胚軸切片を材料として使用し、４μMのチジアズロン(TDZ)を加えたＢ５改変寒天培地（Ｂ５無機塩(Gamborg,O.L.ら、Exp.cell Res.,50,151-158(1968))、ＭＳビタミン(Murashige,T.ら、Physiol.Plant.,15,473-497(1962))、２％ショ糖、１.４％寒天、ｐＨ５.７）において、胚軸切片の４種の切断面での芽形成率の違い、および置床方法が該切片の芽形成率に及ぼす影響を調べた。
【００４２】まず、子葉節から０〜１mmの胚軸切片の子葉節を含む切断面および根側の切断面をそれぞれＣＮおよびＨ１、ならびに子葉節から１〜２mmの胚軸切片の子葉節側の切断面および根側の切断面をそれぞれＨ２およびＨ３とした。また、置床方法は、前記胚軸切片の■根側を下に縦向きに培地上に置く、■根側を上に縦向きに置く、■外側（種皮側）を下に横向きに置く、■内側（子葉側）を下に横向きに置く、■根側を下に縦向きに培地中に埋める、■根側を上に縦向きに埋める、■外側を下に横向きに埋める、の７通りとした。培養は２５℃、３０００lux（白色灯、１６時間日長）で７週間実施した。以上の操作を４回反復して行い（各反復１０切片）、各芽形成数の平均をとった。得られた結果を下記表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】（結果）ＣＮ(子葉節から０〜１mmの切片、子葉節側切断面)では、どの置床条件においても芽形成が認められた。また、特に胚軸切片の外側を下に埋める(■)と効果的であった。一方、Ｈ１(子葉節から０〜１mmの切片、根側切断面)、Ｈ２(子葉節から１〜２mmの切片、子葉節側切断面)およびＨ３(子葉節から１〜２mmの切片、根側切断面)では、置床方法により芽の形成率が著しく異なった。すなわち、縦向きに培地に置いた場合(■および■)は、培地に接している切断面のみから芽が形成された。また、横向きにおいた場合(■および■)はＨ２のみで培地に接した部位から低率で芽形成が認められた。縦向きに埋めた場合(■および■)、培養中に生長し、下の位置の切断面が培地に接するようになり、接した切断面より低率で芽が形成された。さらに、横向きに埋めた場合(■)は、Ｈ１〜Ｈ３のいずれの切断面においても芽形成は認められなかった。
【００４５】〔実施例２〕 チジアズロン(TDZ)の濃度が成熟種子胚軸からの芽形成に及ぼす影響の検討次に、実施例１と同様に調製した胚軸切片(切断面Ｃ１、Ｈ１〜Ｈ３)を、種々の濃度(０, ０.２, ０.４, １, ２, ４, １０μM)のTDZを加えたＢ５改変寒天培地に根側切断面を下に向けて置いて、実施例１と同様に培養し、TDZ濃度が成熟種子胚軸の芽形成に及ぼす影響を調べた。結果を下記表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】（結果）ＣＮ(子葉節から０〜１mmの子葉節側切断面)では、TDZの濃度に関係なく芽が形成された。また、Ｈ１(子葉節から０〜１mmの根側切断面)では、４μMのTDZで高い芽形成率(８３％)を示した。一方、Ｈ３(子葉節から１〜２mmの根側切断面)では１０μMのTDZで芽形成率が向上したものの、２３％に留まった。
【００４８】〔実施例３〕品種間における芽形成能の比較下記表３に列挙したダイズ品種の成熟種子を用いて実施例１と同様に調製した胚軸切片(切断面Ｃ１、Ｈ１〜Ｈ３)を、それぞれ根側の切断面を下に向けて４μM TDZを加えたＢ５改変寒天培地に置いた場合に、その芽形成能に品種間差がみられるか否かを調べた。培養は実施例１に記載した通りに行った。結果を下記表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】（結果）ＣＮ(子葉節から０〜１mmの子葉節側切断面)では、全ての品種において高率で芽の形成が認められた。一方、Ｈ１(子葉節から０〜１mmの根側切断面)およびＨ３(子葉節から１〜２mmの根側切断面)では、品種間によりその芽形成能に差が認められた。
【００５１】〔実施例４〕 胚軸の長さが成熟種子胚軸からの芽形成に及ぼす影響の検討ダイズ品種「おおすず」の成熟種子胚軸上部を、０.５７mm、１.１４mmおよび２.２７mmの長さの切片に切断し、根側切断面を下に向けて４μM TDZを加えたＢ５改変寒天培地に置き、実施例１と同様に培養し、胚軸の長さが成熟種子胚軸の芽形成に及ぼす影響を調べた。結果を下記表４に示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】（結果）長さ０.５７mmの胚軸切片において、子葉節からの距離が１.１４mmまでの根側切断面で、６２〜４２％の芽形成率を示し、長さ１.１４mmの胚軸切片において、子葉節からの距離が１.１４mmの根側切断面において高い芽形成率(９６％)を示した。一方、長さ２.２７mmの胚軸切片の根側切断面においては、芽の形成は認められなかった。
【００５４】〔実施例５〕 成熟種子の浸漬時間が芽形成に及ぼす影響の検討ダイズ品種「おおすず」を用いて、成熟種子の浸漬時間が芽形成に影響を及ぼすか否かを調べた。浸漬時間は、下記表５に示す通り、２時間〜７日間とした。浸漬後、実施例１と同様にして胚軸を単離し、該胚軸を子葉節からの距離が１mmの所で切断して、胚軸切片（長さ１mm）を作製、根側の切断面を下に向けて４μM TDZを加えたＢ５改変寒天培地上に置いた。培養は実施例１に記載した通りに行った。結果を併せて下記表５に示す。
【００５５】
【表５】
【００５６】（結果）種子の浸漬時間が２時間から３日間の場合、芽形成率は７８〜９５％と高率であった。種子の浸漬時間が５日間の場合、芽形成率３５％に留まった。
【００５７】〔実施例６〕遺伝子導入ダイズの作出ダイズ品種「Williams 82」の成熟種子を、７０％エタノールで３０秒、１０％アンチホルミン（次亜塩素酸ナトリウム溶液、有効塩素５％以上、Wako品名コード197-02206）で１５分表面を滅菌した。滅菌処理は直径９０mm高さ２０mmのシャーレ（TERUMO品名コードSH-20S）を用いて行い、滅菌水で成熟種子を４回以上洗い、滅菌液を完全に取り除いた。その後、種子を滅菌水で３時間、室温で浸漬した。次に、種皮、子葉、茎頂を、ピンセットを用いて取り除いて胚軸(長さ約６mm)を得た。次に、得られた胚軸を、メスを用いて、胚軸上部の子葉節からの距離が約１mmのところで切断し、子葉節部分を含む約１mmの切片を作製し、遺伝子導入ダイズを作出するための材料として用いた。
【００５８】まず、pBE7133GUS（Mitsuhara(1996)）のGUS遺伝子をイントロンGUS遺伝子（Ohta,S.ら、Plant Cell Physiol.,31,805-813(1990)）に変えたベクターpBE7133intronGUSを構築した。次に、このベクターを電気融合装置（BIO-RAD Gene Pulser）でアグリバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciences） EHA101株(名古屋大学 中村研三博士より分譲により入手)に導入した。
【００５９】この菌株を、５０mg／Lのカナマイシンと５０mg／LのハイグロマイシンBとを含む１.２％バクトアガー（DIFCO品名コード214010）を加えたLB培地（DAIGO、Wako品名コード396-00871）上で２５℃で２〜３日間培養し、耐性菌を得た。さらに、PCRによりベクターの導入が確認された菌を−８０℃で保存し、以下の操作に用いた。導入の確認は、コロニーPCR法により、カナマイシン抵抗性遺伝子を検出するためのプライマーセット（kan1：5'-GCACAACAGACAATCGGCT-3' [配列番号１]、kan2：5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCG-3' [配列番号２]）をPremix Taq(Ex Taq,、TaKaRa、品名コードRR003A)に加えて反応し、アガロース電気泳動を行って、約７００bpの増幅DNAの有無により判定した。PCR条件は、変性：94℃,1分、アニーリング：55℃,1分、伸長：72℃,1分で30サイクルであった。
【００６０】次に、上記で得られた菌を、更に５０mg／Lのカナマイシンと５０mg／LのハイグロマイシンBとを含むLB培地で、１２０spm（毎分１２０往復）、２５℃、暗黒下で一昼夜培養した。その後、培地を毎分３０００回転（TOMY LC06)で遠心して菌を沈殿させ、接種用培地に該培地１mLあたり１０9個の細胞となるように混ぜた。尚、接種用培地は、Ｂ５無機塩(Gamborg,O.L.ら、Exp.cell Res.,50,151-158(1968))、ＭＳビタミン(Murashige,T.ら、Physiol.Plant.,15,473-497(1962))、４μM TDZ、２％ショ糖および１００μMアセトシリンゴンからなるものであった(ｐＨ５.７)。アセトシリンゴンのみジメチルスルホキシドに溶かし、規定濃度になるようオートクレーブ後に前記培地に加えた。
【００６１】胚軸切片への接種には５０mL試験管を用い、前記培地１０mLに５０個の胚軸切片を入れた。接種処理は、時々菌と切片がなじむように緩やかに振り、１５分行った。操作は温度が２２℃になるよう調節したクリーンベンチ（TABAI Cleartron）内で行った。
【００６２】接種処理後、胚軸切片を濾紙上に置き、軽く接種用培地を除いた。次に、前記接種用培地にさらに１.４％寒天を加えた共存培養用培地２０mLを直径９０mm高さ２０mmのシャーレ中に入れ、該培地に前記胚軸切片５０個を胚軸を横向きに埋め、３日間、２２℃で暗黒下で培養した。
【００６３】次に、胚軸切片を上記培地から取り出し、除菌用培地(Ｂ５無機塩、ＭＳビタミン、４μM TDZ、２％ショ糖および５００mg／Lのカルベニシリン、ｐＨ５.７)を用いて、洗浄液が透明になるまで洗浄した。この洗浄処理は、前記胚軸切片を、前記除菌用培地を７.５mL入れた直径６０mmのシャーレ（IWAKIコード3010-060）に３回移し変えることにより行った。
【００６４】さらに前記と同じ除菌用培地を用い、直径６０mmのシャーレに該培地を７.５mL、胚軸切片３０個を入れ、３日間、毎分４０回転で旋回培養することで除菌を継続した。この際、培養条件は２５℃、２０００lux（白色灯、１６時間日長）とした。培地は１日１回交換した。
【００６５】３日間の培養後、胚軸切片をさらに横に２つに切断し、元の切断面が選抜用培地(Ｂ５無機塩、ＭＳビタミン、４μM TDZ、２％ショ糖、１.４％寒天、ｐＨ５.７に、２５０mg／Lのカルベニシリンと１００mg／Lのカナマイシンを加えたもの)に接する様にして該培地上に置いた。この際、直径９０mm高さ２０mmのシャーレに前記培地を２０mL入れ、２０個の胚軸切片(さらに横に２つに切断したもの)を置いて培養した。カルベニシリンおよびカナマイシンについては、培地温度が固化直前になるまで低下した後、規定濃度になる様に培地に加えた。培養条件は２５℃、３０００lux（白色灯、１６時間日長）とした。３週間後、同じ培地に移植し、同じ条件下でさらに３週間培養した。
【００６６】選抜用培地に胚軸切片を移してから６週間後には、１０.２％（１４７切片の内、１５切片）の切片の子葉節切断面と７.５％（１４７切片の内、１１）の切片の根側切断面とに緑色の球状体あるいは芽が認められた。
【００６７】これらの内の一部において、X-Gluc (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロン酸)を用いた組織化学的な方法(GUS遺伝子導入処理ダイズの葉を１mmの切片に切断し、反応溶液（１mM X-gluc gluc 〔5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Cyclohexylammonium Salt〕、50mMリン酸ナトリウム緩衝液〔pH7.0〕、10mM EDTA、0.1%Triton X-100、0.1%Sarkosyl、10mM２−メルカプトエタノール）に、３７℃、２４時間浸けた。GUS遺伝子が導入されている場合のみ、葉は青色を呈するのでGUS遺伝子の導入を確認できる)でβ−グルクロニダーゼ活性（GUS活性）が認められ、GUS遺伝子が導入された組織であることが確認された。
【００６８】GUS活性が確認された緑色部位あるいは芽の生長を促すため、直径９０mm高さ２０mmのシャーレに伸長用培地２０mLを入れ、該培地に緑色部位あるいは芽が形成された胚軸切片５〜６個をやや埋めるようにして移植した。伸長用培地としては、Ｂ５無機塩、ＭＳビタミン、１μM ジベレリン酸、２％ショ糖、０.４％寒天、ｐＨ５.７に１００mg／Lのカルベニシリンを加えた培地を用いた。カルベニシリンは培地温度が固化直前になるまで低下した後、規定濃度になる様に培地に加えた。培養は、培養は、２５℃、３０００ルックス（白色灯、１６時間日長）で行った。
【００６９】１ヶ月後、１cm以上に生長した芽を胚軸切片から丁寧に単離し、発根用培地に移植した。発根用培地としては、Ｂ５無機塩、ＭＳビタミン、１μM３−インドール酪酸、２％ショ糖、０.２％ゲルライト、ｐＨ５.７からなるものを用いた。直径９０mm高さ２０mmのシャーレに前記培地を２０mL入れ、単離した５〜６個の芽をやや埋めるようにして移植し、培養した。培養は、２５℃、３０００ルックス（白色灯、１６時間日長）で行った。
【００７０】培養後、発根した小植物体をフロリライト２２２（旭テクノグラス（株）品名コードFL0222）を４個入れた角型培養瓶（容量６５５mL）に移植した。フロリライトには、塩濃度とビタミン濃度およびショ糖濃度をいずれも１／２にしたＢ５改変培地（１／２塩濃度のＢ５無機塩、１／２濃度のＭＳビタミン、１％ショ糖）を規定量(２５.６mL／４個フロリライト）含ませた。この段階までの培養は無菌状態で行った。
【００７１】発根個体を十分生育させた後、クレハ園芸培土（呉羽化学（株））に移植した。この際、フロリライト、培地等は洗い流さず、フロリライトがついた状態でそのまま移植した。最初は大きめのビーカー等と寒冷紗で保護し、徐々に温室の条件（温度が１７〜２５℃）に馴らし、さらに生育させてダイズ植物体を得た。得られたダイズ植物体を以後遺伝子導入処理ダイズと称する。
【００７２】次に、得られた遺伝子導入処理ダイズのDNAに遺伝子が導入されていることを確認するためにPCR法による解析を行った。まず、GUS遺伝子導入処理ダイズ、非遺伝子導入処理ダイズ（対照）、およびGUS遺伝子導入形質転換タバコ（ポジティブコントロール）の各個体の本葉約0.1gからDNA抽出キットPHYTOPURE（Amersham、品名コードRPN8510） を用いてDNAを抽出した。抽出DNA（約100ng）を鋳型として、GUS遺伝子の断片（６６８bp）を検出するためのプライマーセット（Forward Primer：5'-GCAACGTCTGGTATCAGCGC-3' [配列番号３]、Reverse Primer： 5'-ACGGTTTGTGGTTAATCAGG-3' [配列番号４]）を含む反応液（1xGold PCR Buffer、2mM MgCl2、200μM dNTPs、0.5μM Forward Primer、0.5μM Reverse Primer、0.05units Ampli taq Gold〔Applied Biosystems、品名コード4311806〕）を用いてPCRを行った。PCRは、９５℃で１０分間処理した後、９４℃での変性１分間、５７℃でのアニーリング１分間、７２℃での伸長１分間の反応を３０サイクル行った（最終サイクルの伸長反応は２分間延長した）。PCR終了後、アガロースゲル電気泳動法によりGUS遺伝子の増幅の確認を行った。結果を図１aに示す。
【００７３】（結果）遺伝子導入処理ダイズからは約700bpの易動度のバンドが検出され、予想されたPCR産物の易動度（６６８bp）と一致していた（レーン１）。また、ポジティブコントロールとして使用した形質転換タバコ（レーン２）および遺伝子導入に用いたプラスミド（レーン4）から増幅されたPCR産物の易動度とも一致した。また、非遺伝子導入処理ダイズ（C）およびネガティブコントロールの滅菌蒸留水（レーン３）からは、バンドは検出されなかった。この結果から遺伝子導入処理ダイズにGUS遺伝子が導入されていることが確認された。
【００７４】さらに、サザンハイブリダイゼーションによりGUS遺伝子の導入を確認した。遺伝子導入処理ダイズと非遺伝子導入処理ダイズ（対照）の本葉から、超遠心法によりそれぞれゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNA（５μg）を制限酵素EcoRＩ（TaKaRa、品名コード1040A）で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲル中のDNAをエチジウムブロマイド染色によって確認した後、Hybond-N+（Amersham、品名コードRPN303B）にアルカリブロッティングした。プローブの標識、ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出はDNA検出キットAlkphosDirect（Amersham、品名コードRPN3680）の説明書に従った。ブロッティングが終了したメンブレンはハイブリダイゼーション溶液に浸し、５７℃で３時間プレハイブリダイゼーションをした後、アルカリホスファターゼで標識したDNAプローブ（GUS遺伝子）を加えて５７℃で１８時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンはPrimary wash buffer（2M Urea、50mM Na-phosphate〔pH7.0〕、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.1％SDS、0.2％Blocking reagent）で２０分間（５７℃）３回の洗浄を行った後、Secondary wash buffer（50mM Tris-base 100mM NaCl、pH10.0）で５分間（室温）２回振盪した。洗浄終了後、Detection reagent（Amersham、品名コードRPN3682）をメンブレン上で５分間反応させ、メンブレンをサランラップに包んで３時間オートラジオグラフィーを行った。結果を図１bに示す。
【００７５】（結果）非遺伝子導入処理ダイズ（C）では検出されない３本のバンドが遺伝子導入処理ダイズ（レーン１）において検出された。これは遺伝子導入処理ダイズのゲノムDNA上にGUS遺伝子が３箇所以上導入されていることを示している。この結果より、遺伝子導入処理ダイズのゲノムDNAにGUS遺伝子が確実に導入されていることが確認された。
【００７６】また、ノーザンハイブリダイゼーションにより、遺伝子導入処理ダイズの植物体中においてGUS遺伝子からRNAが転写されていることを確認した。まず、遺伝子導入処理ダイズ、非遺伝子導入処理ダイズ（対照）、およびGUS遺伝子を導入した形質転換タバコ（ポジティブコントロール）の各個体の本葉２５mgからTRIZOLReagent（GIBCO BRL、品名コード15596-018）を用いてRNAを抽出した。全量の抽出RNAにRNA溶液の２.７倍容量の変性溶液（69％ホルムアミド、24％ホルマリン、6.9％10×MOPS〔0.2Mモルホリノプロパンスルホン酸、50mM酢酸ナトリウム、10mM EDTA・2Na、pH7.0〕）を加え６５℃で２０分間処理し、冷却後エチジウムブロマイドと５０％グリセロールを含む色素（ブロモフェノールブルー）液を加えた後、２２％ホルマリン、１×MOPSを含む１％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲル中のRNAをUV照射で確認した後、RNAをHybond-N+（Amersham 、品名コードRPN303B）にアルカリブロッティングした。ブロッティングが終了したメンブレンはハイブリダイゼーション溶液（50％ホルムアミド、5×SSC〔75mMクエン酸ナトリウム、750mM NaCl、pH7.0〕、0.1％N-ラウロイルサルコシンナトリウム、0.02％SDS、2％Blocking reagent〔ロシュ・ダイアグノスティックス、品名コード1096176〕）に浸し、６８℃で３時間プレハイブリダイゼーションをした後、DIG RNA Labeling Mix (ロシュ・ダイアグノスティックス、品名コード1277073)を用いて標識した標識RNAプローブ（GUS遺伝子のアンチセンス鎖）を用いて６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンは洗浄液１（2×SSC、0.1％SDS）で５分間（室温）２回洗浄した後、さらに洗浄液２（0.1×SSC、0.1％SDS）で２０分間（６８℃）４回洗浄した。次にメンブレンを洗浄液３（0.3％Tween-20を含むバッファー1〔0.1Mマレイン酸、0.15M NaCl、pH7.5〕）で５分間（室温）処理した後、ブロッキングバッファー（Blocking reagent：バッファー1＝1：9）で１時間３０分間（室温）処理しブロッキングを行った。ブロッキング終了後、メンブレンはAnti-Digoxigenin-.AP.Fab fragments（ロシュ・ダイアグノスティックス、品名コード1093274）をブロッキングバッファーで１／２００００に希釈した抗体液中で３０分間（室温）反応させた。抗体反応終了後、メンブレンを洗浄液３で２５分間（室温）４回洗浄し、さらにバッファー４（0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、50mM MgCl2、pH9.5）中で５分間（室温）振盪した。続いてバッファー３で１／１０に希釈した基質CDP-Star（ロシュ・ダイアグノスティックス、品名コード1685627）と５分間反応させた後、サランラップに包んで１時間オートラジオグラフィーを行った。結果を図１ｃに示す。
【００７７】（結果）非遺伝子導入処理ダイズ（C）では検出されないバンドが遺伝子導入処理ダイズ（レーン１）において検出された。また、このバンドの易動度はポジティブコントロールとして使用した形質転換タバコ（レーン２）から検出された、バンドの易動度と一致していた。この結果から、遺伝子導入処理ダイズ植物体中においてGUS遺伝子から確実にRNAが発現されていることが確認された。
【００７８】さらに、組織化学的な方法により、GUS遺伝子の導入を確認した。具体的には、遺伝子導入処理ダイズの葉を１mmの切片に切断し、反応溶液（１mM X-gluc gluc 〔5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Cyclohexylammonium Salt〕、50mMリン酸ナトリウム緩衝液〔pH7.0〕、10mM EDTA、0.1%Triton X-100、0.1%Sarkosyl、10mM２−メルカプトエタノール）に、３７℃で２４時間浸けた。
【００７９】（結果）遺伝子導入処理ダイズの葉は青色を呈した。これはすなわち、遺伝子導入処理ダイズの葉においてβ−グルクロニダーゼ活性（GUS活性）が認められたことを意味し、遺伝子導入処理ダイズ組織に確実にGUS遺伝子が導入されていることが更に確認された。（データは示さず）。これらのことから、本発明の手法により、目的の遺伝子が植物に導入され、さらに形質が発現していることが証明された。
【００８０】
【発明の効果】本発明の遺伝子導入方法および遺伝子導入植物の作出方法によれば、所望の遺伝子が導入された植物を簡便かつ迅速に作出することができる。
【００８１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Tohoku National Agricultural Experiment Station, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries ; Japan Science and Technology Corporation<120> Method for plant transformation by using hypocotyls of mature seeds and production of transgenic plants<130> P00-0958<160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer kan1.<400> 1gcacaacaga caatcggct 19 <210> 2<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer kan2.<400> 2aagaaggcga tagaaggcg 19 <210> 3<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: Forward primer used to detect the fragment of GUS gene.<400> 3gcaacgtctg gtatcagcgc 20 <210> 4<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: Reverse primer used to detect the fragment of GUS gene.<400> 4acggtttgtg gttaatcagg 20 【００８２】
【配列表フリーテキスト】配列番号３：GUS遺伝子の断片を検出するために使用したフォワードプライマー。
配列番号４：GUS遺伝子の断片を検出するために使用したリバースプライマー。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５０１２０３３４４
【氏名又は名称】独立行政法人 農業技術研究機構
【識別番号】３９６０２０８００
【氏名又は名称】科学技術振興事業団
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| 【出願日】 |
平成１３年２月２８日（２００１．２．２８） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００９１０９６
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２５３０７０（Ｐ２００２−２５３０７０Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年９月１０日（２００２．９．１０） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−５４４３３（Ｐ２００１−５４４３３） |
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