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【発明の名称】 発根能に優れたユーカリプタス・グロブルスの選抜方法
【発明者】 【氏名】和泉 公子

【氏名】松田 学

【氏名】清水 卓也

【氏名】村上 章

【氏名】小島 鋭士
【要約】 【課題】発根能に優れたＥ．グロブルスを迅速かつ確実に検出し、選抜する方法を提供する【解決手段】 配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いて、ユーカリプタス・グロブルスの全ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、発根能に優れた個体に特異的な、所定の分子量を有するＤＮＡ断片の増幅が全て検出される個体を選抜する。

【解決手段】配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いて、ユーカリプタス・グロブルスの全ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、発根能に優れた個体に特異的な、所定の分子量を有するＤＮＡ断片の増幅が全て検出される個体を選抜する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いて、ユーカリプタス・グロブルスの全ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、以下の分子量を有するＤＮＡ断片の増幅が全て検出される個体を選抜することを特徴とする、発根能に優れたユーカリプタス・グロブルスの選抜方法。
プライマー１：分子量６９０ｂｐプライマー２：分子量５８５ｂｐ、６５１ｂｐ、６９１ｂｐプライマー３：分子量７０２ｂｐ、７９７ｂｐ、１１４９ｂｐプライマー４：分子量８３２ｂｐ、１１２０ｂｐ、１３４３ｂｐ、１８１９ｂｐプライマー５：分子量２４８２ｂｐプライマー６：分子量２４５４ｂｐプライマー７：分子量７０５ｂｐ、１４１５ｂｐ、１６９２ｂｐ【請求項２】 増幅されたＤＮＡ断片の分離及びその分子量の同定を電気泳動法にて行う、請求項１に記載の発根能に優れたユーカリプタス・グロブルスの選抜方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発根能に優れたユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus（以下、Ｅ．グロブルスと略記する。））を迅速に検出し、選抜する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｅ．グロブルスは豪州タスマニアを原産とする高木の常緑木本植物で、パルプ、建材、薪炭用材等として高い商業価値を有している。そのため、現在では豪州の他、広く世界各地で植林が行われ、また、これらＥ．グロブルスの性質をさらに改良すべく、育種も盛んに試みられている。
【０００３】植林を行うにしろ、育種を行うにしろ、目的に適った形質を持つ均質な苗を大量に増殖するステップは、必ず要求される。このとき苗の大量増殖手段として有用なのが、伝統的な挿し木法や、近年のバイオテクノロジーの発達により生まれた組織培養法である。これらの方法によれば、単に、苗の大量増殖ができるばかりではなく、同一の遺伝的性質を有する植物個体、即ちクローン苗を大量かつ迅速に増殖することができる。
【０００４】挿し木法においては、増殖しようとする植物個体から枝や、場合によっては芽、葉等を切取って挿し穂とし、これを適当な培養土に挿し付けて発根させ、苗を生産する。一方、組織培養法において木本植物を大量増殖しようとする場合には、多芽体や苗条原基を経由することが多い。具体的には、増殖しようとする植物個体から芽や茎頂点等を切取って培養し、多芽体や苗条原基を発生させ、これらからシュートを得て、このシュートを適当な支持体に挿し付けて発根させる。つまり、いずれの方法を用いてクローン苗を生産するにしても、最終的には発根という過程を経ることとなる。しかし、上記したＥ．グロブルスの挿し穂やシュートの発根能は個体差が激しく、しかも、発根能に優れた個体よりも、劣った個体の方が大多数を占める。このため、この樹種は、ある形質に優れた個体を見出したとしても、発根能に劣ることからクローン苗の大量増殖が困難である場合が多く、これが、植林や育種にあたっての大きな障害となる。
【０００５】そこで、Ｅ．グロブルスにおいてクローン苗の大量増殖を試みる場合には、目的とする形質の他、まず、発根能に優れた個体を探索して選抜し、これを親とする必要がある。しかし、これまでは、実際に、挿し木なり組織培養なりを行ってみないと、その植物個体の発根能の優劣は知ることができなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところが、挿し木法では、光、温度、湿度等の環境要因を完全に制御することが難しいため、挿し木法において、ある個体に由来する挿し木が優れた発根能を示したとしても、それがその個体の特性によるものであるのか、環境要因によるものであるのかを簡単には判別できない。また、挿し木法で発根能を確かめるためには、広い圃場が必要とされる。一方、組織培養法においてシュートの発根能を知るためには長期間を要する。シュートの発根能を調べるには、ある植物個体から芽等の組織を組織培養系に取りこみ、多芽体や苗条原基を経由してシュートを得、これを発根させるというルートが確立していなければならないが、このルートを確立するためには、各過程において培地組成や光、温度等の培養条件を定める必要があり、これらの条件が全て定まるまで、通常は２〜３年の期間を要するからである。
【０００７】本願発明は、かかる問題点に鑑み、発根能に優れたＥ．グロブルスを迅速かつ確実に検出し、選抜する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは鋭意検討の結果、プライマーを変えてＥ．グロブルスの全ＤＮＡにつきポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する。）を行い、それぞれのプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片を分離、検出し、その分子量を同定することにより、上記目的が達成されることを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】即ち、本願発明は、配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いて、Ｅ．グロブルスの全ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、以下の分子量を有するＤＮＡ断片の増幅が全て検出される個体を選抜することにより、上記目的を達成するものである。
【００１０】プライマー１：分子量６９０ｂｐプライマー２：分子量５８５ｂｐ、６５１ｂｐ、６９１ｂｐプライマー３：分子量７０２ｂｐ、７９７ｂｐ、１１４９ｂｐプライマー４：分子量８３２ｂｐ、１１２０ｂｐ、１３４３ｂｐ、１８１９ｂｐプライマー５：分子量２４８２ｂｐプライマー６：分子量２４５４ｂｐプライマー７：分子量７０５ｂｐ、１４１５ｂｐ、１６９２ｂｐ【００１１】
【発明の実施の形態】以下に、本願発明を詳細に説明する。
【００１２】本願発明の対象となるＥ．グロブルスの生育地や樹齢等は問わない。また、本願発明の対象は、Ｅ．グロブルスの組織培養物であっても構わない。本願発明は、Ｅ．グロブルス全てに適用することができる。換言すれば、世界中のどこに、どのような状態で生育しているＥ．グロブルスであっても、Ｅ．グロブルスであれば、配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いて全ＤＮＡについてＰＣＲを行い、前記分子量を有するＤＮＡ断片の増幅の有無を調べることにより、発根能に優れた個体を選抜することができる。
【００１３】Ｅ．グロブルスからの全ＤＮＡの抽出は、公知の方法、例えば、ＣＴＡＢ法やＳＤＳ法等又はこれらの方法を適宜改良した方法を用いて行うことができる。最近では、全ＤＮＡ抽出のためのキットも市販されているので、この市販キットを利用することも、もちろん構わない。このようなキットとしては、例えば、キアゲン（株）から販売されているDNeasy Plant Mini Kitがある。なお、全ＤＮＡを抽出するための組織は何であってもよい。本願発明においては、Ｅ．グロブルスであれば、芽、葉、シュート等、どのような組織でも全ＤＮＡの抽出に用いることができる。もっとも、一般に、全ＤＮＡの抽出には、ポリフェノール成分の少ない組織が適している。従って、本願発明において全ＤＮＡを抽出する場合にも、ポリフェノール成分の少ない幼若組織を使用することが望ましい。
【００１４】Ｅ．グロブルスから抽出された全ＤＮＡは、次いで、ＰＣＲに供される。このときプライマーとして、配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いる。これらのプライマーは、ＤＮＡシンセサイザー等で合成することもできるが、オペロン社より市販されているOPERON 10MER KITS中の、ＯＰＣ−８（プライマー１）、ＯＰＧ−１７（プライマー２）、ＯＰＨ−０５（プライマー３）、ＯＰＨ−１８（プライマー４）、ＯＰＪ−１２（プライマー５）、ＯＰＫ−１９（プライマー６）及びＯＰＰ−１５（プライマー７）として容易に入手することができるので、これらを用いるのが便利である。
【００１５】ＰＣＲは、ＰＣＲ反応用緩衝液中で、これらのプライマー１〜７のいずれか１種類、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの総称。）及びＤＮＡポリメラーゼと、Ｅ．グロブルスから抽出された全ＤＮＡとを混合し、この混合物を適当な温度サイクルで繰返し反応させることにより行なう。ＰＣＲの詳細な条件は、このとき、発根能に優れたＥ．グロブルスに特異的に増幅されるはずの前記分子量のＤＮＡ断片（以下、発根能特異的ＤＮＡ断片という。）が、確実に増幅されるよう適宜設定すればよい。通常は、Ｅ．グロブルスから抽出された全ＤＮＡ２０〜２００ｎｇ、プライマーをそれぞれ０．２〜１μＭ、ｄＮＴＰ２０〜２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ１〜２．５Ｕを混合した１×ＰＣＲ反応用緩衝液（全量２５〜１００μｌ）を、次に示すような温度サイクルで反応させた場合に、良好な結果を得ることができる。ＰＣＲ反応用緩衝液、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼについては市販されているので、これを用いることができる。
【００１６】本願発明の実施に適したＰＣＲ温度条件ステップ１：９４〜９６℃ 約５〜７分→３５〜３６℃ 約０．５〜１分→７０〜７４℃ 約１〜２分１サイクルステップ２：９４〜９６℃ 約１〜１．５分→３５〜３６℃ 約０．５〜１分→７０〜７４℃約１〜２分３８〜４３サイクルステップ３：９４〜９６℃ 約１〜１．５分→３５〜３６℃ 約０．５〜１分→７０〜７４℃約５〜１０分１サイクル【００１７】ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片は、公知の方法により分離し、その分子量を同定する。なかでも電気泳動法は、簡易な、そして良く知られた核酸の分離・分析法であり、ＤＮＡ断片の分離とその分子量の同定という、この目的に最も適う方法でもある。
【００１８】電気泳動法によれば、ＰＣＲ後の反応液について電気泳動を行うことにより、ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片を、その分子量に応じて分離することができる。電気泳動法としては、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等、各種の電気泳動法を使用することができる。泳動条件は、発根能特異的ＤＮＡ断片をクリアに分離するよう、適宜設定すればよい。例えば、ゲル電気泳動法を本願発明に適用する場合には、担体としてゲル濃度０．５〜１．５ｗ／ｖ％のアガロースゲル又はゲル濃度３．５〜５ｗ／ｖ％のポリアクリルアミドゲル、緩衝液としてＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ Tris-borate、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、室温の下、アガロースゲルを用いた場合には電圧７０〜１５０Ｖ、ポリアクリルアミドゲルを用いた場合には電圧１００〜２００Ｖで泳動を行なえばよい。
【００１９】また、電気泳動法によれば、ＤＮＡ断片の分子量の同定も、その分離と同時に行うことができる。つまり、ＰＣＲ反応液の電気泳動と同時に、分子量既知のＤＮＡ断片についても電気泳動を行い、泳動後、分離されたＤＮＡ断片の移動度を互いに比較すればよい。このように電気泳動法によれば、ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片の分離と、その分子量の同定とを１段階で行うことができる。
【００２０】なお、分離されたＤＮＡ断片は、エチジウムブロマイド法等の定法により検出し、その移動度を算出することができる。例えば、前記のようにしてゲル電気泳動法にて分離されたＤＮＡ断片は、電気泳動後のゲルを、エチジウムブロマイド０．５〜２μg／ｍｌを含むＴＢＥ緩衝液（同前）に１０〜２０分間浸漬してから、２５６ｎｍ付近の紫外線を照射することにより、ゲル上の、蛍光を発する帯状領域（バンド）等として検出することができる。
【００２１】本願発明においては、以上の結果、発根能特異的ＤＮＡ断片の増幅が全て検出された個体を、発根能に優れたＥ．グロブルスとして選抜する。即ち、その全ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に示すプライマー１を用いてＰＣＲを行った場合には分子量６９０ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号２に示すプライマー２を用いてＰＣＲを行った場合には分子量５８５ｂｐ、６５１ｂｐ及び６９１ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号３に示すプライマー３を用いてＰＣＲを行った場合には分子量７０２ｂｐ、７９７ｂｐ及び１１４９ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号４に示すプライマー４を用いてＰＣＲを行った場合には分子量８３２ｂｐ、１１２０ｂｐ、１３４３ｂｐ及び１８１９ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号５に示すプライマー５を用いてＰＣＲを行った場合には分子量２４８２ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号６に示すプライマー６を用いてＰＣＲを行った場合には分子量２４５４ｂｐのＤＮＡ断片が、そして配列番号７に示すプライマー７を用いてＰＣＲを行った場合には分子量７０５ｂｐ、１４１５ｂｐ及び１６９２ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されるＥ．グロブルスを選抜する。選抜すべきＥ．グロブルスは、これらのＤＮＡ断片以外に、他の断片の増幅も検出されるものであって構わない。しかし、これらのＤＮＡ断片全ての増幅が検出されるものでなくてはならない。発根能特異的ＤＮＡ断片のうち、一つでも増幅が検出されない個体は、発根能において優れた性質を示さないからである。
【００２２】
【作用】挿し穂やシュートからの発根率は、培養条件、環境条件等の外部要因のみならず、その植物個体自身が有している発根能によっても大きく左右される。例えば、組織培養において、外部要因を一定にして、同じ種・品種に属する植物のシュートを発根させる場合でも、異なる個体から由来するシュートの間では、その発根率は異なっているのが普通である。Ｅ．グロブルスではこの差が特に大きい。そこで、発根能に優れた個体の探索が、Ｅ．グロブルスのクローン苗の大量増殖において重要となる。
【００２３】優れた発根能を示す植物個体は、発根に関与する遺伝子中に特定のＤＮＡ配列を有していると考えられるので、この特定のＤＮＡ配列をマーカー（以下、ＤＮＡマーカーという。）として選抜することができれば、同様の発根能を有する植物個体が迅速に選抜できる筈である。しかし、植物の発根能は量的形質とされ、多くの遺伝子が関与してこの能力の優劣を決定している。このため、遺伝子の解析は困難であり、また、発根に関与する遺伝子を幾つか明らかにし、ＤＮＡマーカーを見出したとしても、これらがその遺伝子中に存在するというだけで、その植物個体の発根能が優れているとは、到底言うことができない。従って、これまで、植物個体の発根能を特定のＤＮＡマーカーと関連付ける研究は、遺伝的に極めて近似した一つの交配家系を対象とするものに限られていた。
【００２４】これに対して、本願発明は、ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ断片を総合的に検討することにより、Ｅ．グロブルスであればその産地・家系、ひいては品種を問わず、発根能に優れた個体の確実な選抜を可能とした。即ち、本願発明においては、予め選択した複数のプライマーそれぞれを用いてＥ．グロブルスの全ＤＮＡにつきＰＣＲを行う。このとき、用いるプライマー毎に、普通は１以上の異なるＤＮＡ断片が増幅される。従って、複数のプライマーを用いれば、極めて多くの種類のＤＮＡ断片が増幅されるが、これらのＤＮＡ断片中、発根能に優れたＥ．グロブルスに特有のＤＮＡ断片１６種類全てを有する個体のみを、発根能に優れたものとして選抜する。
【００２５】これは、いわば数多くのＤＮＡマーカーを組合わせて利用するのに等しい。単独では発根能を示すものとして役に立たないＤＮＡマーカーであっても、このように数多くのＤＮＡマーカーを組合わせ、その有無を総合的に検討することによって、発根能に優れたＥ．グロブルスの確実かつ普遍的な選抜が可能となったのである。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００２７】［実施例１］
Ｉ．Ｅ．グロブルスの発根能の調査チリ又はオーストラリアに生育するＥ．グロブルス２８個体（表１参照）に由来する、２８系統の多芽体から得られたシュートについて、その発根能を調査した。即ち、１系統あたり５０本のシュートを、ＩＢＡ１．０〜１．５ｍｇ／ｌを含む無糖のムラシゲ・スクーグ培地で湿潤させた、空隙率６５％の発泡フェノール樹脂成型品に挿し付け、炭酸ガスを３００〜３０００ｐｐｍに制御しつつ、１６時間日長、照度３０００〜５０００ルクス、温度２４±１℃、湿度６０±１０％で４週間培養し、これらのシュートの発根能を調査した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】表１より明らかなように、２８系統のうち、ＶＴ０００７、ＶＴ００１７、ＶＴ００３９、ＦＬＬ２０４７及びＮＣ５３６が７０％以上の発根率を示した。
【００３０】ＩＩ．Ｅ．グロブルス全ＤＮＡのＰＣＲ上記２８系統の多芽体から得られたシュート１００ｍｇを液体窒素で凍結させ、粉砕したものにつき、DNeasy Plant Mini Kit（キアゲン（株）より販売）を用いて全ＤＮＡの抽出を行い、抽出された全ＤＮＡを鋳型として、配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を用いてＰＣＲを行った。
【００３１】ＰＣＲは、抽出された全ＤＮＡ２５ｎｇ、配列番号１〜７に示すプライマー１〜７を各反応ごとにそれぞれ１０ｐｍｏｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ２μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製『TaKaRa EX taq』）１．２５Ｕ、ＰＣＲ反応用緩衝液（宝酒造（株）製『１０×ExTaq Buffer』）２．５μｌ、及び、ＰＣＲ反応溶液の着色と比重づけのためタートラジンとフィコールを混合した後、滅菌超純水で全液量が２５μｌとなるように希釈したものについて、STRATAGENE社の「Robocycler GRADIENT40」を用い、次に示すような温度サイクルで反応させることにより行った。なお、タートラジン及びフィコールは、ＰＣＲ反応液中の濃度が、それぞれ１ｍＭ、２ｗ／ｖ％となるように添加した。
【００３２】
ステップ１：９４℃７分→３６℃１分→７２℃ ２分 １サイクルステップ２：９４℃１分→３６℃１分→７２℃ ２分 ４３サイクルステップ３：９４℃１分→３６℃１分→７２℃１０分 １サイクル【００３３】ＩＩＩ．ＰＣＲ増幅産物の分析上記ＩＩのＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片を、ＰＣＲ後の反応液について、担体としてゲル濃度１ｗ／ｖ％、ゲルサイズ２０ｃｍ×２０ｃｍのアガロースゲル（BioWhittaker Molecular Applications社製ＤＮＡタイピング用アガロース『I.D.NA Agarose』を使用して作成。）、緩衝液としてＴＢＥ緩衝液（同前）を用い、室温の下、定電圧１３０Ｖで約４〜５時間ゲル電気泳動を行うことにより、分離した。なお、このとき、分離されるＤＮＡ断片の分子量を同定するため、分子量既知のＤＮＡ断片の混合物（日本バイオラッドラボラトリーズ（株）製『EZ Load PCR Molecular Ruler』）をＰＣＲ反応液と共に電気泳動に供した。
【００３４】電気泳動により分離されたＤＮＡ断片の検出は、電気泳動後、担体として用いたゲルを、エチジウムブロマイド０．５〜２μｇ／ｍｌを含むＴＢＥ緩衝液（同前）に１０〜２０分間浸漬してから、これに２５６ｎｍ付近の紫外線を照射することにより行った。ＩＩにおいて増幅されたＤＮＡ断片の分子量の同定は、こうして検出されたＤＮＡ断片について、その移動度を、これと同時に電気泳動を行った分子量既知のＤＮＡ断片の移動度とその分子量との関係から求められる式に内挿することにより行った。
【００３５】この結果、Ｉにおいて７０％以上の発根率を示した系統ＶＴ０００７、ＶＴ００１７、ＶＴ００３９、ＦＬＬ２０４７及びＮＣ５３６の全ＤＮＡの増幅産物として、配列番号１に示すプライマー１を用いてＰＣＲを行った場合には分子量６９０ｂｐ（Ｍ１）のＤＮＡ断片が、配列番号２に示すプライマー２を用いてＰＣＲを行った場合には分子量５８５ｂｐ（Ｍ２）、６５１ｂｐ（Ｍ３）及び６９１ｂｐ（Ｍ４）のＤＮＡ断片が、配列番号３に示すプライマー３を用いてＰＣＲを行った場合には分子量７０２ｂｐ（Ｍ５）、７９７ｂｐ（Ｍ６）及び１１４９ｂｐ（Ｍ７）のＤＮＡ断片が、配列番号４に示すプライマー４を用いてＰＣＲを行った場合には分子量８３２ｂｐ（Ｍ８）、１１２０ｂｐ（Ｍ９）、１３４３ｂｐ（Ｍ１０）及び１８１９ｂｐ（Ｍ１１）のＤＮＡ断片が、配列番号５に示すプライマー５を用いてＰＣＲを行った場合には分子量２４８２ｂｐ（Ｍ１２）のＤＮＡ断片が、配列番号６に示すプライマー６を用いてＰＣＲを行った場合には分子量２４５４ｂｐ（Ｍ１３）のＤＮＡ断片が、そして配列番号７に示すプライマー７を用いてＰＣＲを行った場合には分子量７０５ｂｐ（Ｍ１４）、１４１５ｂｐ（Ｍ１５）及び１６９２ｂｐ（Ｍ１６）のＤＮＡ断片が共通して検出された。一方、発根率７０％未満の系統において、これらのＤＮＡ断片が全て検出されたものは見出せなかった。従って、これらのＤＮＡ断片Ｍ１〜Ｍ１６は、発根能に優れたＥ．グロブルス全ＤＮＡに特異的に存在するＤＮＡ断片であると考えられた。
【００３６】［実施例２］日本国・岩国市に生育する発根能未知のＥ．グロブルス３個体（ＷＲ１３、ＷＲ２１、ＷＲ３３）に由来する、３系統の多芽体から得られたシュートについて、実施例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に全ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ、ＰＣＲ増幅産物の分離と分子量の同定を行った。
【００３７】その結果、抽出された全ＤＮＡはいずれも、ＤＮＡ断片Ｍ１〜Ｍ１６をＰＣＲ増幅産物として与え、これらの系統ＷＲ１３、ＷＲ２１、ＷＲ３３が優れた発根能を有していることが示唆された。
【００３８】そこで、これら３系統の多芽体から得られたシュートについて、実施例１のＩと同様にして発根能を調査したところ、ＷＲ１３は９０％、ＷＲ２１は９４％、ＷＲ３３は８０％と、高い発根能を有していることが明らかとなった。
【００３９】以上より、本願発明のＰＣＲにおいて増幅されるＤＮＡ断片Ｍ１〜Ｍ１６は、少なくとも７０％以上の発根能を有する、Ｅ．グロブルスの全ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片であることは明らかである。このことは、本願発明の方法に従い、これらのＤＮＡ断片Ｍ１〜Ｍ１６の増幅を指標として選抜を行えば、発根能７０％以上のＥ．グロブルスが選抜されることを意味する。
【００４０】ちなみに、植林や育種を目的としてクローン苗を大量増殖する場合には、挿し木やシュートの発根能は少なくとも７０％以上であることが望ましいとされ（Wilson、P.J.、AFOCEL-IUFRO Symposium、Vol I、379-386、1992）、このため、これらのクローン苗の親となる個体の選抜にあたっても、発根能７０％以上であることが選抜基準の一つとなる。従って、本願発明の方法は、植林や育種の効率・経済性を保証できる発根能を備えたＥ．グロブルスの選抜を可能とするものと言える。
【００４１】
【発明の効果】本願発明によれば、ＤＮＡレベルの分析によって、発根能７０％以上を示すＥ．グロブルスを確実に選抜することができる。また、そのために特別な装置等を用いる必要がない。
【００４２】従って、本願発明によれば、世界中のどこに、どのような状態で生育しているＥ．グロブルスであっても、発根能７０％以上を示す個体を確実・迅速、そして簡易に選抜することができる。
【００４３】即ち、本願発明は、Ｅ．グロブルスにおいて、挿し木法や組織培養法によるクローン苗の大量増殖の効率・経済性を、ひいては、その植林や育種にあたっての効率・経済性を、対象となる個体の発根能の点から保証するものである。
【配列表】
＜１１０＞ 日本製紙株式会社Nippon Paper Industries Co.,Ltd.＜１２０＞ 発根能に優れたユーカリプタス・グロブルスの選抜方法＜１３０＞ ５７−ＢＩＯＪＯ＜１６０＞ ７＜２１０＞ １＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ tggaccggtg＜２１０＞ ２＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ tcgaccgaca＜２１０＞ ３＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ agtcgtcccc＜２１０＞ ４＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ gaatcggcca＜２１０＞ ５＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ gtcccgtggt＜２１０＞ ６＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ cacaggcgga＜２１０＞ ７＜２１１＞ １０＜２１２＞ ＤＮＡ＜２１３＞ Artificial Sequence＜２２０＞＜２２３＞ primer for PCR＜４００＞ ggaagccaac
【出願人】 【識別番号】０００１８３４８４
【氏名又は名称】日本製紙株式会社
【出願日】 平成１３年１月１８日（２００１．１．１８）
【代理人】 【識別番号】１０００７４５７２
【弁理士】
【氏名又は名称】河澄 和夫
【公開番号】 特開２００２−２０９４６１（Ｐ２００２−２０９４６１Ａ）
【公開日】 平成１４年７月３０日（２００２．７．３０）
【出願番号】 特願２００１−９７１０（Ｐ２００１−９７１０）