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【発明の名称】 トランスジェニック植物種子におけるタンパク質産生
【発明者】 【氏名】ユ ス−メイ

【氏名】チェン クオ−ジョアン

【氏名】リュ リ−フェイ

【氏名】シャウ ジェイ−フ
【要約】 【課題】リンまたは炭水化物の豊富な飼料のための原料として有用な種子を生成するトランスジェニック植物を提供すること。

【解決手段】トランスジェニック植物であって、このゲノムＤＮＡが、プロモーター、および加水分解酵素をコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含み、ここで、該プロモーターが、該トランスジェニック植物の発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、または実生の植物種子組織において、該加水分解酵素の発現を駆動する、トランスジェニック植物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 トランスジェニック植物であって、このゲノムＤＮＡが、プロモーター、および加水分解酵素をコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含み、ここで、該プロモーターが、該トランスジェニック植物の発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、または実生の植物種子組織において、該加水分解酵素の発現を駆動する、トランスジェニック植物。
【請求項２】 前記加水分解酵素が、前記トランスジェニック植物の前記植物種子組織中に天然に存在する基質を加水分解する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】 前記植物が、イネ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、またはアブラナ植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】 前記プロモーターが、α−アミラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】 前記プロモーターが、αＡｍｙ８プロモーターである、請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】 前記プロモーターが、グルテリン遺伝子プロモーターである、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】 前記酵素がフィターゼである、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】 前記酵素が、アミロプルラナーゼまたはα−アミラーゼである、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】 請求項１に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項１０】 前記種子が発芽している、請求項９に記載のトランスジェニック種子。
【請求項１１】 請求項２に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項１２】 前記種子が発芽している、請求項１１に記載のトランスジェニック種子。
【請求項１３】 請求項３に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項１４】 前記種子が発芽している、請求項１３に記載のトランスジェニック種子。
【請求項１５】 請求項４に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項１６】 前記種子が発芽している、請求項１５に記載のトランスジェニック種子。
【請求項１７】 請求項５に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項１８】 前記種子が発芽している、請求項１７に記載のトランスジェニック種子。
【請求項１９】 請求項６に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項２０】 前記種子が発芽している、請求項１９に記載のトランスジェニック種子。
【請求項２１】 請求項７に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項２２】 前記種子が発芽している、請求項２１に記載のトランスジェニック種子。
【請求項２３】 請求項８に記載のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子。
【請求項２４】 前記種子が発芽している、請求項２３に記載のトランスジェニック種子。
【請求項２５】 加水分解酵素を生産する方法であって、該方法が、請求項１に記載のトランスジェニック植物を提供する工程、該トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取する工程、および該トランスジェニック種子を発芽させて該加水分解酵素を生産する工程を包含する、方法。
【請求項２６】 前記トランスジェニック種子から前記加水分解酵素を単離する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】 ポリペプチドを産生する方法であって、該方法が以下の工程：トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡが、α−アミラーゼプロモーター、およびポリペプチドをコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含む、該トランスジェニック植物を提供する工程；該トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取する工程；該トランスジェニック種子を発芽させて成熟種子を生産する工程；ならびに該成熟種子から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項２８】 前記単離する工程において、前記ポリペプチドが、前記成熟種子の胚または内乳から単離される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】 ポリペプチドを産生する方法であって、該方法が以下の工程：トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡが、グルテリン遺伝子プロモーター、およびポリペプチドをコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含む、該トランスジェニック植物を提供する工程；該トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取する工程；該トランスジェニック種子を発芽させる工程；ならびに該種子の胚組織または内乳組織から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項３０】 トランスジェニック植物を調製する方法であって、植物に、プロモーター、および加水分解酵素をコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を移入する工程であって、ここで、該プロモーターが、該トランスジェニック植物の発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、または実生の植物種子組織において、該加水分解酵素の発現を駆動する、工程を包含する、方法。
【請求項３１】 請求項３０に記載の方法によって調製されたトランスジェニック植物から生産されたトランスジェニック種子を調製する方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トランスジェニック植物、より詳細には、リンまたは炭水化物の豊富な飼料のための原料として有用な種子を生成するトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】薬学的タンパク質および産業用酵素の生成のためのトランスジェニック植物の使用が提唱されてきている。一般に、組換えタンパク質の発現は、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換または粒子ボンバードメントを用いる、異種遺伝子の宿主植物ゲノムへの安定な組み込みに依存する。費用面においては、農場植物を使用する商業的に価値のあるタンパク質の生成は、複雑かつ高度な維持管理のバイオリアクターを必要とする他の生物学的生成系（例えば、酵母培養物、細菌培養物、または哺乳動物細胞培養物）より、より競合的である。さらに、植物におけるタンパク質生成は、より大量に生成するために容易にスケールアップされうる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、リンまたは炭水化物の豊富な飼料のための原料として有用な種子を生成するトランスジェニック植物を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、トランスジェニック植物であって、このゲノムＤＮＡが、プロモーター、および酵素をコードしかつこのプロモーターに作動可能に連結されるヌクレオチド配列を有する遺伝子を含み、ここで、このプロモーターが、発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、またはこのトランスジェニック植物の実生の植物種子組織において、この加水分解酵素の発現を駆動する、トランスジェニック植物に関する。
【０００５】より詳細には、本発明は以下の通りである。
【０００６】本発明は、トランスジェニック植物であって、このゲノムＤＮＡが、プロモーター、および加水分解酵素をコードしかつ上記プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含み、ここで、上記プロモーターが、上記トランスジェニック植物の発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、または実生の植物種子組織において、該加水分解酵素の発現を駆動する、トランスジェニック植物を提供する。
【０００７】１つの実施態様では、上記加水分解酵素は、上記トランスジェニック植物の前記植物種子組織中に天然に存在する基質を加水分解する。
【０００８】別の実施態様では、上記植物は、イネ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、またはアブラナ植物である。
【０００９】別の実施態様では、上記プロモーターは、α−アミラーゼ遺伝子プロモーターである。好ましくは、このプロモーターは、αＡｍｙ８プロモーターである。さらに別の実施態様では、上記プロモーターは、グルテリン遺伝子プロモーターである。
【００１０】別の実施態様では、上記酵素はフィターゼである。さらに別の実施態様では、上記酵素は、アミロプルラナーゼまたはα−アミラーゼである。
【００１１】本発明は、上記の本発明のトランスジェニック植物から生産される、トランスジェニック種子もまた提供する。
【００１２】１つの実施態様では、上記種子は発芽している。
【００１３】本発明はまた、加水分解酵素を生産する方法を提供し、この方法は、上記トランスジェニック植物を提供する工程、該トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取する工程、および該トランスジェニック種子を発芽させて該加水分解酵素を生産する工程を包含する。
【００１４】１つの実施態様では、上記の加水分解酵素を生産する方法は、上記トランスジェニック種子から前記加水分解酵素を単離する工程をさらに包含する。
【００１５】本発明はさらに、ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、以下の工程：トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡが、α−アミラーゼプロモーター、およびポリペプチドをコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含む、該トランスジェニック植物を提供する工程；該トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取する工程；該トランスジェニック種子を発芽させて成熟種子を生産する工程；ならびに該成熟種子から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する。
【００１６】１つの実施態様では、上記のポリペプチドを産生する方法は、上記単離する工程において、上記ポリペプチドが、前記成熟種子の胚または内乳から単離される。
【００１７】本発明はまた、ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、以下の工程：トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡが、グルテリン遺伝子プロモーター、およびポリペプチドをコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を含む、該トランスジェニック植物を提供する工程；該トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取する工程；該トランスジェニック種子を発芽させる工程；ならびに該種子の胚組織または内乳組織から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する。
【００１８】本発明はまた、トランスジェニック植物を調製する方法を提供し、この方法は、植物に、プロモーター、および加水分解酵素をコードしかつ該プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む遺伝子を移入する工程であって、ここで、該プロモーターが、該トランスジェニック植物の発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、または実生の植物種子組織において、該加水分解酵素の発現を駆動する、工程を包含する。
【００１９】本発明はまた、上記のトランスジェニック植物を調製する方法によって調製されたトランスジェニック植物から生産されたトランスジェニック種子を調製する方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、加水分解酵素が、植物種子組織において活性なプロモーターを有し、かつこの加水分解酵素をコードする配列の転写を駆動するトランスジーンを用いてトランスジェニック種子において発現される場合、（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ生成酵素と比較して）予測されるより、より高い比活性を有するという発見に基づく。
【００２１】より具体的には、本発明は、トランスジェニック植物（例えば、トランスジェニックイネ、トランスジェニックオオムギ、トランスジェニックライ麦、またはトランスジェニックアブラナ植物）を特徴とし、このトランスジェニック植物のゲノムＤＮＡは、プロモーター（例えば、α−アミラーゼプロモーター（例えば、αＡｍｙ８遺伝子のプロモーター）またはグルテリンプロモーター）および加水分解酵素をコードし、そしてこのプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。このプロモーターは、発生中の種子、発芽中の種子、発芽した種子、またはトランスジェニック植物の実生の植物種子組織において加水分解酵素の発現を駆動する。この酵素は、植物種子組織中に天然に存在する基質を必要に応じて加水分解する。この酵素が、フィターゼである場合、酵素はまた、酸性ホスファターゼ（例えば、ａｐｐＡ遺伝子によってコードされる酵素）、またはＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ（例えば、ＡＴＣＣ ５５７８５として入手可能であるＪＹ３５株）由来のフィターゼ（例えば、ｐｈｙＡ遺伝子によってコードされる酵素）であり得る。この酵素が（例えば、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓの）アミロプルラナーゼである場合、この酵素はまた、α−アミラーゼであり得る。本発明はまた、上記のトランスジェニック植物から生産されたトランスジェニック種子を含む。本明細書中に記載される場合、「種子」は、発生中の種子、成熟種子、発芽中の種子、発芽した種子、または実生であり得る。従って、本発明はさらに、本発明のトランスジェニック植物を提供し、このトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取し、この種子を発芽させ、そして必要に応じて、このトランスジェニック種子から加水分解酵素を単離することによって加水分解酵素を生成する方法を特徴とする。
【００２２】本発明はまた、トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡがαアミラーゼプロモーターおよびポリペプチドをコードし、かつこのプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を有する遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供し；このトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取し；このトランスジェニック種子を発芽させて成熟種子を生成し；そしてこの成熟種子から（例えば、成熟種子の胚組織または内乳組織から）このポリペプチドを単離することによってポリペプチドを生成する方法を特徴とする。トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡがグルテリン遺伝子プロモーターおよびポリペプチドをコードし、かつこのプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を有する遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供し；このトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を採取し；このトランスジェニック種子を発芽させ；そしてこの種子の胚組織または内乳組織からこのポリペプチドを単離することによってポリペプチドを生成する方法がまた、本発明に包含される。
【００２３】本明細書中に使用される場合「フィターゼ」は、フィチン酸（ｐｈｙｔａｔｅ）またはフィチンと反応して、単胃動物のＧＩにおいて吸収性であるリンまたはリンを含む部分を放出する酵素である。従って、フィチン酸由来の無機リンまたはリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を放出するホスファターゼは、やはりフィターゼである。
【００２４】他方のエレメントに「作動可能に連結され」ている一方の遺伝子エレメントとは、一方の遺伝子エレメント（プラス鎖、マイナス鎖、または二重鎖形態のいずれか）が、他方の遺伝子エレメントを作動またはそれに影響を及ぼすように構造的に構成されていることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターは、このプロモーターがこのポリペプチドをコードする核酸の転写を開始することを意味する。
【００２５】発芽は、種子による水の取り込みとともに開始し（インビビション）、そして胚軸（通常は幼根）による伸長の開始とともに終了する。従って、発芽は、実生の生長を包含せず、実生の生長は、発芽が終了したときに開始する。発芽が完了するためには、幼根は伸長し、そして周辺の構造物を貫通しなければならない。発生中の種子は、発芽している種子または実生の生長を支持する種子である。本明細書中で使用される場合、用語「実生」は、ｄｅ Ｖｏｇｅｌ「Ｔｈｅ Ｓｅｅｄｌｉｎｇ」、Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ，Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄＤｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、第９〜２５頁、１９８３に記載されるように、発芽している種子から生長した幼若植物を意味する。
【００２６】αアミラーゼ遺伝子プロモーターおよびシグナルペプチド配列は、酵素オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または遺伝子の上流で融合され得、このオープンリーディングフレームまたは遺伝子は、種々の供給源に由来し得る。次いで、キメラ遺伝子は、植物（例えば、穀類）ゲノムに導入される。例えば、高レベルのフィターゼを生成する麦芽製造した（ｍａｌｔｅｄ）トランスジェニック穀粒は、ヒトの消費、動物飼料、または食品加工に使用され得る。麦芽製造は、穀粒が、制御された条件下、および一貫した製品を製造するための控えめな（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）施設において発芽される過程である。
【００２７】食餌として加水分解酵素を生成するようにトランスジェニック麦芽製造種子を使用する利点としては、以下が挙げられる：（１）この種子は、容易に運びやすくかつ壊れにくい、容易に利用可能な形態で多量の栄養素および無機物を含む；（２）この種子中の栄養素は、例えば、フィチン酸によりキレート化されない；（３）麦芽製造した種子においては、麦芽製造した種子がビール製造および食品産業において長い間使用されており、そしてヒトおよび動物に無害であることが公知であるために、食餌の消費者についての毒性がほとんど予測されない；そして（４）外因性の酵素を原料に添加する必要がないために、単胃動物の飼料を製造するコストが低減される。
【００２８】さらに、本発明のトランスジェニック植物、またはその器官および種子を使用して、種々の産業プロセスのための加水分解酵素を生成し得る。このような適用の例は、非反芻動物のための飼料添加物において、大豆加工において、食品加工において、またはフィチン酸由来のイノシトールまたはイノシトールリン酸の生成においてである。
【００２９】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲からも明らかである。
【００３０】（発明の詳細な説明）本発明は、リンまたは炭水化物の豊富な飼料のための原料として有用な種子を生成するトランスジェニック植物に関する。この種子および得られた飼料の優れた性質は、植物の種子組織中で活性なプロモーターを含む導入遺伝子（そして、それはトランスジェニック植物の種子組織において酵素を高度に発現する）の挿入に起因する。当然、この酵素は、本発明が提供する利点に影響することなく、トランスジェニック種子または植物のいずれにおいても発現され得る。このような植物から産生された種子は、導入遺伝子を含まないコントロールの植物と比較して、フィチン酸を低下し、そして食餌のリン含量を増加し得るか、または複合糖質を低下し、そして単純糖質を増加し得る。
【００３１】フィチン酸（ミオ−イノシトールヘキサキスホスフェート）は、多くの種子においてリンの主要な貯蔵形態である。フィチンは、ｍｙｏ−イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）のカリウム塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩の不溶性の混合物である。穀物、脂肪種子およびマメにおいて、フィチン酸塩は成熟中に種子に蓄積し、そして種子の総リン含量の５０％〜８０％を占める。ダイズおよびトウモロコシ粒粉は、動物飼料の主要な成分である。それらは、フィチン酸塩由来のリンが動物により消化可能（すなわち、吸収可能）である限り、動物の成長要求を満たすために十分なリンのレベルを含む。反芻動物（複数の胃の動物）は、容易にフィチン酸を切断し、消化可能なリンを遊離する。しかし、単胃動物（例えば、ブタ、家禽および魚）は、ごくわずかしかフィチン酸を利用しない。なぜならそれらの動物は、フィチン酸塩を加水分解し得る胃腸（ＧＩ）管の酵素を欠失するからである。この欠失により食餌要求を満たすリンを有する動物飼料の補充が必要になる。さらに、フィチン酸は、重要な陽イオン（鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛、カルシウム、銅およびモリブデンを含む）をキレートし、そしてフィチン酸−陽イオン−タンパク質複合体を形成し、それにより飼料中のミネラルおよびアミノ酸のバイオアベイラビリティーを低下させる。従って、本発明は、動物の飼料のために用いられる原料においてフィチン酸の分解によりリンを放出する手段を提供する。
【００３２】本発明のトランスジェニック植物または種子において生成されるフィターゼはまた、トウモロコシまたはモロコシの穀粒を浸漬するプロセスにおいて用いられ得る。植物組織または種子は、浸漬トウモロコシへの添加前に粉にされ得る。植物組織または種子から遊離したフィターゼは、多くのトウモロコシ調製物に存在するフィチン上で作用し得る。トランスジェニックな穀類の粒は（それがトウモロコシまたはモロコシの穀粒である場合）、フィターゼを産生し、インサイチュでフィチンを分解し得る。トウモロコシ浸漬におけるフィチンの分解は、栄養含量を増加し、そして結果的にトウモロコシ浸漬液（動物の飼料として、または微生物発酵における栄養物として用いられる）の商業的価値を上昇させる。さらに、フィチンの分解は、トウモロコシ浸漬液の濃縮、移動および貯蔵の間のフィルター、パイプ、リアクター容器などへのフィチンの沈着物の蓄積に関する問題を防ぎ得る。フィターゼの作用はまた、トウモロコシ湿式製粉に関与する浸漬プロセスおよび分離プロセスを促進し得る。
【００３３】さらに、デンプン加水分解酵素（例えば、アミロプルラナーゼ（ａｍｙｌｏｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ））を含有するトランスジェニック種子の使用は、穀類の穀粒デンプンを用いる糖の産生のための食品産業およびワイン産業において現在用いられるプロセスに適合し得、そして望ましい。イネは、世界の人口の５０％より多くのための食物の主要な供給源を提供し、そして地上で最も重要でかつ広範に栽培される穀物である。その大きなバイオマスに起因して、イネの種子は、食品産業およびワイン産業のための可溶性の糖の理想的な供給源である。プルラナーゼ活性およびα−アミラーゼ活性の両方を保有する、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ３９Ｅ由来のアミロプルラナーゼ（ＡＰＵ）は、ポリサッカライドのα−１，４およびα−１，６結合の両方を加水分解し得、そして熱安定性であり９０℃が触媒至適条件である。一般に、イネは６〜１０重量％のタンパク質および７０〜８０重量％のデンプンを含む。ＡＰＵは、デンプンを加水分解して、可溶性の糖を生成し、そして同時に不溶性の米粉の相対的組成を増加させ得る。高タンパク質の米粉は、高い栄養価を有し、そしてプリン（ｐｕｄｄｉｎｇ）、粥、即席ミルク、ベビーフードなどの生産に有用である。以下に示すように、Ｔ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓの成熟ＡＰＵ（全１４８１アミノ酸）のアミノ酸７５〜１０２９をコードするＡＰＵ遺伝子の２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが、単離されそして特徴づけされた。この短縮ＡＰＵは、α−アミラーゼ活性およびプルラナーゼ活性の両方を維持している。種子のデンプンからの糖の生産において、二重活性ＡＰＵを含有するトランスジェニックイネ種子の使用は、生産プロセスを簡単にし、そして米粉についての生産コストを有意に低下する。
【００３４】植物へ挿入される導入遺伝子を構築するために必須の遺伝子エレメントは、容易に利用可能である。例えば、α−アミラーゼプロモーターは、米国特許第５，４６０，９５２号および以下の実施例に記載される。他の適切なプロモーターは、以下に記載される：ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２５７〜２６８，１９９０；Ｂｒｕｓｓｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７７９１〜７７９５，１９９２；Ｗｉｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：４１１〜４２２、１９９３；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：８８５〜８９６，１９９５；Ｋａｕｋｉｎｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：１１１５〜１１２８、１９９６；Ｂｅａｕｄｏｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：８３５〜８４６、１９９７；Ｍｏｏｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：７６２〜７６７、１９９７；Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０〜８１２、１９８５；およびＳｕ−Ｍａｙ ＹｕおよびＹｕ−ＣｈａｎＣｈａｏが発明者として名前が記載されている、２０００年５月２２日出願の「Ｐｌａｎｔ Ｓｅｅｄｌｉｎｇ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ」と題される米国特許出願。他の遺伝子エレメント（例えば、シス調節配列）はまた、当業者により利用可能である。例えば、米国特許第５，９６９，１２７号を参照のこと。
【００３５】導入遺伝子を含む発現構築物は、ベクター（例えば、プラスミド）に挿入され得る。次いでこれは、当該分野で公知の標準的方法である、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介ＤＮＡ送達または微粒子ボンバードメントを用いて植物に導入される。
【００３６】酵素をコードするＤＮＡ配列は、微生物、植物または動物の供給源のような種々の供給源から入手され得る。例えば、フィターゼをコードするＤＮＡ配列は、例えば、細菌のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または異種プローブもしくは縮重プローブを用いる核酸のＰＣＲ増幅によって、反芻胃の細菌からクローニングされ得る。
【００３７】本明細書において記載されたクローニングされた遺伝子は、「第２世代の」酵素（そのアミノ酸配列は、変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発）により変更されている）の構築のための出発材料として用いられ得る。この第２世代の酵素は、野生型酵素または組換え酵素の特性と異なる有利な特性を有する。例えば、温度または至適ｐＨ、比活性または基質親和性は、規定されたプロセスにおける適用のためにより適切になるよう変更され得る。
【００３８】酵素コードＤＮＡ配列を含有する発現構築物を植物またはトランスジェニック植物を産生し得る細胞に導入するために、いくつかの技術が、利用可能である。このような技術としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、超音波法、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、ポリＬオルニチン法、リン酸カルシウム法、および粒子ボンバードメントが挙げられる。
【００３９】これらのいわゆる直接のＤＮＡ形質転換法に加えて、ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ由来）および細菌ベクター（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来）のようなベクターを含む形質転換系が広範に利用可能である。選択および／またはスクリーニング後、形質転換されたプロトプラスト、細胞または植物部分（例えば、外植片）は、当該分野で公知の方法を用いて、植物全体に再生され得る。
【００４０】穀類作物の形質転換および再生のために、本発明の１実施態様は、バイナリーベクター系（Ｈｏｅｋｅｍａら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９〜１８０、１９８３；および欧州特許出願番号０１２０５１６）の原理を用いる。この系では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、ビルレンス遺伝子を有するｖｉｒプラスミドおよび移入されるべき遺伝子構築物と適合可能なプラスミドを含有する。この実施例において用いる場合、バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡの左右のボーダー配列の間に、ハイグロマイシン耐性をコードするｈｐｈ遺伝子、および遺伝子構築物の挿入のためのマルチクローニング部位を含む。
【００４１】フィターゼの発現を指向するために用いられるプロモーターは、α−アミラーゼ遺伝子プロモーターであり得る。αアミラーゼ遺伝子プロモーターは、穀類作物の発芽中の種子（Ｈｕｔｔｌｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．８：１９０７〜１９１３、１９８９；Ｓｋｒｉｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７２６６〜７２７０、１９９１；Ｌａｎａｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：２０３〜２１１、１９９２；Ｔａｎｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：１２７〜１３４、１９９４；Ｉｔｏｈら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７：２５〜３１、１９９５）、スクロース欠乏懸濁細胞（Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７６３５〜１７６４１、１９９４）、ならびに他の組織および器官（Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：４９１〜５０６、１９９３）において活性である。
【００４２】導入遺伝子は、α−アミラーゼ遺伝子、または小胞体、液胞、タンパク粒、もしくは細胞外空隙へ組換えタンパク質を指向し得る別の遺伝子に由来するシグナルペプチド配列をさらに含み得る。他の調節配列（例えば、植物で機能するターミネーター配列およびポリアデニル化シグナル）は、この導入遺伝子に含まれ得る。１つのこのような配列の１つの例は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）遺伝子の３’非翻訳領域、またはイネα−アミラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域である（米国特許第５，９６９，１２７号）。
【００４３】本発明のトランスジェニック植物が一旦生成されると、種子組織以外の組織における発現は、有益であり得る。例えば、トランスジェニック植物は、フィターゼがトランスジェニック植物の葉、葉鞘、茎または根から単離されるか否かにかかわらず、組換えフィターゼの産生体として用いられ得る。
【００４４】フィターゼ活性は、当該分野において公知の任意の方法（比色定量技術または未変性のゲルアッセイを用いる、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよび直接酵素アッセイを含む）を用いて測定され得る。例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１２６６〜１２６９、１９９２；Ｙａｎｋｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４４：１５６５〜１５７３、１９９８；およびＫｉｍら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２〜７、１９９８を参照のこと。
【００４５】トランスジェニックの植物、植物の器官、または麦芽種子は、直接（すなわち、さらなる処理なしに）用いられ得るか、または従来の手段（例えば、特定の使用のために適切なように均一になるまで粉砕する工程）を介して最初に処理され得る。あるいは、フィターゼは、植物、植物器官、または麦芽種子から抽出され得、所望される場合、従来の抽出法および精製技術を用いて、使用の前に精製され得る。例えば、Ｌａｂｏｕｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９５：４１３〜４１９、１９９３；およびＧｏｌｏｖａｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：５９〜７１，２０００を参照のこと。
【００４６】さらなる労力なしに、当業者は、上記の開示、ならびに下記のトランスジェニック植物および種子の生成に基づいて、本発明を完全な程度まで利用し得ると考えられる。以下の実施例は、当業者が本発明のトランスジェニック植物を単離し、そして使用し得る方法の単なる例示であり、そしていかなる方法でも開示の残り部分を制限しないと解釈されるべきである。本開示において引用される全ての刊行物、特許または特許出願は、本明細書において参考として援用される。
【００４７】
【実施例】（実施例１）本実施例において使用される方法、材料、および手順を最初に記載する。
【００４８】（方法および材料）植物材料。本実施例において使用したイネ品種は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．ｃｖ．Ｔａｉｎｕｎｇ６７であった。未成熟種子を、籾殻をとり、２．４％ ＮａＯＣｌで１時間滅菌し、滅菌水で十分に洗浄し、そしてＴｏｋｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１，１９９７に記載されるようにカルス誘導のためにＮ６Ｄ寒天培地上に置いた。１ヶ月後、胚盤由来のカルスを、３％スクロースおよび１０μＭ ２，４−Ｄを含有する、形質転換のための新鮮なＮ６Ｄ培地または液体ＭＳ培地において継代培養し、Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１１３１−２１１３７，１９９１に以前に記載されたように懸濁細胞培養物を樹立した。
【００４９】プラスミド。プラスミドαＡｍｙ８−Ｃは、１．４−ｋｂのイネα−アミラーゼｃＤＮＡ挿入物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に保有する（Ｙｕら，Ｇｅｎｅ １２２：２４７−２５３，１９９２）。プラスミドｐＲＹ１８は、イネゲノムｒＤＮＡクラスター（１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３’側の半分の部分、完全な５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、および２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’側の半分の部分を含む）を含む３．８ｋｂのＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１３中に保有する（Ｓａｎｏら，Ｇｅｎｏｍｅ ３３：２０９−２１８，１９９０）。プラスミドＲＡＭＹＧ６ａは、αＡｍｙ８ゲノムＤＮＡの３’側の半分の部分および３’隣接領域を含む。プラスミドＲＡＭＹＧ６ａを、イネゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をαＡｍｙ８−Ｃをプローブとして用いてスクリーニングすることにより作成した。選択されたクローンを、続いて、ポジティブなＥＭＢＬ−３ファージクローンからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングした。プラスミドＲＡＭＹＧ１７は、αＡｍｙ７ゲノムＤＮＡの５’隣接領域、コード領域全体、および３’隣接領域を含む。プラスミドＲＡＭＹＧ１７を、イネゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｈ）をαＡｍｙ８−Ｃをプローブとして用いてスクリーニングすることにより作製した。ＲＡＭＹＧ６ａおよびＲＡＭＹＧ１７に関するさらなる詳細は、Ｈｏら，修士論文，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９１に見出され得る。選択されたクローンを、続いて、ポジティブなＥＭＢＬ−３ファージクローンからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローニングしたプラスミド構築。Ｓ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍフィターゼ遺伝子（ＳｒＰｆ６）の５’末端を、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＳｒＰｆ６（米国特許第５，９３９，３０３号）を、およびプライマー【００５０】
【化１】

（配列番号１；ＥｃｏＲＶ部位に下線を付した）および５’−ＡＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣ−３’（配列番号２；ＢａｍＨＩ部位に下線を付した）を用いるＰＣＲによって改変して、ＥｃｏＲＶ部位が、成熟型のプロセシングされたフィターゼ酵素の最初のアミノ酸を特定するコドン（配列番号１において太字にした）のすぐ５’側に組み込まれた、そしてＢａｍＨＩ部位がこのフィターゼ遺伝子の末端に組み込まれた組換え遺伝子を得た。ＥｃｏＲＶ部位は、α−アミラーゼ遺伝子であるαＡｍｙ８のシグナルペプチド配列へのフィターゼ遺伝子の融合を可能にする。ＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位およびＢａｍＨＩ部位にサブクローニングして、ｐＢＳ／ＳｒＰｆ６を生成した。
【００５１】Ｅ．ｃｏｌｉホスファターゼ遺伝子であるａｐｐＡを、ＤＮＡテンプレートとしてのプラスミドｐＥＴ−ａｐｐＡ（Ｇｏｌｏｖａｎら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：５９−７１，２０００）、ならびにオリゴヌクレオチド５’−ＡＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号３：ＥｃｏＲＶ部位に下線を付した）および５’−ＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＧＡＡＧＧ ＧＴ−３’（配列番号４；ＢａｍＨＩ部位に下線を付した）を用いてＰＣＲによって同様に、５’末端および３’末端で改変した。得られたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングして、ｐＢＳ／ａｐｐＡを生成した。
【００５２】αＡｍｙ８の１．２ｋｂのプロモーターおよびシグナルペプチド領域を、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＡＧ８（Ｃｈａｎら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：４９１−５０６，１９９３）から切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングして、ｐＢＳ／８ＳＰを生成した。αＡｍｙ８の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、ＤＮＡテンプレートとしてＲＡＭＹＧ６ａを、そしてオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号５；ＢａｍＨＩ部位に下線を付した）および５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴ−３’（配列番号６；ＳａｃＩＩに下線を付した）を用いてＰＣＲ増幅した。ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｎｏｓ）３’ＵＴＲを、ＤＮＡテンプレートとしてｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、そしてオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴ−３’（配列番号７；ＢａｍＨＩ部位に下線を付した）および５’−ＡＧＣＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴ−３’（配列番号８；ＳａｃＩＩに下線を付した）を用いてＰＣＲ増幅した。
【００５３】αＡｍｙ８およびＮｏｓ３’ＵＴＲを、ｐＢＳ／８ＳＰ中のＢａｍＨＩ部位およびＳａｃＩＩ部位にサブクローニングして、それぞれ、ｐＢＳ／８ＳＰ８ＵおよびｐＢＳ／８ＳＰＮｏｓを生成した。ＳｒＰｆ６を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いてｐＢＳ／ＳｒＰｆ６から切り出し、そしてｐＢＳ／８ＳＰ８ＵおよびｐＢＳ／８ＳＰＮｏｓ中の同じ部位にサブクローニングして、それぞれ、ｐＢＳ／８Ｆ８ＵおよびｐＢＳ／８ＦＮを生成した。ａｐｐＡ遺伝子を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いてｐＢＳ／ａｐｐＡから切り出し、そしてｐＢＳ／８ＳＰ８ＵおよびｐＢＳ／８ＳＰＮｏｓ中の同じ部位にサブクローニングして、ｐＢＳ／８Ａ８ＵおよびｐＢＳ／８ＡＮを生成した。αＡｍｙ８シグナルペプチド配列とＳｒＰｆ６またはａｐｐＡコード領域との適切なインフレームの融合、ならびにＳｒＰｆ６またはａｐｐＡコード領域をαＡｍｙ８ ３’ＵＴＲまたはＮｏｓ ３’ＵＴＲと連結する連結領域を、全てＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００５４】αＡｍｙ７の１．７−ｋｂのプロモーターおよびシグナルペプチド領域を、ＤＮＡテンプレートとしてＲＡＭＹＧ１７ａを、そしてオリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’（配列番号９；ＳａｌＩ部位に下線を付した）および５’−ＧＧＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴ ＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１０；ＥｃｏＲＶ部位に下線を付した）を用いてＰＣＲ増幅して、ＳａｌＩ部位をαＡｍｙ７プロモーターの５’末端に、そしてＥｃｏＲＶ部位をこのシグナルペプチド配列のすぐ３’側に有するＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおけるＳａｌＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングして、ｐＢＳ／７ＳＰを生成した。αＡｍｙ７ ３’ＵＴＲを、ＤＮＡテンプレートとしてＲＡＭＹＧ１７を、そしてオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１１；ＸｂａＩ部位に下線を付した）および５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＧＴＧＣＡ−３’（配列番号１２；ＳａｃＩＩ部位に下線を付した）を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物を、ｐＢＳ／７ＳＰ中のＸｂａＩ部位およびＳａｃＩＩ部位にサブクローニングして、ｐＢＳ／７ＳＰ７Ｕを生成した。Ｎｏｓ ３’ＵＴＲを、ＸｂａＩおよびＳａｃＩＩを用いてｐＢＳ／８ＳＰＮから切り出し、そしてｐＢＳ／７ＳＰ中の同じ部位にサブクローニングしてｐＢＳ／７ＳＰＮｏｓを生成した。ＳｒＰｆ６遺伝子を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いてｐＢＳ／ＳｒＰｆ６から切り出し、そしてｐＢｓ／７ＳＰ７ＵおよびｐＢＳ／７ＳＰＮｏｓ中の同じ部位にサブクローニングして、それぞれ、ｐＢＳ／７Ｆ７ＵおよびｐＢＳ／７ＦＮを生成した。ａｐｐＡ遺伝子を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いてｐＢＳ／ａｐｐＡから切り出し、そしてｐＢＳ／７ＳＰ７ＵおよびｐＢＳ／７ＳＰＮｏｓ中の同じ部位にサブクローニングして、それぞれ、ｐＢＳ／７Ａ７ＵおよびｐＢＳ／７ＡＮを生成した。αＡｍｙ７シグナルペプチド配列のＳｒＰｆ６またはａｐｐＡコード領域との適切なインフレームの融合、ならびにＳｒＰｆ６またはａｐｐＡコード領域をαＡｍｙ７ ３’ＵＴＲまたはＮｏｓ ３’ＵＴＲと連結する連結領域を、全てＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００５５】カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター−ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）コード配列−腫瘍形態ラージ遺伝子３’ ＵＴＲ（ｔｍｌ）融合遺伝子を、ＥｃｏＲＩを用いてｐＴＲＡ１５１（Ｚｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：８３２−８３５，１９９１）から切り出し、そしてバイナリーベクターｐＰＺＰ２００（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：９８９−９９４，１９９４）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ｐＰＺＰ／ＨＰＨを生成した。ｐＰＺＰ／ＨＰＨを、ＳａｌＩを用いて線状化し、そして平滑末端化して、クローニングのためのベクターとして生成した。ｐＢＳ／８Ｆ８Ｕ、ｐＢＳ／８ＦＮ、ｐＢＳ／８Ａ８Ｕ、ｐＢＳ／８ＡＮ、ｐＢＳ／７Ｆ７Ｕ、ｐＢＳ／７ＦＮ、ｐＢＳ／７Ａ７ＵおよびｐＢＳ／７ＡＮを、ＰｖｕＩＩを用いて線状化して、クローニングのための挿入物として用いた。この挿入物をベクターと連結してそれぞれ、ｐＰＺＰ／８Ｆ８Ｕ、ｐＰＺＰ／８ＦＮ、ｐＰＺＰ／８Ａ８Ｕ、ｐＰＺＰ／８ＡＮ、ｐＰＺＰ／７Ｆ７Ｕ、ｐＰＺＰ／７ＦＮ、ｐＰＺＰ／７Ａ７Ｕ、およびｐＰＺＰ／７ＡＮを生成した。
【００５６】イネの形質転換。プラスミドを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１，１９８６）中にエレクトロポレーター（ＢＴＸ）を製造業者の使用説明書に従って用いて導入した。未成熟イネ種子から誘導したカルスを、Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１−２８２，１９９４およびＴｏｋｉら，前出によって記載された方法に従ってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いて共存培養した。
【００５７】ノーザンブロット分析。総ＲＮＡを、Ｙｕら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：１２７７−１２８９，１９９６に記載される通りに発芽中の種子の内乳から単離し、そしてＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて培養懸濁細胞から単離した。ＲＮＡゲルブロット分析を、Ｔｈｏｍａｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１００：２５５−２６６，１９８３に記載される通りに行った。手短には、１０μｇの総ＲＮＡを、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含有する１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルターに転写し、そして32Ｐランダムプライマーで標識したＳｒＰｆ６ ＤＮＡ、ａｐｐＡＤＮＡ、αＡｍｙ８遺伝子特異的ＤＮＡ、またはｒＤＮＡプローブとハイブリダイズした。αＡｍｙ８遺伝子特異的ＤＮＡを、Ｓｈｅｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６９９８−２７００４，１９９６に記載される通りに調製した。ブロットを、オートラジオグラフィーを用いて可視化し、そしてＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に付随するソフトウェアを用いて定量した。
【００５８】ウェスタンブロット分析。総タンパク質を、抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．８］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、および０．１％サルコシル）を用いて発芽中の種子の内乳から抽出した。ウェスタンブロット分析を、Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１１３１−２１１３７，１９９１に記載される通りに行った。
【００５９】フィターゼ活性アッセイ。タンパク質抽出物を、Ｌｉら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４：１１０３−１１１１、１９９７に記載される通りに発芽中の種子から調製した。フィターゼ活性を、Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１２６６−１２６９，１９９２に記載される通りに決定した。
【００６０】（結果）αＡｍｙ８プロモーターは、形質転換されたイネ懸濁細胞におけるａｐｐＡおよびＳｒＰｆ６ ｍＲＮＡのスクロース飢餓増強蓄積を付与する。αＡｍｙ８プロモーターが、イネにおけるａｐｐＡの糖依存性発現を制御するか否かを決定するために、αＡｍｙ８の５’調節配列およびシグナルペプチド配列を含む１．２−ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ａｐｐＡまたはＳｒＰｆ６遺伝子の５’末端でインフレームで融合した。このキメラ遺伝子を、バイナリーベクター中に挿入し、そしてイネの形質転換のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入した。多くの形質転換細胞株を得て、そして８つの株をさらなる研究のために選択した。形質転換したカルスを、懸濁細胞として培養し、次いでこの懸濁細胞をスクロースを含むかまたはスクロースを含まない培地中で培養した。総ＲＮＡを、精製し、そしてａｐｐＡ ＤＮＡ、ＳｒＰｆ６ ＤＮＡ、αＡｍｙ８遺伝子特異的ＤＮＡ、またはｒＤＮＡをプローブとして用いるゲルブロット分析に供した。ａｐｐＡ、ＳｒＰｆ６、およびαＡｍｙ８ ｍＲＮＡの蓄積は、スクロース飢餓細胞においては検出可能であったが、スクロースを提供した細胞においては検出可能でなかった。ａｐｐＡ ｍＲＮＡもＳｒＰｆ６ ｍＲＮＡも、非形質転換（ＮＴ）細胞において検出されなかった。
【００６１】αＡｍｙ８プロモーターは、形質転換されたイネ懸濁細胞におけるフィターゼのスクロース飢餓増強活性を付与する。αＡｍｙ８−ａｐｐＡまたはαＡｍｙ８−ＳｒＰｆ６キメラ遺伝子を保有する形質転換されたイネ懸濁細胞がフィターゼを合成し、そして培養培地中に分泌するか否かを決定するために、懸濁細胞中および培養培地中のこのフィターゼ活性を決定した。フィターゼ活性は、形質転換細胞および培養培地中で検出可能であった。両方の場合、フィターゼ活性は、スクロース飢餓によって有意に増強された。フィターゼ活性はまた、スクロース飢餓下で非形質転換細胞において検出可能であった。このことは、おそらく、内因性フィターゼ遺伝子により引き起こされた。
【００６２】αＡｍｙ７およびαＡｍｙ８プロモーターは、発芽中のトランスジェニックイネ種子におけるＳｒＰｆ６の発現を制御する。トランスジェニックイネ植物を、αＡｍｙ７−ＳｒＰｆ６またはαＡｍｙ８−ＳｒＰｆ６を保有する形質転換したイネカルスより再生した。いくつかのトランスジェニック系統のＴ１種子を、さらなる研究のためにランダムに選択した。種子の発芽の間のａｐｐＡ遺伝子およびＳｒＰｆ６遺伝子の発現におけるαＡｍｙ７プロモーターおよびαＡｍｙ８プロモーターの役割を決定するために、トランスジェニックイネ種子を、５日間発芽させた。総ＲＮＡを、発芽した種子全体（シュート、根、および内乳を含む）から精製し、そしてＳｒＰｆ６ ＤＮＡ、αＡｍｙ８遺伝子特異的ＤＮＡ、またはｒＤＮＡをプローブとして用いるゲルブロット分析に供した。αＡｍｙ７プロモーターの制御下で、ＳｒＰｆ６の発現は、発芽した種子のいくつかにおいて検出され得る。αＡｍｙ８プロモーターの制御下で、ＳｒＰｆ６の発現は、発芽した種子の全てにおいて検出され得る。ＳｒＰｆ６ ｍＲＮＡは、非形質転換体においては検出されなかった。
【００６３】αＡｍｙ８プロモーターは、発芽中のトランスジェニックイネ種子におけるａｐｐＡの発現を制御する。トランスジェニックイネ植物を、αＡｍｙ８−ａｐｐＡを保有するイネカルスから再生させた。いくつかのトランスジェニック系統のＴ１種子を、さらなる研究のためにランダムに選択した。種子を、５日間発芽させ、そして総ＲＮＡを、発芽した種子全体（シュート、根、および内乳を含む）から精製し、そしてａｐｐＡ ＤＮＡ、αＡｍｙ８遺伝子特異的ＤＮＡ、またはｒＤＮＡをプローブとして用いるゲルブロット分析に供した。αＡｍｙ８プロモーターの制御下で、ａｐｐＡの発現は、発芽した種子の全てにおいて検出され得る。ａｐｐＡ ｍＲＮＡは、非形質転換体においては検出されなかった。
【００６４】αＡｍｙ８プロモーターは、発芽中のトランスジェニックイネ種子における高いフィターゼ活性を付与する。発芽したトランスジェニック種子におけるフィターゼの発現レベルを決定するために、Ｔ１トランスジェニック種子におけるフィターゼ活性を分析した。トランスジェニックイネ種子を、５日間発芽させた。細胞抽出物を、発芽した種子全体（シュート、根、および内乳を含む）から調製し、そしてフィターゼ活性分析に供した。フィターゼ活性は、αＡｍｙ８−ＳｒＰｆ６−Ｎｏｓキメラ遺伝子を保有する全ての発芽したトランスジェニック種子において、非形質転換体よりも高かった。トランスジェニック系統の１つである８ＦＮ−８は、他のトランスジェニック系統と比較して有意に高いフィターゼ活性を有していた。フィターゼ活性は、αＡｍｙ８−ａｐｐＡキメラ遺伝子を保有する全ての発芽したトランスジェニック種子において、非形質転換体よりも高かった。１つのトランスジェニック系統である８ＡＮ−１４は、８ＦＮ−８を含む他のトランスジェニック系統と比較して有意に高いフィターゼ活性を有していた。
【００６５】導入されたフィターゼおよび酸性ホスファターゼ遺伝子は、トランスジェニックイネの子孫に遺伝する。導入されたａｐｐＡ ＤＮＡおよびＳｒＰｆ６ ＤＮＡがＴ１トランスジェニックイネの子孫に遺伝したか否かを決定するために、トランスジェニック系統８ＡＮ−１４および８ＦＮ−８のＴ２種子を、５日間発芽させた。総ＲＮＡを、発芽した種子全体から精製し、そしてａｐｐＡ ＤＮＡ、ＳｒＰｆ６ ＤＮＡ、またはｒＤＮＡをプローブとして用いるゲルブロット分析に供した。ａｐｐＡおよびＳｒＰｆ６の発現は、発芽したＴ２種子の大部分において検出された。
【００６６】αＡｍｙ８プロモーターは、発芽中のトランスジェニックイネ種子におけるフィターゼの一時的発現を付与する。αＡｍｙ８−ａｐｐＡまたはαＡｍｙ８−ＳｒＰｆ６を保有する発芽したトランスジェニックイネ種子におけるフィターゼの発現パターンを決定するために、トランスジェニック系統８ＦＮ−８−８および８ＡＮ−１４−１０のＴ２種子を、種々の期間の間発芽させ、そしてフィターゼ活性を決定した。トランスジェニック種子におけるフィターゼ活性は、発芽の進行に伴って増加し、そして５〜６日目にピークに達したが、その後は減少した。フィターゼ活性はまた、非形質転換種子において検出可能であったが、発芽期間全体を通して低レベルなままであった。
【００６７】発芽中のトランスジェニックイネ種子において産生されたフィターゼの分子量は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生されるフィターゼの分子量に類似する。ＳｒＰｆ６を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターの制御下でプラスミド中にクローニングし、そしてＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中で過剰発現させた。ＳｒＰｆ６ ｃＤＮＡを、ＤＮＡテンプレートとしてｐＳｆＰｆ６を、そして５’プライマーとしてのオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣ−３’（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付した）、および３’プライマーとしての５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＴ−３’（ＸｂａＩ部位に下線を付した）用いてＰＣＲ増幅した。ＳｒＰｆ６ ｃＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてｐＧＡＰＺａＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に連結して、ｐＧＡＰ−ＳｒＰｆ６を生成した。ＳｒＰｆ６は、シグナルペプチドα因子に続き、そしてＧＡＰプロモーターの制御下にあった。ｐＧＡＰ−ＳｒＰｆ６を、制限酵素ＡｖｒＩＩによって線状化し、そしてエレクトロポレーションによってＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株ＳＭＤ１１６８Ｈに移入した。形質転換された細胞を、ゼオシン（ｚｅｏｓｉｎ）（１００ｍｇ／ｍｌ）を加えたＹＰＤＳ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍソルビトール、ｐＨ７．５）に、３０℃にて３日間プレーティングした。フィターゼの産生および精製を、ｐＧＡＰＺａＡとともに提供された製造業者の使用説明書に従って行った。
【００６８】発芽中のトランスジェニックイネ種子において産生されるフィターゼの分子量を、Ｐｉｃｈｉａにおいて過剰発現されるフィターゼの分子量と比較するために、トランスジェニックイネ系統８ＦＮ−８の種子を、５日間発芽させた。総タンパク質を、発芽した種子全体から抽出し、そしてフィターゼポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析に供した。ＳｒＰｆ６の全長ｃＤＮＡを、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＳｒＰｆ６を、そして５’プライマーとしてのオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＧＣＡＧ−３’（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付した）および３’プライマーとしての５’−ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＧＧ−３’（ＳａｃＩ部位に下線を付した）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてｐＥＴ２０ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中の同じ部位に連結して、ｐＥＴ−ＳｒＰｆ６を生成した。ｐＥＴ−ＳｒＰｆ６を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に移入し、そして発現させた。フィターゼの精製を、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される使用説明書に従って行った。１００マイクログラムの精製したフィターゼを、Ｗｉｌｌｉａｍｓら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒら編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５に一般的に記載される方法に従ってＮｅｗＺｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギに、連続的に４〜６週間の間隔で注射した。
【００６９】発芽中のトランスジェニック種子によって生成される全長フィターゼの分子量は、Ｐｉｃｈｉａによって生成されるフィターゼの分子量と同様であった。ＳｒＰｆ６によってコードされるフィターゼが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現した場合に３６．５ｋＤの分子量を有することが公知であった（米国特許第５，９３９，３０３号）。Ｐｉｃｈｉａにおいて発現されるフィターゼの分子量は、約３６．５ｋＤおよび約３８ｋＤであった。同様に、フィターゼをトランスジェニックイネ種子において発現した場合、分子量は約３６．５ｋＤおよび約４０ｋＤであった。ＳｒＰｆ６の一次構造において１つの潜在的なグリコシル化部位が存在することが公知であった（米国特許第５，９３９，３０３号）。それぞれ、Ｐｉｃｈｉａおよびトランスジェニックイネ種子において発現された３８ｋＤおよび４０ｋＤのフィターゼは、おそらく異なったグリコシル化によって引き起こされた。３４ｋＤの分子量を有する１つのタンパク質はまた、発芽中のイネ種子中に存在し、これは、フィターゼの分解産物であり得た。これらの結果は、本明細書中に記載されるトランスジェニック植物およびトランスジェニック種子において産生される成熟フィターゼが、適切に翻訳後修飾されたことを示す。
【００７０】トランスジェニックの発芽したイネ種子／実生は、高い比活性および高活性についての広範なｐＨプロフィールを有するフィターゼを含んでいた。意外なことには、発芽したトランスジェニック種子において発現されたフィターゼの比活性が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるフィターゼよりも２倍高いこともまた発見された。この驚くべき結果についての理由は、発芽した種子において同時に発現される、多くの内因性加水分解酵素が存在することであり得る。これらの加水分解酵素は、発芽中の種子に存在するフィターゼ活性に対して相乗効果を有し得る。あるいは、または関連して、発芽中の種子における翻訳後修飾されたフィターゼは、増加した酵素の比活性を有し得、このことは、フィターゼ活性において観察された増加を生じ得た。従って、トランスジェニックの麦芽になった種子においてフィターゼを発現する利点に加えて、組換えによって産生された酵素の比活性もまた増加した。
【００７１】反芻胃（ｒｕｍｉｎａｌ）の細菌フィターゼは、４．０〜５．５の最適ｐＨを有する（米国特許第５，９３９，３０３号）。上記のイネ種子において発現されたフィターゼの最適ｐＨを決定するために、３つのトランスジェニックイネ系統のＴ２種子を５日間発芽させ、そしてイネの発芽した種子／実生において発現されたフィターゼについての最適ｐＨを決定した。この結果によって、３つ全てのトランスジェニックイネ系統において発現されたフィターゼの活性が、ｐＨ３およびｐＨ４．５〜５．０で最適であることが示された（図１）。単胃腔動物の消化管では、ｐＨは、胃において２〜３、そして小腸において４〜７の範囲である。イネにおいて発現されたフィターゼの、より広くかつより酸性の最適ｐＨプロフィールは、この酵素が、動物の胃および小腸において十分に機能することを可能にし、それゆえ、飼料添加物（ｆｅｅｄ ａｄｄｉｔｉｖｅ）としてのその使用のために有利である。この驚くべき結果についての理由は、イネにおいて発現されたフィターゼが、翻訳後修飾されたことであり得る。翻訳後修飾は、広範な範囲のｐＨにわたる活性および／または安定性の増加をもたらした。
【００７２】Ｅ．ｃｏｌｉの酸性ホスファターゼは、２．５の最適ｐＨを有する（Ｄａｓｓａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：６６６９−６６７６，１９８２；およびＤａｓｓａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５４９７−５５００，１９９０）。イネにおいて発現される酸性ホスファターゼの最適ｐＨを決定するために、トランスジェニックイネ系統８ＡＮ−１４−６のＴ２種子を、５日間発芽させ、そして発芽したイネ種子／実生において発現されるフィターゼの最適ｐＨを、決定した。この結果は、イネにおいて発現された酸性ホスファターゼの活性が、３〜５．５のｐＨ範囲にわたって最適であったことを示す（図２）。イネにおいて発現された反芻胃の細菌フィターゼについてのように、Ｅ．ｃｏｌｉ酸性ホスファターゼの、より広くかつより酸性の最適ｐＨプロフィールは、この酵素が、動物の胃および小腸において十分に機能することを可能にし、それゆえ、飼料添加物としてのその使用のために有利である。この驚くべき結果についての理由はまた、イネにおいて発現された酸性ホスファターゼが、翻訳後修飾されたことであり得た。翻訳後修飾は、広範な範囲のｐＨにわたる活性および／または安定性の増加をもたらした。
【００７３】（実施例２）最初に、本実施例において使用される方法、材料、および手順を記載する。
【００７４】（材料および方法）植物材料。すべての植物材料を、実施例１において記載されるとおり調製した。
【００７５】ゲノムＤＮＡの調製。イネの種子を発芽させ、そして暗所で１週間生長させた。細菌Ｔ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ３９Ｅを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ５３０３３）から得た。この細菌およびイネのゲノムＤＮＡを、Ｓｈｅｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６９９８〜２７００４、１９９６において記載される方法に従って精製した。
【００７６】ＰＣＲ。１３５１ｂｐのグルテリン遺伝子プロモーター領域（フラグメントＩ；Ｚｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：３５７〜３６６、１９９３；およびＷｕら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：８８５〜８８９、１９９８）を、テンプレートとしてイネゲノムＤＮＡ、およびプライマーＢ１−５（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＡＧＧＡＡＴ−３’（配列番号１３）、ＥｃｏＲＩ部位に下線を付す）、およびＢ１−３（５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号１４）、ＢａｍＨＩ部位に下線を付す）を用いてＰＣＲ増幅した。このグルテリン遺伝子プロモーターおよび７５ｂｐの推定シグナルペプチド配列（フラグメントＩＩ）を、テンプレートとしてイネゲノムＤＮＡ、プライマーＢ１−５、およびプライマーＢ１−ｓｐ（５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡ−３’（配列番号１５）、ＢａｍＨＩ部位に下線を付す）を用いてＰＣＲ増幅した。このグルテリン遺伝子プロモーターおよび推定シグナルペプチドおよびプロペプチド配列（フラグメントＩＩＩ）を、テンプレートとしてイネゲノムＤＮＡ、およびプライマーＢ１−５、およびＢ１−ｐｒｏ（５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧＧＴＴ−３’（配列番号１６）、ＢａｍＨＩ部位に下線を付す）を用いてＰＣＲ増幅した。
【００７７】アミノ酸７５〜１０２９のみをコードする短縮型ａｐｕ ＯＲＦを、テンプレートとしてＴ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ３９ＥのゲノムＤＮＡ、および順方向プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＴＧＡ−３’（配列番号１７；ＢａｍＨＩ部位に下線を付す）、および逆方向プライマーとして５’−ＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＣＣＡ−３’（配列番号１８；ＮｏｔＩ部位に下線を付す）を用いてＰＣＲ増幅した。
【００７８】プラスミド構築。このＰＣＲ増幅したフラグメントＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の同じ部位にサブクローニングし、それぞれｐＢＳ−Ｇ、ｐＢＳ−Ｇｐ、およびｐＢＳ−Ｇｐｐを生成した。この短縮型ａｐｕを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてｐＢＳ−Ｇ、ｐＢＳ−Ｇｐ、およびｐＢＳ−Ｇｐｐ中のＧｌｕＢ−１プロモーター、ＧｌｕＢ−１プロモーター−シグナルペプチド配列、およびＧｌｕＢ−１プロモーター−シグナルペプチド−プロペプチド配列の下流にそれぞれ融合させ、翻訳融合物を作製し、そしてそれぞれプラスミドｐＢＳ−Ｇ−ａｐｕ、ｐＢＳ−Ｇｐ−ａｐｕ、およびｐＢＳ−Ｇｐｐ−ａｐｕを作製した。ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｎｏｓ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を、ＤＮＡテンプレートとしてｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および順方向プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴ−３’（配列番号１９；ＳａｃＩ部位に下線を付す）、および逆方向プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴ−３’（配列番号２０；ＳａｃＩ部位に下線を付す）部位を使用してＰＣＲ増幅した。このＮｏｓ３’ＵＴＲを、ＳｃａＩで消化し、そしてｐＢＳ−Ｇ−ａｐｕ、ｐＢＳ−Ｇｐ−ａｐｕ、およびｐＢＳ−Ｇｐｐ−ａｐｕ中のａｐｕの下流に融合させ、それぞれｐＢＳ−Ｇ−ａｐｕ−Ｎｏｓ、ｐＢＳ−Ｇｐ−ａｐｕ−Ｎｏｓ、およびｐＢＳ−Ｇｐｐ−ａｐｕ−Ｎｏｓを作製した。
【００７９】αＡｍｙ８（Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：４９１〜５０６、１９９３）の１．２ｋｂプロモーターおよびシグナルペプチド配列を、ｐＡＧ８からＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングしてｐＢＳ／８ｓｐを生成した。αＡｍｙ８の３’ＵＴＲを、ＤＮＡテンプレートとしてＲＡＭＹＧ６ａ、および順方向プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号２１；ＳａｃＩＩ部位に下線を付す）、および逆方向プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴ−３’（配列番号２２；ＳａｃＩＩ部位に下線を付す）を使用してＰＣＲ増幅した。プラスミドＲＡＭＹＧ６ａは、αＡｍｙ８ゲノムＤＮＡのコード配列の３’側半分および３’隣接領域を含む。このプラスミドを、プローブとしてαＡｍｙ８−Ｃ（Ｙｕら、Ｇｅｎｅ １２２：２４７〜２５３、１９９２）を使用して、イネゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をスクリーニングすることによって生成した。このαＡｍｙ８の３’ＵＴＲを、ｐＢＳ／８ｓｐ中のＳａｃＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＢＳ／８ｓｐ８Ｕを生成した。短縮型ａｐｕを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、そしてｐＢＳ−８ｓｐ８Ｕ中の同部位にサブクローニングし、ｐＢＳ−αＡｍｙ８−ｓｐ−ａｐｕ−８Ｕを生成した。
【００８０】αＡｍｙ３の１．１ｋｂプロモーターおよびシグナルペプチド配列を、ｐ３Ｇ−１３２ＩＩ（Ｌｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０１２０〜１０１３１、１９９８）からＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングしてｐＢＳ−３ｓｐを生成した。このαＡｍｙ３の３’ＵＴＲを、ｐＭＴＣ３７（Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５：６８５〜６９６、１９９８）からＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで切り出し、そしてｐＢＳ−３ｓｐ中の同部位にサブクローニングしてｐＢＳ−３ｓｐ３Ｕを生成した。短縮型ａｐｕを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてｐＢＳ−３ｓｐ３Ｕ中の同部位にサブクローニングし、ｐＢＳ−αＡｍｙ３−ｓｐ−ａｐｕ−３Ｕを生成した。
【００８１】ＧｌｕＢ、αＡｍｙ３、およびαＡｍｙ８のシグナルペプチドまたはプロペプチド配列の、ａｐｕコード領域との正確なインフレーム融合、αＡｍｙ３、αＡｍｙ８、またはＮｏｓの３’ＵＴＲとａｐｕコード領域とを連結する結合領域を、すべてＤＮＡ配列決定によって確認した。このＧｌｕＢ−ａｐｕ−Ｎｏｓキメラ遺伝子、ＧｌｕＢ−ｓｐ−ａｐｕ−Ｎｏｓキメラ遺伝子、ＧｌｕＢ−ｓｐｐ−ａｐｕ−Ｎｏｓキメラ遺伝子、αＡｍｙ３−ｓｐ−ａｐｕ−αＡｍｙ３ ３’ＵＴＲキメラ遺伝子、およびαＡｍｙ８−ｓｐ−ａｐｕ−αＡｍｙ８ ３’ＵＴＲキメラ遺伝子を、ＳａｌＩを用いてｐＢＳ−Ｇ−ａｐｕ−Ｎｏｓ、ｐＢＳ−Ｇｐ−ａｐｕ−Ｎｏｓ、ｐＢＳ−Ｇｐｐ−ａｐｕ−Ｎｏｓ、ｐＢＳ−αＡｍｙ３−ｓｐ−ａｐｕ−３Ｕ、およびｐＢＳ−αＡｍｙ８−ｓｐ−ａｐｕ−８Ｕから切り出し、平滑末端化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ消化および平滑末端化したバイナリーベクターｐＳＭＹ１Ｈ（Ｈｏら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：５７〜６６、２０００）に挿入し、それぞれｐＳＭＹ１／Ｇａｐｕ、ｐＳＭＹ１／Ｇｐａｐｕ、ｐＳＭＹ１／Ｇｐｐａｐｕ、およびｐＳＭＹ１／３ａｐｕ、およびｐＳＭＹ１／８ａｐｕを作製した。
【００８２】形質転換。形質転換を、実施例１において記載するように実施した。
【００８３】Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＡＰＵの発現および抗体の調製。アミノ酸７５〜１０２９をコードする短縮型ａｐｕを、テンプレートとしてＴ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ３９ＥのゲノムＤＮＡ、および順方向プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＴＣ−３’（配列番号２３；ＮｄｅＩ部位に下線を付す）、および逆方向プライマーとして５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＣＣＡ−３’（配列番号２４；ＸｈｏＩ部位に下線を付す）を使用してＰＣＲ増幅した。この増幅したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてｐＥＴ２０ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中の同部位に連結し、ｐＥＴ−ＡＰＵを生成した。ｐＥＴ−ＡＰＵを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３）に移入し、そしてＡＰＵを発現させた。ＡＰＵの精製を、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される説明書に従って行った。１００マイクログラムの精製したＡＰＵを、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（前出）に記載される方法に従って、４〜６週間の間隔で、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギに連続的に注射した。
【００８４】ＡＰＵ活性アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。イネの種子または組織を、液体Ｎ2中で摩砕し、緩衝液（９０．８ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、９．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および７ｍＭ β−メルカプトエタノール）に溶解させ、そして１５，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。次いで、上清を回収した。ＡＰＵ活性を、Ｍａｔｈｕｐａｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６３３２〜１６３４４、１９９３に記載されるようにアッセイした。ＥＬＩＳＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９２において記載されるように行った。総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄの色素結合アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４、１９７６）に基づくＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いて決定した。
【００８５】糖濃度の決定。成熟イネ種子を、乳鉢および乳棒を用いて摩砕し、粉末にした。イネ実生を、乳棒および乳鉢を用いて液体Ｎ2中で摩砕し、粉末にした。この粉末に水を添加し、１０％（ｗ／ｖ）スラリーを作製した。この成熟イネ種子由来のスラリーを、９０℃にて３０分間加熱し、総可溶性糖を抽出し、そしてＣｈｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：６２５〜６３６、１９９４に記載されるように糖濃度を決定した。このイネ実生由来のスラリーを、８５℃にて２時間加熱し、総可溶性糖を抽出し、そしてグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、およびマルトトリオースの濃度を、Ｓｈａｗら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１０７１〜１０７３、１９９２において記載されるように高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
【００８６】（結果）イネグルテリン遺伝子のプロモーター配列、シグナルペプチド配列、およびプロペプチド配列の単離。グルテリン遺伝子（ＧｌｕＢ−１）（Ｔａｋａｉｗａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：８７５−８８５、１９９１）のヌクレオチド配列に基づくプライマーを設計し、そしてＧｌｕＢ−１のプロモーター、推定シグナルペプチド配列、および推定プロペプチド配列を含む３つのＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲを用いて合成した。推定２５アミノ酸のシグナルペプチド切断部位を、統計学的方法（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５、１９８５）に基づいて推定した。推定３６アミノ酸のプロペプチド切断部位は、サツマイモスポラミン（ｓｐｏｒａｍｉｎ）のプロペプチド配列（Ｍａｔｓｕｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３４−８３８、１９９１）に基づいて推定した。フラグメントＩは、翻訳開始コドンの右側で終結する１３５１ｂｐのＧｌｕＢ−１プロモーター領域を含んでいた。フラグメントＩＩは、７５ｂｐのシグナルペプチド配列を付加したフラグメントＩを含んでいた。フラグメントＩＩＩは、１０８ｂｐの推定プロペプチド配列を付加したフラグメントＩＩを含んでいた。このシグナルペプチド領域またはプロペプチド領域を含ませることの目的は、異なる細胞性区画（例えば、細胞質、プロテインボディー、または液胞）に対してＡＰＵを標的化することであった。次いで、トランスジェニックイネ種子におけるＡＰＵの生成、安定性、および活性に対する細胞性局在化の効果を比較し得る。形質転換されたイネの懸濁細胞は、培養培地中でＡＰＵを発現および分泌した。
【００８７】形質転換されたイネの懸濁細胞は、培養培地中でＡＰＵを発現および分泌した。すべてのプラスミドを、微粒子銃またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換系によって、イネカルスに送達した。トランスフェクトされたイネカルスを、ハイグロマイシン選択下で増殖させた。形質転換細胞株のゲノムサザンブロット分析により、一般的に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を介して得られたトランスジェニック株が、１〜２コピーのａｐｕ遺伝子をゲノム中に含むこと、および微粒子銃を介すると、トランスジェニック植物は、複数コピーの（２より多い）ａｐｕ遺伝子をゲノム中に含むことが明らかにされた。
【００８８】形質転換したイネカルスを液体ＭＳ培地中で培養して、懸濁細胞培養物を生成した。ＡＰＵは、大半のトランスジェニック株において、シグナルペプチド配列またはプロペプチド配列を伴って発現されるので、培養培地を、ＡＰＵ蓄積の分析のために収集した。形質転換したイネ懸濁細胞培養物の培地中のＡＰＵの量を、ＥＬＩＳＡおよび標準として精製Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＡＰＵを用いて測定した。図３に示されるように、形質転換した懸濁細胞の培地中のＡＰＵの量は、非形質転換細胞の培地中のＡＰＵの量よりも有意に高かった。この図３において、黒棒はスクロースで生長した植物サンプルを示す。白棒は、スクロースなしで生長した植物サンプルを示す。「ＮＴ」は、非形質転換のコントロールである。αＡｍｙ３プロモーターまたはαＡｍｙ８プロモーターを保有する細胞の培地において、ＡＰＵの量は、スクロースの存在下よりもスクロースの非存在下において高かった。
【００８９】驚くべきことに、ＧｌｕＢ−１プロモーターは、発生中のイネ種子において内乳特異的発現を付与することが示されているが、ＡＰＵはまた培養イネ懸濁細胞においても発現されることが見出された。ＧｌｕＢ−１プロモーターを保有する細胞の培地において、ＡＰＵの量は、スクロースの非存在下よりもスクロースの存在下において高かった。さらに、シグナルペプチド配列を伴わずに発現されたＡＰＵもまた、培養培地中に存在した。コンピューター分析により、ＡＰＵのＮ末端が、シグナルペプチド配列に類似するアミノ酸配列の特徴を有することが示された。このことは、リーダーペプチドの付加を伴わなくとも、培養培地中にＡＰＵが分泌されることを説明し得る。従って、シグナルペプチド配列を有さないＡＰＵが、培養培地中に分泌され得ることが発見された。
【００９０】トランスジェニックの発芽したイネ種子／実生は、高レベルのＡＰＵを含む。α−アミラーゼ遺伝子プロモーターまたはグルテリン遺伝子プロモーターの制御下にあり、かつシグナルペプチド配列を伴うかまたは伴わないａｐｕを保有するトランスジェニックカルスを再生させた。これらのトランスジェニック植物を、２世代について自家受精し、そしてＴ２ホモ接合性種子を得た。
【００９１】トランスジェニック種子のホモ接合性を、５０μ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する水中で７日間、２５個のトランスジェニック種子を発芽させ、次いで生長種子および非生長種子の数の間の割合を計算することによって決定した。ホモ接合性種子は、ハイグロマイシン処理下で発芽および生長することが予期された。種々の構築物を保有する各トランスジェニックイネ系統由来の５つのＴ２ホモ接合性種子を発芽させ、そして５日間生育させた。完全に発芽した種子／実生を収集し、そして細胞抽出物中のＡＰＵレベルを、ＥＬＩＳＡおよび標準として精製Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＡＰＵを用いて測定した。α−アミラーゼ遺伝子プロモーターまたはグルテリン遺伝子プロモーターのいずれかの制御下で発現される平均ＡＰＵレベルは、非形質転換体のレベルよりも高かった（図４）。図４において、「ＮＴ」は、非形質転換のコントロールである。発芽したイネ種子／実生におけるＡＰＵの発現は、予想外であった。なぜなら、ＧｌｕＢ−１プロモーターは、種子の発生の間に内乳において特異的に発現されることが公知であったからである。
【００９２】トランスジェニックの成熟イネ種子は、高レベルのＡＰＵを含む。トランスジーンを保有する各トランスジェニックイネ系統の５つのＴ２ホモ接合性種子をＡＰＵ分析のために選択した。成熟種子の胚および内乳を個々に収集し、そして緩衝液中でホモジナイズして抽出物を形成した。細胞抽出物のＡＰＵレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。トランスジェニック種子中で、α−アミラーゼ遺伝子プロモーターまたはグルテリン遺伝子プロモーターのいずれかの制御下において発現される平均ＡＰＵレベルは、非形質転換種子におけるレベルよりも高かった（図５）。図５において、「ＮＴ」は、非形質転換のコントロールである。予想外なことに、ＧｌｕＢ−１プロモーターは、胚におけるＡＰＵ発現を付与した。さらに、αＡｍｙ３プロモーターおよびαＡｍｙ８プロモーターが、成熟種子の胚および内乳におけるＡＰＵ発現を付与したという事実もまた予想外であった。なぜなら、α−アミラーゼ遺伝子は、内乳、または一過的に発芽中の種子の胚において特異的に発現され、そして成熟種子においては発現されないことが公知であったからである。
【００９３】トランスジェニックの発芽したイネ種子／実生は、高い比活性を有するＡＰＵを含む。図４のデータは、ＡＰＵレベルが、非形質転換コントロールにおけるレベルよりもトランスジェニックの発芽したイネ種子／実生において有意に高いことを示した。トランスジェニックの発芽した種子／実生において発現される組換えＡＰＵの比活性を比較するために、種々の構築物を保有する各トランスジェニックイネ系統の５つのＴ２ホモ接合性種子を発芽させ、そして５日間生育させた。完全に発芽した種子／実生の細胞抽出物を調製し、そしてこの細胞抽出物中のＡＰＵレベルを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。細胞抽出物におけるＡＰＵ量あたりのＡＰＵ活性を、この細胞抽出物を９０℃にて３０分間インキュベーションした後に測定した。図６に示されるように、トランスジェニックの発芽した種子／実生に存在するＡＰＵの比活性は、使用された構築物に関わりなく、系統間で変動した。興味深いことに、トランスジェニックの発芽した種子／実生において発現されるＡＰＵの比活性は、Ｅ．ｃｏｌｉに発現されるＡＰＵの活性よりも２〜７倍高かった。この驚くべき結果の理由は、イネ内乳中に多くの内因性加水分解酵素が存在することであり得る。これらの加水分解酵素は、発芽した種子に存在するＡＰＵ活性に対して相乗効果を有し得る。あるいは、組合わせにおいて、発芽した種子中の翻訳後修飾を受けたＡＰＵが、酵素の比活性を増大させ得、これがＡＰＵ活性において観察された増大を生じさせ得る。ＡＰＵポリペプチド中には３つの潜在的グリコシル化部位が存在し、これらが、使用される生成方法に依存して種々にグリコシル化され得ることに留意のこと。従って、トランスジェニック発芽した種子において発現するＡＰＵの上記の利点の他に、組換え酵素の比活性もまた増大され得る。
【００９４】トランスジェニックイネの種子および発芽した種子／実生は、高レベルの糖を生成する。図４および５に要約される結果により、ＡＰＵレベルが、トランスジェニックの成熟種子および発芽した種子／実生においては、非形質転換コントロールにおけるレベルよりも有意に高いことが明らかにされた。トランスジェニック種子が、非形質転換よりも高いレベルの可溶性糖を生成するか否かを決定するために、ＧｌｕＢ−１プロモーターの制御下にあるａｐｕを保有する、各トランスジェニックイネ系統の５つのＴ２ホモ接合性種子を、水中でホモジナイズし、そして８５℃にて２時間インキュベートした。図７に示されるように、トランスジェニック種子における可溶性糖の濃度は、非形質転換種子における濃度よりも高かった。図７において、「ＮＴ」は、非形質転換のコントロールである。αＡｍｙ３プロモーターおよびαＡｍｙ８プロモーターの制御下にあるａｐｕを保有する、各トランスジェニックイネ系統の５つのＴ２ホモ接合性種子もまた、水中でホモジナイズし、そして９０℃にて３０分間インキュベートした。図８に示されるように、発芽した種子／実生における糖の濃度は、非形質転換コントロールにおける濃度よりも高かった。図８において、「ＮＴ」は、非形質転換のコントロールである。これらの結果は、トランスジェニックの種子または発芽した種子／実生中のＡＰＵレベルの増大が、外因的ＡＰＵの添加なしで種子デンプンからの糖の生成を促進することを実証した。
【００９５】
【発明の効果】従って、本発明により、リンまたは炭水化物の豊富な飼料のための原料として有用な種子を生成するトランスジェニック植物が提供された。
【出願人】 【識別番号】５００５８６７３８
【氏名又は名称】アカデミア シニカ
【氏名又は名称原語表記】Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ
【住所又は居所原語表記】１２８， Ｓｅｃ．２， Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ， Ｎａｎ−Ｋａｎｇ， Ｔａｉｐｅｉ， １１５ Ｔａｉｗａｎ， Ｒ．Ｏ．Ｃ．
【出願日】 平成１２年１２月２６日（２０００．１２．２６）
【代理人】 【識別番号】１０００７８２８２
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
【公開番号】 特開２００２−２０９４６２（Ｐ２００２−２０９４６２Ａ）
【公開日】 平成１４年７月３０日（２００２．７．３０）
【出願番号】 特願２０００−３９６３１８（Ｐ２０００−３９６３１８）