植物育成方法、植物育成システム、植物の生長の活性度合いの測定方法、植物の生育領域の微生物叢の測定方法および植物の生育領域の状態制御方法

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【発明の名称】	植物育成方法、植物育成システム、植物の生長の活性度合いの測定方法、植物の生育領域の微生物叢の測定方法および植物の生育領域の状態制御方法
【発明者】	【氏名】井上高一
【要約】	【課題】植物を効果的に育成する植物育成方法および植物育成システムを提供することである。【解決手段】植物の生長の活性度合いを増幅確率の制限されたＳＳＣ－ＰＣＲ法によりモニターし、土壌等の微生物叢を増幅確率の制限されたＳＳＣ－ＰＣＲ法によりモニターする。土壌等の温度および通気量を制御することにより、硝化細菌群の種類数および量を制御し、硝酸塩および亜硝酸塩の量を制御する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】植物の生長の活性度合いを測定するステップと、植物の生育領域の微生物叢を測定するステップと、前記植物の生長の活性度合いの測定結果および前記微生物叢の測定結果に基づいて前記植物の生育領域の状態を制御するステップとを備えたことを特徴とする植物育成方法。
【請求項２】前記活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて前記合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、前記増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により前記植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含むことを特徴とする請求項１記載の植物育成方法。
【請求項３】前記活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、複数種類のプライマーを用いて前記抽出された複数種類のｍＲＮＡから複数種類のｃＤＮＡを合成するとともに、前記複数種類のプライマーを一度に用いて前記合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、前記増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により前記植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含むことを特徴とする請求項１記載の植物育成方法。
【請求項４】前記増幅するステップにおいて１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いることを特徴とする請求項２または３記載の植物育成方法。
【請求項５】前記活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、所定の塩基配列を有するプライマー対を用いて前記合成された複数種類のｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより植物の生長に関わる蛋白質の元となるｃＤＮＡを検出するステップと、前記検出されたｃＤＮＡの電気泳動像の解析により前記植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含むことを特徴とする請求項１記載の植物育成方法。
【請求項６】前記活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、前記合成された複数種類のｃＤＮＡにハイブリダイゼーション法を適用することにより前記抽出された複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出するステップとを含むことを特徴とする請求項１記載の植物育成方法。
【請求項７】前記活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出された複数種類のｍＲＮＡにハイブリダイゼーション法を適用することにより複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出するステップとを含むことを特徴とする請求項１記載の植物育成方法。
【請求項８】前記微生物叢を測定するステップは、前記植物の生育領域の土壌を採取するステップと、前記採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、前記懸濁および分散処理により得られた微生物を培養および生化学検査し、微生物の種類および量を検出するステップとを含むことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の植物育成方法。
【請求項９】前記微生物叢を測定するステップは、前記植物の生育領域の土壌を採取するステップと、前記採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて前記懸濁および分散処理により得られた微生物叢に含まれる微生物に対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより微生物叢に含まれる微生物のＤＮＡから複数のＤＮＡ断片を増幅し、前記増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により微生物叢に含まれる微生物の種類を識別するステップとを含むことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の植物育成方法。
【請求項１０】前記複数のＤＮＡ断片を増幅する際に１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いることを特徴とする請求項９記載の植物育成方法。
【請求項１１】前記微生物叢を測定するステップは、前記植物の生育領域の土壌を採取するステップと、前記採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、前記懸濁および分散処理により得られた微生物叢に含まれる微生物のｒＲＮＡの遺伝子を保存したＤＮＡ領域をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅し、前記増幅結果の解析により微生物叢に含まれる微生物の種類を識別するステップとを含むことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の植物育成方法。
【請求項１２】前記植物の生育領域の状態を制御するステップは、前記生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１～１１のいずれかに記載の植物育成方法。
【請求項１３】前記生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御するステップは、前記生育領域の硝化細菌の活性状態を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１２記載の植物育成方法。
【請求項１４】前記生育領域の硝化細菌の活性状態を制御するステップは、前記生育領域の温度、酸素量または含水率を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１３記載の植物育成方法。
【請求項１５】植物の生長の活性度合いを測定する方法であって、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて前記合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、前記増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により前記植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含み、前記増幅するステップにおいて１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いることを特徴とする植物の生長の活性度合いの測定方法。
【請求項１６】植物の生長の活性度合いを測定する方法であって、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、複数種類のプライマーを用いて前記抽出された複数種類のｍＲＮＡから複数種類のｃＤＮＡを合成するとともに、前記複数種類のプライマーを一度に用いて前記合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、前記増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により前記植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含むことを特徴とする植物の生長の活性度合いの測定方法。
【請求項１７】前記増幅するステップにおいて１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いることを特徴とする請求項１６記載の植物の生長の活性度合いの測定方法。
【請求項１８】植物の生育領域の微生物叢を測定する方法であって、前記植物の生育領域の土壌を採取するステップと、前記採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて前記懸濁および分散処理により得られた微生物叢に含まれる微生物に対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより微生物叢に含まれる微生物のＤＮＡから複数のＤＮＡ断片を増幅し、前記増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により微生物叢に含まれる微生物の種類を識別するステップとを含むことを特徴とする植物の生育領域の微生物叢の測定方法。
【請求項１９】植物の生育領域の状態を制御する方法であって、前記生育領域の硝化細菌の活性状態を制御することにより、前記生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御することを特徴とする植物の生育領域の状態制御方法。
【請求項２０】前記生育領域の温度、酸素量または含水率を制御することにより、前記生育領域の硝化細菌の活性状態を制御することを特徴とする請求項１９記載の植物の生育領域の状態制御方法。
【請求項２１】植物の生長の活性度合いを測定する第１の測定手段と、植物の生育領域の微生物叢を測定する第２の測定手段と、前記植物の生長の活性度合いの測定結果および前記微生物叢の測定結果に基づいて前記植物の生育領域の状態を制御する制御手段とを備えたことを特徴とする植物育成システム。

【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物育成方法、植物育成システム、植物の生長の活性度合いの測定方法、植物の生育領域の微生物叢の測定方法および植物の生育領域の状態制御方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物工場において、種々の植物を育成することが行われている。従来の植物工場では、植物育成のために、光、水、温度および空気の供給が制御される。それにより、植物を最適な環境で育成することができる。
【０００３】具体的には、植物育成室の温度、湿度、照度およびＣＯ₂濃度を測定し、その測定結果に基づいて照明の明るさ、照明のオン－オフの時間帯、室内の温度および湿度を制御するとともに、酸素と二酸化炭素とのバランスの空調制御を行なっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、自然の中では、植物は土壌中の微生物にも影響を受けて生長する。より自然に近い状態で植物を育成するために微生物を利用することが有効なことは知られているが、土壌等の微生物叢を人為的に制御する技術がないために、現状では、微生物叢の制御を簡便に行うことができない。そのため、植物工場等の植物育成に微生物叢の制御は行われていない。
【０００５】本発明の目的は、植物を効果的に育成する植物育成方法および植物育成システムを提供することである。
【０００６】本発明の他の目的は、植物の生長の活性度合いを容易に測定することができる測定方法を提供することである。
【０００７】本発明のさらに他の目的は、植物の生育領域の微生物叢を容易に測定することができる測定方法を提供することである。
【０００８】本発明のさらに他の目的は、植物の生育領域の状態を容易に制御することができる制御方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段および発明の効果】第１の発明に係る植物育成方法は、植物の生長の活性度合いを測定するステップと、植物の生育領域の微生物叢を測定するステップと、植物の生長の活性度合いの測定結果および微生物叢の測定結果に基づいて植物の生育領域の状態を制御するステップとを備えたものである。
【００１０】本発明に係る植物育成方法においては、植物の生長の活性度合いが測定されるとともに、植物の生育領域の微生物叢が測定される。そして、植物の生長の活性度合いの測定結果および微生物叢の測定結果に基づいて植物の生育領域の状態が制御される。
【００１１】それにより、植物の育成に関与する微生物叢を植物の生育領域に人為的に形成することができる。その結果、自然に近い状態での植物の生長を行わせることができる。
【００１２】活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含んでもよい。
【００１３】この場合、増幅確率が制限されているので、電気泳動像におけるバンドとｍＲＮＡとの対応付けが可能になる。それにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００１４】増幅確率は、平均的に１種類のｃＤＮＡから２種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることが好ましく、平均的に１種類のｃＤＮＡから１種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることがより好ましい。
【００１５】活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、複数種類のプライマーを用いて抽出された複数種類のｍＲＮＡから複数種類のｃＤＮＡを合成するとともに、それらの複数種類のプライマーを一度に用いて合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含んでもよい。
【００１６】この場合、増幅確率が制限されているので、電気泳動像におけるバンドとｍＲＮＡとの対応付けが可能になる。それにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００１７】特に、ｍＲＮＡからｃＤＮＡの合成およびポリメラーゼ連鎖反応を共通のプライマーを用いて行うことができるので、活性度合いを簡便に測定することができる。
【００１８】増幅確率は、平均的に１種類のｃＤＮＡから２種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることが好ましく、平均的に１種類のｃＤＮＡから１種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることがより好ましい。
【００１９】増幅するステップにおいて１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いてもよい。この場合、ポリメラーゼ連鎖反応法における増幅確率の設定が容易になる。
【００２０】活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、所定の塩基配列を有するプライマー対を用いて合成された複数種類のｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより植物の生長に関わる蛋白質の元となるｃＤＮＡを検出するステップと、検出されたｃＤＮＡの電気泳動像の解析により植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含んでもよい。
【００２１】この場合、植物の生長に関わる蛋白質の遺伝情報をコードしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００２２】活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、合成された複数種類のｃＤＮＡにハイブリダイゼーション法を適用することにより抽出された複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出するステップとを含んでもよい。
【００２３】この場合、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法により複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出することにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００２４】活性度合いを測定するステップは、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、抽出された複数種類のｍＲＮＡにハイブリダイゼーション法を適用することにより複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出するステップとを含んでもよい。
【００２５】この場合、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法により複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出することにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００２６】微生物叢を測定するステップは、植物の生育領域の土壌を採取するステップと、採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、懸濁および分散処理により得られた微生物を培養および生化学検査し、微生物の種類および量を検出するステップとを含んでもよい。
【００２７】この場合、検出された微生物の種類および量に基づいて植物の生育領域の土壌中の微生物叢の状態を知ることができる。
【００２８】微生物叢を測定するステップは、植物の生育領域の土壌を採取するステップと、採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、懸濁および分散処理により得られた微生物叢に含まれる微生物に対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより微生物叢に含まれる微生物のＤＮＡから複数のＤＮＡ断片を増幅し、増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により微生物叢に含まれる微生物の種類を識別するステップとを含んでもよい。
【００２９】この場合、植物の生育領域の土壌中の微生物叢の状態を容易に知ることができる。
【００３０】複数のＤＮＡ断片を増幅する際に１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いてもよい。この場合、ポリメラーゼ連鎖反応法における増幅確率の設定が容易になる。
【００３１】微生物叢を測定するステップは、植物の生育領域の土壌を採取するステップと、採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、懸濁および分散処理により得られた微生物叢に含まれる微生物のｒＲＮＡの遺伝子を保存したＤＮＡ領域（以降ｒＤＮＡと呼ぶ）をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅し、増幅結果の解析により微生物叢に含まれる微生物の種類を識別するステップとを含んでもよい。
【００３２】この場合、植物の生育領域の土壌中の微生物叢の状態を容易に知ることができる。
【００３３】植物の生育領域の状態を制御するステップは、生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御するステップを含んでもよい。
【００３４】この場合、生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御することにより、植物の生長の活性度合いを制御することができる。
【００３５】生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御するステップは、生育領域の硝化細菌の活性状態を制御するステップを含んでもよい。
【００３６】この場合、生育領域の硝化細菌の活性状態を制御することにより、生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御することができる。
【００３７】生育領域の硝化細菌の活性状態を制御するステップは、生育領域の温度、酸素量または含水率を制御するステップを含んでもよい。
【００３８】この場合、生育領域の温度、酸素量または含水率を制御することにより、生育領域の硝化細菌の活性状態を制御することができる。
【００３９】第２の発明に係る植物の生長の活性度合いの測定方法は、植物の生長の活性度合いを測定する方法であって、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、抽出された複数種類のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて複数種類のｃＤＮＡを合成するステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含み、増幅するステップにおいて１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いてもよい。
【００４０】この場合、増幅確率が制限されているので、電気泳動像におけるバンドとｍＲＮＡとの対応付けが可能になる。それにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００４１】また、１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いているので、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅確率の設定が容易になる。
【００４２】増幅確率は、平均的に１種類のｃＤＮＡから２種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることが好ましく、平均的に１種類のｃＤＮＡから１種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることがより好ましい。
【００４３】第３の発明に係る植物の生長の活性度合いの測定方法は、植物の生長の活性度合いを測定する方法であって、植物から複数種類のｍＲＮＡを抽出するステップと、複数種類のプライマーを用いて抽出された複数種類のｍＲＮＡから複数種類のｃＤＮＡを合成するとともに、それらの複数種類のプライマーを一度に用いて合成された複数種類のｃＤＮＡに対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより複数のＤＮＡ断片を増幅するステップと、増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により植物の生長の活性度合いを判定するステップとを含むものである。
【００４４】この場合、増幅確率が制限されているので、電気泳動像におけるバンドとｍＲＮＡとの対応付けが可能になる。それにより、植物の生長に関わる蛋白質の発現状態を検出することができる。その結果、植物の生長の活性度合いを判定することができる。
【００４５】特に、ｍＲＮＡからｃＤＮＡの合成およびポリメラーゼ連鎖反応を共通のプライマーを用いて行うことができるので、活性度合いを簡便に測定することができる。
【００４６】増幅確率は、平均的に１種類のｃＤＮＡから２種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることが好ましく、平均的に１種類のｃＤＮＡから１種類以下のＤＮＡ断片が増幅される値であることがより好ましい。
【００４７】増幅するステップにおいて１つの反応溶液に対して複数種類のプライマーを用いてもよい。この場合、ポリメラーゼ連鎖反応法における増幅確率の設定が容易になる。
【００４８】第４の発明に係る植物の生育領域の微生物叢の測定方法は、植物の生育領域の微生物叢を測定する方法であって、植物の生育領域の土壌を採取するステップと、採取された土壌に懸濁および分散処理を行うステップと、複数種類のプライマーを一度に用いて懸濁および分散処理により得られた微生物叢に含まれる微生物に対して増幅確率を制限したポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより微生物叢に含まれる微生物のＤＮＡから複数のＤＮＡ断片を増幅し、増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像の解析により微生物叢に含まれる微生物の種類を識別するステップとを含んでもよい。
【００４９】この場合、植物の生育領域の土壌中の微生物叢の状態を容易に知ることができる。
【００５０】第５の発明に係る植物の生育領域の状態の制御方法は、植物の生育領域の状態を制御する方法であって、生育領域の硝化細菌の活性状態を制御することにより、生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御するものである。
【００５１】この場合、生育領域の硝化細菌の活性状態を制御することにより、生育領域の硝酸塩または亜硝酸塩の量を制御し、植物の生長の活性度合いを制御することができる。
【００５２】生育領域の温度、酸素量または含水率を制御することにより、生育領域の硝化細菌の活性状態を制御してもよい。
【００５３】第６の発明に係る植物育成システムは、植物の生長の活性度合いを測定する第１の測定手段と、植物の生育領域の微生物叢を測定する第２の測定手段と、植物の生長の活性度合いの測定結果および微生物叢の測定結果に基づいて植物の生育領域の状態を制御する制御手段とを備えたものである。
【００５４】本発明に係る植物育成システムにおいては、植物の生長の活性度合いが測定されるとともに、植物の生育領域の微生物叢が測定される。そして、植物の生長の活性度合いの測定結果および微生物叢の測定結果に基づいて植物の生育領域の状態が制御される。
【００５５】それにより、植物の育成領域に植物の育成に関与する微生物叢を人為的に形成することができる。その結果、自然に近い状態での植物の生長を行わせることができる。
【００５６】
【発明の実施の形態】図１は本発明の一実施の形態における植物育成方法を説明するための模式図である。図１に示すように、植物は、種子の発芽、花芽の形成、開花および果実の形成と生長する。
【００５７】本実施の形態では、植物の生長の活性度合いをモニターするとともに、土壌等の微生物叢をモニターする。
【００５８】植物の生長の活性度合いのモニターでは、葉の生長の活性度合いの確認、花の生長の活性度合いの確認および実の生長の活性度合いの確認を順に行う。
【００５９】植物は、葉が生長するときに硝酸塩、亜硝酸塩等の栄養分を多く必要とする。硝酸塩および亜硝酸塩の量は、土壌中の硝化細菌の活性により変化する。
【００６０】特異的な微生物の活性は植物の育成を促進させる。特に、硝化細菌群は土壌中の有機物（蛋白質等）から硝酸塩および亜硝酸塩を作ることができる。植物はこれを吸収し生長する。植物の葉が生長する時期には大量の窒素成分が必要となるため、その時期にあわせて硝酸塩および亜硝酸塩を作る。根の近傍で生成される硝酸塩および亜硝酸塩は効率的に根に吸収される。後述するように、硝化細菌群の活性は、温度、酸素量、ｐＨおよび含水率で制御できる。土壌の全部あるいは一部の環境を変えることにより、硝化細菌群の活性状態を人為的に制御し、根の周辺の硝酸塩および亜硝酸塩の量を増加させる。
【００６１】植物の生長の活性度合いをモニターすることにより、葉の生長が開始された時期を知ることができる。葉の生長が開始されたならば、土壌等の微生物叢をモニターしつつ、土壌等の温度および通気量を制御することにより、硝化細菌群の種類数および量が増加するように調節する。この場合、硝化細菌群が活性化するように、硝化細菌群に至適な温度、通気量および含水率への制御を開始する。
【００６２】続けて、植物の生長の活性度合いをモニターすることにより、花の生長が開始された時期を知ることができる。花の生長が開始されたならば、土壌等の微生物叢をモニターしつつ、土壌等の温度および通気量の制御状態を変更し、硝化細菌群が減少する状態を作り出す。ここでは、硝化細菌群が不活性化するように、硝化細菌群の好まない温度、通気量および含水率への制御を開始する。
【００６３】さらに、植物の生長の活性度合いをモニターすることにより、実の生長が開始された時期を知ることができる。実の生長が開始されたならば、土壌等の微生物叢をモニターしつつ、土壌等の温度、通気量および含水率を制御し、引き続き硝化細菌群が減少する状態を維持する。
【００６４】このようにして、葉が十分に繁った植物を作ることができ、花や実も適切な状態で生長させることができる効果的な植物育成を行うことができる。
【００６５】植物の生長に関係する微生物群であれば、硝化細菌群と同様にして容易に制御することができる。
【００６６】このように、土壌等の微生物叢を制御することにより、植物の育成状態を制御することが可能となる。リン酸塩を生成する微生物群やその他の有用な栄養分を生産する微生物群を用いることも有用である。これらは、上記２種類のモニタリングによって効率的に行うことができる。
【００６７】（１）植物の生長の活性度合いのモニタリング植物の活性度合いをＲＮＡの発現状態（量および種類）により評価することができる。これは２つの方法に大別することができる。
【００６８】１つの方法は、生長に関わる特異的な遺伝子の定量的検出を行う方法である。生長に関わる特異的な遺伝子とは、例えば、葉の生長に関わる遺伝子、花の生長に関わる遺伝子および実の生長に関わる遺伝子である。
【００６９】もう１つの方法は、植物全体のＲＮＡを測定する方法であり、ＳＳＣ－ＰＣＲ法をＲＮＡに改良した方法である。ＳＳＣ－ＰＣＲ法（Single Strain CountingPolymerase Chain Reaction法)では、ディファレンシャルディスプレー法（differential display法；P. Liang, A. B. Pardee, Science, 257, 967 (1992)）と異なり、平均的に１種類のＲＮＡから得られるＤＮＡ断片の種類数を多くとも１個程度にするように、増幅確率を適切に制限する（特開2000-270867号公報）。そのため、電気泳動像のバンドとＲＮＡとの対応が可能となる。これによって、より実態に近いＲＮＡの発現状態を観測できる。ＳＳＣ－ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを識別する方法については後述する。
【００７０】図２は植物の生長の活性度合いのモニタリング方法を示す模式図である。植物の生長の活性度合いをｍＲＮＡの発現状態で測定する。その方法としては、以下の４つの方法を適宜選択することができる。
【００７１】（ａ）増幅確率を制限したＰＣＲ法によるｃＤＮＡプールの増幅まず、植物１００から複数種類のｍＲＮＡを抽出する（ステップＳ１）。逆転写酵素であるオリゴｄＴプライマーを用いて一般的な方法で複数種類のｃＤＮＡを合成し、複数種類のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプールを調整する（ステップＳ２）。そして、増幅確率を制限したＳＳＣ－ＰＣＲ法により任意に選択された複数種類のプライマーを用いてｃＤＮＡプールのＰＣＲ増幅を行う（ステップＳ３）。この場合、調製したｃＤＮＡプールを鋳型として用いて、１種類のｃＤＮＡから多くとも１種類のＤＮＡ断片が増幅できる増幅確率となるようにＰＣＲ条件を設定する（特開2000-270867号参照）。最後に、ＳＳＣ－ＰＣＲ法により増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像のバンドを解析する（ステップＳ８）。バンドとｍＲＮＡとを対応づけることにより、植物１００の発現状態を観測することができる。
【００７２】従来のディファレンシャルディスプレー法では、１回の増幅で多くの種類のＤＮＡ断片を得るためのＰＣＲ条件が用いられている。しかし、多くのＤＮＡ断片を増幅すると電気泳動像が複雑になり、バンドに対応するｍＲＮＡを見出すのが困難になる。
【００７３】本例のように、ｍＲＮＡから多くとも１種類のＤＮＡ断片が増幅できるように条件を設定すると、電気泳動像で得られるバンドは、それぞれ異なるｍＲＮＡに対応する。そのため、バンドの解析が容易となる。さらに、バンドは単一成分から形成されることが多いため、切出してクローニングすることが容易であり、切出したバンドの塩基配列情報から何の蛋白質に対応するかを推測することが可能となる。
【００７４】また、ＳＳＣ－ＰＣＲ法では、ディファレンシャルディスプレー法よりも反応の特異性が高いことから、増幅の再現性が高く、キメラ等の予期しないＰＣＲ断片の増幅を極力制限することができる。
【００７５】増幅の確率を制限する方法としては、１種類のプライマーを用いて、マグネシウム濃度およびアニーリング温度の調整により行ってもよいが、１つのＰＣＲ反応溶液に２種類以上のプライマーを共存させることが好ましい。ｃＤＮＡプールを増幅した結果、最終的に電気泳動像で観察されるバンド数が１～１００本、望ましくは１～２５本現れるように増幅確率を制限する。
【００７６】（ｂ）増幅確率を制限したＰＣＲ法によるｍＲＮＡの直接増幅まず、植物１００から複数種類のｍＲＮＡを抽出する（ステップＳ１）。次に、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写を行なうのではなく、ＳＳＣ－ＰＣＲ法により任意に選択された複数種類のプライマーを用いて複数種類のｃＤＮＡの合成およびそれに続く増幅確率を制限したＰＣＲ増幅を行う（ステップＳ４）。この場合、１種類のｍＲＮＡから多くとも１種類のＤＮＡ断片が増幅できるＰＣＲ用プライマーによりｃＤＮＡ鎖を合成し、引き続きＰＣＲ反応を行う。これにより、ｃＤＮＡプール調製のステップが不要となる。
【００７７】最後に、ＳＳＣ－ＰＣＲ法により増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像のバンドを解析する（ステップＳ８）。バンドとｍＲＮＡとを対応づけることにより、植物１００の発現状態を観測することができる。
【００７８】増幅確率を制限する方法としては、１種類のプライマーを用いて、マグネシウム濃度およびアニーリング温度の調整により行ってもよいが、１つのＰＣＲ反応溶液に２種類以上のプライマーを共存させることが好ましい。ｍＲＮＡを増幅した結果、最終的に電気泳動像で観察されるバンド数が１～１００本、好ましくは１～２５本現れるように増幅確率を制限する。
【００７９】（ｃ）特異的プライマー対を用いた１種類以上の蛋白質の発現検出まず、植物１００から複数種類のｍＲＮＡを抽出する（ステップＳ１）。逆転写酵素であるオリゴｄＴプライマーを用いて一般的な方法で複数種類のｃＤＮＡを合成し、複数種類のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプールを調整する（ステップＳ５）。次に、一般的な方法により調製したｃＤＮＡプールを鋳型として、所定の塩基配列を有するプライマー対（以下、特異的プライマー対と呼ぶ）を用いて通常のＰＣＲ法により植物１００の生長に関わる１種類以上の蛋白質の発現状態を検出する（ステップＳ６）。ここでは、蛋白質の元となる１種類以上のｃＤＮＡを特異的プライマー対を用いて検出する。
【００８０】最後に、ＰＣＲ法により増幅された複数のＤＮＡ断片の電気泳動像のバンドを解析する（ステップＳ８）。バンドとｍＲＮＡとを対応づけることにより、植物１００の生長に関わる１種類以上の蛋白質の発現状態を観測することができる。
【００８１】この場合、定量的ＰＣＲ法を用いて定量分析することによりさらに詳しい生長の度合いを調べることができる。調べる蛋白質の数は１種類以上とし、調べる蛋白質の種類が多いほど、平均的な活性度合いを調べることができる。また、葉の生長状態、花の生長状態または実の生長状態という組織特異的な活性度、あるいは、ライフサイクル特異的な活性度を検出することができる。
【００８２】（ｄ）ＤＮＡチップによるｍＲＮＡの発現パターンの検出まず、植物１００から複数種類のｍＲＮＡを抽出する（ステップＳ１）。次に、ＤＮＡチップを用いて複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出する（ステップＳ７）。種々のライフサイクルで発現する複数種類のｃＤＮＡを配列したＤＮＡチップを用いて活性状態を簡便に測定することがきる。
【００８３】この場合、抽出した複数種類のｍＲＮＡを直接ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法により検出してもよい。あるいは、ステップＳ５においてｃＤＮＡプールを調整し、ｃＤＮＡプールの複数種類のｃＤＮＡを変性処理後、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡを検出することにより複数種類のｍＲＮＡの発現パターンを検出してもよい。
【００８４】（２）土壌等の領域の微生物叢のモニタリング図３は土壌等の微生物叢のモニタリング方法を示す模式図である。土壌等の微生物叢のモニタリングでは、以下の方法の中から適切な１または複数の方法を選択する。
【００８５】（Ａ）培養法まず、土壌等２００を生理食塩水等で懸濁し、適切な分散処理を行う（ステップＳ１１）。その後、一般的な細菌用培地等で調製した寒天プレート上に塗布し、適切な温度で適切な期間、培養する。培養後、寒天プレート上に形成されるコロニーを採取し、生化学検査等を行い、土壌等２００に含まれている微生物の種類および存在数を調べる（ステップＳ１２）。
【００８６】（Ｂ）ＳＳＣ－ＰＣＲ法ここで、ＳＳＣ－ＰＣＲ法は、特開平11-276176号公報および特開平11-3419893号公報に記載されており、微生物のＤＮＡから増幅されるＤＮＡ断片の種類数を制限し、電気泳動像上に１本程度のＤＮＡ断片が得られる条件で任意に選択された複数種類のプライマーを用いて微生物をＰＣＲ増幅する方法である。
【００８７】まず、土壌等２００を生理食塩水等に懸濁し、適切な分散処理を行う（ステップＳ１１）。その後、複数種類の微生物のＤＮＡを鋳型として用いてＳＳＣ－ＰＣＲ法によりＰＣＲ増幅を行なう。得られたＰＣＲ産物を電気泳動パターンにより解析する（ステップＳ１３）。
【００８８】土壌等２００の状態の経時変化を調べることにより、増減する微生物についての情報を見出す。また、微生物ごとのＳＳＣ－ＰＣＲ法で調べた電気泳動パターンを保存したデータベースと照合することにより、土壌等２００に含まれる微生物の種類を推定する。
【００８９】（Ｃ）ｒＤＮＡ領域のＰＣＲ増幅・解析まず、土壌等２００を生理食塩水等に懸濁し、適切な分散処理を行う（ステップＳ１１）。その後、ｒＤＮＡ領域のＰＣＲ増幅および解析を行う（ステップＳ１４）。
【００９０】ここで、ｒＤＮＡ領域は、細菌など同じ種類の微生物であれば同じプライマー対で増幅できるため、微生物の分類などに用いられている。
【００９１】細菌では、１６ＳｒＲＮＡの遺伝情報が書き込まれたＤＮＡ領域（以降、１６ＳｒＤＮＡと呼ぶ）の塩基配列が細菌の種類を識別するために用いられている（梅崎良則ら、セグメント細菌の定着と腸粘膜諸形質の活性化、腸内フローラと腸内増殖、光岡知足編、学会出版センター、pp. 43-63 (1997)など参照）。
【００９２】また、１６ＳｒＤＮＡ領域の硝化細菌に特有の塩基配列を利用して、硝化細菌のみを見出す方法を利用してもよい（G. A. Kowalchuk, Z. S. Naoumenko, P. J. L. Derikx, A. Felske, J. R. Stephen, I. A. Arkhipchenko, "Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the ( subdivision of the class Proteobacteria in compost and composted materials", Applied and Environment Microbiology, Vol. 65, No. 2, 396-403 (1999)参照）。
【００９３】（Ｄ）簡易測定法調べたい微生物が予めわかっている場合には、上記（Ｂ），（Ｃ）の方法を簡便化した３つの簡易測定法のいずれかを用いてもよい（ステップＳ１５）。
【００９４】第１の方法は、予めステップＳ１３のＳＳＣ－ＰＣＲ法またはステップＳ１４のＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡ断片の塩基配列からプライマー対を設計しておく。土壌等を生理食塩水等に懸濁し、適切な分散処理を行なった後（ステップＳ１１）、微生物のＤＮＡを鋳型として用いて、設計したプライマー対によりＰＣＲ増幅を行なう。これにより、簡易に微生物の存在を知ることができる。さらに、定量的ＰＣＲ法（中山広樹著、定量的ＰＣＲ、バイオ実験イラストレイテッド、秀潤社、東京、pp. 141-151 (1996)）を用い、所望の微生物の存在量を調べることが有効である。
【００９５】第２の方法は、予めステップＳ１３のＳＳＣ－ＰＣＲ法またはステップＳ１４のＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡ断片、あるいは、それと同一の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法、あるいは、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション法により微生物を検出する方法である。
【００９６】特に、調べたい微生物全てについて、ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡ断片、あるいは、それと同一の塩基配列を有するＤＮＡ断片を基板上に配列させたＤＮＡチップを用いることにより一度に多くの微生物の存在を検出する方法が有効である（特願平11-330924号）。土壌等を生理食塩水等に懸濁し、適切な分散処理を行なった後、微生物のＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ増幅した産物を含む溶液、あるいは、土壌等を生理食塩水等に懸濁し、適切な分散処理を行なった後（ステップＳ１１）、微生物から抽出したＲＮＡを含む溶液を、ＤＮＡチップに接触させることにより土壌等に含まれる微生物を複数同時に検出する。
【００９７】第３の方法は、ＦＩＳＨ（Florescence In Situ Hybridization）法による微生物像の測定である。このＦＩＳＨ法では、ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡ断片、あるいは、それと同一の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法、あるいは、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション法により、in situハイブリダイゼーションを行ない、顕微鏡下で微生物像を観察する方法である（Amann, R, W. Ludwig, K. H. Schleifer,Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation, Microbiol. Rev., 59, 143-169 (1995)参照）。
【００９８】土壌そのもの、あるいは、土壌等を生理食塩水等に懸濁し、適切な分散処理を行なった後（ステップＳ１１）、その懸濁液を用い、in situハイブリダイゼーションの処理を行い、顕微鏡下で微生物の像を蛍光観察する。
【００９９】（３）土壌中の硝酸塩および亜硝酸塩の蓄積状態の制御方法図４は土壌中の硝酸塩および亜硝酸塩の蓄積状態の制御方法を示す模式図である。また、表１に硝酸塩および亜硝酸塩の増加および減少の要因を示す。
【０１００】
【表１】

【０１０１】土壌等における硝酸塩および亜硝酸塩の量は大半が蛋白質である生物体窒素からアンモニアを経て生成される。硝酸塩および亜硝酸塩の量は以下の要因で変化する。
【０１０２】図４および表１に示すように、硝化細菌の活性化、アンモニア量の増加、硝酸塩および亜硝酸塩の流出量の減少および脱窒菌の不活性化により、硝酸塩および亜硝酸塩の量が増加する。また、硝化細菌の不活性化、アンモニア量の減少、硝酸塩および亜硝酸塩の流出量の増加および脱窒菌の活性化により、硝酸塩および亜硝酸塩の量が減少する。
【０１０３】硝化細菌の活性は、温度に影響を受け、土壌中の硝酸イオン、亜硝酸イオンの量が変化する。図５は温度と硝酸イオンおよび亜硝酸イオンとの関係を示す図である。図５に示すように、硝酸イオンおよび亜硝酸イオンの量は、温度により変化する。
【０１０４】硝化細菌の活性は、温度以外にも、土壌中のｐＨ、空気量、含水率、栄養分の量、硝化細菌以外の微生物により影響を受ける。
【０１０５】これらのパラメータを用いて、植物が硝酸塩および亜硝酸塩を必要とする時期に、硝化細菌が最も活性となる温度および空気量へ調節し、土壌の硝酸塩および亜硝酸塩の量を増加させる。逆に、硝酸塩および亜硝酸塩の不要な時期にこれらのパラメータを至的な条件から外すことにより硝酸塩および亜硝酸塩の量を減少させる。急速に亜硝酸塩および硝酸塩の量を減少させるために、水に溶けやすい硝酸塩および亜硝酸塩を水で洗浄することが可能であり、土壌への通気量の増加により原料となるアンモニアを気散させることも有効である。
【０１０６】なお、硝化細菌は、Nitrosomonas属、Nitrosococus属、Nitrosopire属、Nitrosolobus属、Nitrobacter属に分類される細菌である。
【０１０７】図６は本発明の植物育成システムの一例である植物工場の構成を示す模式図である。
【０１０８】図６の植物工場１０においては、微生物叢の制御による効果的植物育成を行なうことができる。
【０１０９】図６の植物工場１０において、ハウジング（植物育成室）２内に照明器具３および空調機４が設けられている。また、ハウジング２内の土壌５中にヒータ６が埋め込まれ、土壌５中に空気を送るエアポンプ７が設けられている。
【０１１０】さらに、ハウジング２内には、温度・湿度計１１、照度計１２、ＣＯ₂濃度計１３が設けられている。また、ハウジング２内の土壌５中に含水率計１４、温度計１５、ｐＨ計１６、酸素量測定器１７および酸化還元電位計１８が埋め込まれている。
【０１１１】また、植物生長の活性度合いモニター装置２０および微生物叢モニター装置３０が設けられている。植物生長の活性度合いモニター装置２０は、上記の植物生長の活性度合いのモニタリングを自動的に実行する。微生物叢モニター装置３０は、上記の土壌等の微生物叢のモニタリングを自動的に実行する。
【０１１２】空調・照明制御装置４０は、温度・湿度計１１により測定された温度および湿度、照度計１２により測定された照度、ＣＯ₂濃度計１３により測定されたＣＯ₂濃度に基づいて照明器具３および空調機４を制御する。また、土壌環境制御装置５０は、含水率計１４により測定された含水率、温度計１５により測定された温度、ｐＨ計１６により測定されたｐＨ、酸素量測定器１７により測定された酸素量、および酸化還元電位計１８により測定された酸化還元電位に基づいて、ヒータ６による温度およびエアポンプ７による通気量を制御する。
【０１１３】植物育成システム制御系６０は、植物生長の活性度合いモニター装置２０および微生物叢モニター装置３０の出力に基づいて、空調・照明制御装置４０および土壌環境制御装置５０を全体的に制御する。この植物育成システム制御系６０を遠隔制御装置７０を用いて遠隔制御してもよい。
【０１１４】図６の植物工場１０では、植物の生長の活性度合いを調べながら、適切に土壌環境を制御することにより微生物叢を制御することができる。
【０１１５】一例として、食用の果実を育成する場合の制御方法を示す。植物生長の活性度合いモニター装置２０が葉の生長の活性が高いことを知らせているときには、土壌環境制御装置５０により土壌環境を硝化細菌が活性化される条件に設定する。そして、土壌中の硝化細菌が活性になることを微生物叢モニター装置３０により確認する。植物生長の活性度合いモニター装置２０が開花形成の活性が高まったことを知らせると、土壌環境制御装置５０により土壌環境を硝化細菌が不活性化される条件に変更する。そして、土壌中の硝化細菌が不活性になることを、微生物叢モニター装置３０により確認する。これにより、果実が育つ時期に窒素源過多による果実の生長不良を抑制し、有機栽培特有の味のある果実を得ることができる。
【０１１６】以上のように、本実施の形態の植物育成方法および植物育成システムによれば、植物工場における植物の育成をより効率的に行うことが可能になる。葉を食用とするほうれん草等や種子を食用とする豆類などは、肥料を与えるべき時期が異なるが、微生物叢を制御することにより目的に合った植物育成が容易になる。
【０１１７】また、近年、大量の化学肥料を施肥することによる硝酸性窒素の地下水汚染が問題となっており、本実施の形態の植物育成方法および植物育成システムにおいては、必要な量の硝酸塩および亜硝酸塩を適宜生産することができ、汚染を低減することができる。また、微生物の分解力を利用するため、堆肥を有効利用することが可能になる。
【０１１８】（４）ＳＳＣ－ＰＣＲ法ここで、ＳＳＣ－ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現状態を検出する方法を説明する。
【０１１９】１．ｍＲＮＡの調製植物の細胞または組織からのｍＲＮＡの調製は、特に限定はなく周知の方法で行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの調製方法は、Current Protocols in Molecular Biology,4.0.3-4.5.3に記載されている。また、簡便には、市販のキット例えば、ＱＩＡＧＥＮ製ＲＮｅａｓｙＴｏｔａｌＲＮＡＳｙｓｔｅｍを用いて行うこともできる。
【０１２０】２．ｃＤＮＡプールの調製本例のＤＮＡ増幅方法では、先ず、例えば、植物の細胞から抽出したｍＲＮＡプール（混合液）を基に逆転写酵素を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡプールを得る。本例では、この逆転写酵素を用いた逆転写反応は、特に限定がなく、通常の方法によって行うことができる（Molecular Cloning (ColdSpring Harbor Laboratory Pres 1989),II-8)。
【０１２１】３．ｃＤＮＡプールを用いたＤＮＡ断片の増幅（１）増幅させるＤＮＡ断片数このＤＮＡ断片の増幅に用いるＰＣＲプライマーは、一種類のプライマー又は２種類以上のプライマーセットからなり、前記ｃＤＮＡプールのうち限定された種類数のｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片を増幅し得る増幅確率を有している。なお、この増幅確率とは、総塩基配列長さ当たりの増幅バンド数を意味する。
【０１２２】ここで限定された種類数のｃＤＮＡは、各増幅されるＤＮＡ断片及びその増幅量などの再現性を向上させることが可能となる数であって、最終的な電気泳動等により解析で各増幅産物が識別し得る数であることが好ましい。一方、未知のｍＲＮＡを調べるためには、ある程度の種類のｍＲＮＡに対応したｃＤＮＡを増幅させる必要がある。このような観点から、このｃＤＮＡの限定された種類数は、例えば、１００種類以下であり、より正確な解析を行うためには、１～２５種前後とする。
【０１２３】（２）プライマーの増幅確率また、上記した限定された種類数のｍＲＮＡを合成するためには、プライマーは一定の増幅確率を有していることが必要となる。上述したように、増幅確率とは、総塩基配列長さ当たりの増幅バンド数を意味する。従って、ここでｍＲＮＡの長さを2000bpとして計算すると、5000種類のｍＲＮＡが存在する細胞又は組織を調べる場合には、ｃＤＮＡプール中に総合計で1×10⁷bpのｃＤＮＡが存在することになる。従って、この場合には、増幅確率10^-6のプライマーを用いることにより、１０種類のｃＤＮＡ断片が増幅されることになる。
【０１２４】また、仮に5000種類より多い場合には、増幅確率の小さなプライマーを用い、逆にｍＲＮＡが5000種類よりも少ない場合には増幅確率の大きなプライマーを用いる。さらに、平均のｍＲＮＡの長さが2000bpよりも大きな場合には増幅確率の小さなプライマーを用い、逆に2000bpよりも小さな場合には増幅確率の大きなプライマーを用いる。
【０１２５】このように複数種のｃＤＮＡプールを鋳型にＤＮＡ断片を増幅するために用いるプライマーの至適な増幅確率は、プール中に存在するｃＤＮＡの種類数、長さなどによるが、例えば、10^-5から10^-9であり、好適には10^-6から10^-7である。こうした増幅確率を有するプライマーは、ＰＣＲプライマーとして機能する程度の長さ、例えば、１２塩基前後とし、その塩基配列を種々の組み合わせから構成して、この増幅確率を示したものから選択することができる。例えば、特開2000-270867号公報に示すプライマーの中から所望の増幅確率を有するプライマーを用いることができる。
【０１２６】なお、このｃＤＮＡのプール中に存在するｃＤＮＡの種類数及びその長は、増幅確率の明らかな上記ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ反応を１種類、又は複数種類行い、得られるＤＮＡ断片の数を測定することで、簡便に調べることができる。
【０１２７】（３）ＰＣＲの条件ＰＣＲの反応液及びＰＣＲの条件は、上記増幅確率を有するプライマーにより上記限定した種類数のｃＤＮＡ断片を増幅し得るように調節する。ＰＣＲの反応液は、例えば、表２の組成とすることができる。また、ＰＣＲの反応条件としては、表３に示す条件とすることができる。
【０１２８】
【表２】

【０１２９】
【表３】

【０１３０】上記表２及び表３に示す条件では、目的とする種類数のＤＮＡ断片が増幅することができない場合には、より緩和な条件にすることができる。緩和な条件にするためには、例えばＰＣＲの反応液中の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）濃度を上昇させるか又はアニーリング温度（４５℃）を低下させるか等を行うことができる。具体的には、例えば、塩化マグネシウム濃度としては、１．０～３．０ｍＭの範囲で変更することができる。また、アニーリング温度は、例えば、４５℃～５５℃の範囲で変更してもよい。
【０１３１】増幅されるＤＮＡ断片の量は、上記反応溶液中マグネシウム濃度、ＰＣＲサイクルのアニーリング温度、ＰＣＲサイクルのサイクル数、鋳型濃度に依存するため、これを調節することにより、増幅させるＤＮＡ断片の量を適正化することができる。ここで、サイクル数としては、２５～４５サイクルとすることができ、好適には、２５～３５サイクルとすることができる。
【０１３２】４．ＤＮＡ断片の増幅方法及び電気泳動解析本実施形態のＤＮＡ断片増幅方法の一例を説明する。ここでは、ｍＲＮＡの種類数等が不明な場合に対応して、増幅確率の異なるプライマーをそれぞれ使用してｃＤＮＡプールからＤＮＡ断片を増幅する場合を示す。
【０１３３】図７において、マイクロタイタプレート５０の各ウェル５１のそれぞれに異なる増幅確率を有するプライマーが添加される。ここでは、１０^-8～１０^-6の増幅確率を有するプライマーを用いた。
【０１３４】これらウェル５１にｍＲＮＡプールから逆転写したｃＤＮＡプールの一部をそれぞれ添加する。そして、上記表１に示すようにＰＣＲバッファ、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼを添加して、反応液を調製する。
【０１３５】反応液調製後、マイクロタイタプレート５０を増幅器にセットする。この増幅器は、特に限定はなく、通常市販されている増幅器を使用することができる。増幅器にＰＣＲの条件、例えば、表３に示す条件を設定する。設定が終了したら、ＰＣＲ反応を開始させる。
【０１３６】ＰＣＲの一連の反応工程を図８に示す。なお、ここでは、一例として配列番号６９に示すプライマー（5'GGCTTCGAATCG`3）プライマーを用いた。
【０１３７】図８（ａ）に示す２本鎖のｃＤＮＡ１は、熱変性工程において、図８（ｂ）に示すように一本鎖ＤＮＡ２ａ，２ｂに分離される。図８（ｃ）に示すように、アニーリング工程において、プライマー１１ａは一本鎖ＤＮＡ２ａ，２ｂ中の相補する配列を探し、相補する配列があればその配列に融合する。プライマーが融合すると、図８（ｄ）に示すように、伸長工程において、ポリメラーゼによりプライマーからＤＮＡの伸長反応が起こり、２本鎖ＤＮＡ３ａ，３ｂが合成される。
【０１３８】ここで生成された２本鎖ＤＮＡ３ａ，３ｂは、再び、変性工程において、２本鎖が一本鎖に分離され、プライマーの融合、伸長がサイクル数分だけ繰り返されてＤＮＡ断片が順次増幅される。
【０１３９】ここで増幅されたＤＮＡ断片は、増幅産物を確認するために、電気泳動にかけられる。この電気泳動は、解析するＤＮＡ断片の数や長さにより、適切なものが使用される。例えば、アガロースゲルを用いた電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを用いることができる。また、分画するＤＮＡ断片の長さに幅がある場合には、ロングレンジ型ゲル及び装置を用いることができる。
【０１４０】図７に、上記電気泳動により増幅ＤＮＡ断片を分画した際の予想されるパターン像を示す。このように、増幅確率が高いプライマーを用いた場合には、ＤＮＡ断片の限定された種類数が多くなり、一方、増幅確率の低いプライマーを用いることにより、ＤＮＡ断片の種類数をさらに限定することができる。これにより、従来のようにｃＤＮＡを無作為に膨大な種類数を増幅させるＲＡＰＤ法（RandomAmplified Polymorphic ＤＮＡ法）に比して、ＤＮＡ断片の泳動パターンの解析をより正確に行うことができ、また、再現性を向上させることが可能となる。
【０１４１】したがって、このＤＮＡ増幅方法を異なる発生段階の細胞又は異なる組織由来のｍＲＮＡを用いて逆転写させたｃＤＮＡに適用することにより、発生段階を通したｍＲＮＡの発現状態、又は組織特異的なｍＲＮＡの発現状態を調べることが解析する場合に有効となる。また、このＤＮＡ増幅方法に用いられるプライマー耐熱性ポリメラーゼを含むＰＣＲ反応試薬をキットとして提供することにより簡便にｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの解析を行うことができる。

【出願人】	【識別番号】０００００１８８９【氏名又は名称】三洋電機株式会社
【出願日】	平成１３年４月２７日（２００１．４．２７）
【代理人】	【識別番号】１０００９８３０５【弁理士】【氏名又は名称】福島祥人
【公開番号】	特開２００２－３２５５１１（Ｐ２００２－３２５５１１Ａ）
【公開日】	平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２）
【出願番号】	特願２００１－１３３４７０（Ｐ２００１－１３３４７０）