| 【発明の名称】 |
シイタケ子実体、レンチヌラ・エドデス並びにその育種及び栽培方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】豊増 哲郎
【氏名】村岡 眞治郎
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| 【要約】 |
【課題】新規なシイタケ子実体、レンチヌラ・エドデス並びにその育種及び栽培方法を提供する。
【解決手段】集団交配育種によって、菌傘部にエリタデニンを１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上含有するシイタケ子実体産生能を有するレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を育種し、また、該レンチヌラ・エドデスを培養栽培し、又は高温でレンチヌラ・エドデスを栽培し、菌傘部に高含有量のエリタデニンを含むシイタケ子実体を得る。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 菌傘部に、エリタデニンを１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上含有することを特徴とするシイタケ子実体。
【請求項２】 菌傘部のエリタデニン含量が１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上である子実体を、温度１５〜２０℃の条件下で培養により産生する能力を有することを特徴とするレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）。
【請求項３】 寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８０７３を有するレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）に属する新規な菌株Ｈ４４。
【請求項４】 公知のレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）の中から、エリタデニン産生能の高いものを複数選択し、集団交配育種して、菌傘部のエリタデニン含量が１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上である子実体を、常温培養により産生する能力を有するレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を取得することを特徴とするレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）の育種方法。
【請求項５】 レンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を原基形成後、温度２５〜３４℃の条件下に培養して子実体を形成させることを特徴とするレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）の栽培方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、血清コレステロール低下作用を示す、シイタケ固有の成分エリタデニンを高含量に含むシイタケ子実体、及びエリタデニン産生能の高いレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）並びにその育種及び栽培方法に関するもので、シイタケ栽培技術に属するものである。
【０００２】
【従来の技術】シイタケに、血清コレステロール濃度を低下させる物質があることが見出され（Kaneda, T., Tokuda, S., J Nutr 90(4) 371-376(1966)Dec）、有効成分も単離され（Chibata, I., Okumura, K., Kmeyama, S., Kotera, K.,Experientia 25(12)1237-1238(1969)Dec 15）、エリタデニンという名称が付されている。
【０００３】エリタデニンは、アデニンにヒドロキシ酪酸が付加した化合物であって、マッシュルーム（ツクリタケ）に微量検出される以外、他のキノコには存在せず、シイタケ固有の成分である。
【０００４】このエリタデニンは、その上昇が動脈硬化の危険因子である血清コレステロール値を下げる働きがあるとされ、乾燥シイタケ９ｇ又は生シイタケ９０ｇを１週間毎日食べ続けると、コレステロール濃度がおよそ６〜１２％低下することが報告されている（Suzuki S., Ohshima, S., Mushroom Science IX (Part I) Proceedings of the Ninth International Scientific Congress on the Cultivationof Edible Fungi, Tokyo, 1974, 463-467）。
【０００５】また、アミノ酸代謝の中間体、ホモシステインの濃度は、脳梗塞の危険因子として知られているとともに、エリタデニンは、そのホモシステインの合成を阻害することも報告されている(A.M. Svardal, R. Djurhuns, H. Refsum, P.M. Ueland, Cancer Research 46, 5095-5100, October 1986)。
【０００６】これら薬効の認められるエリタデニンは、シイタケ中にデオキシエリタデニンとともに存在し、シイタケ子実体、特に菌傘部に多く含まれているが、それぞれの存在量は、５０．７〜９２．７ｍｇ／１００ｇＤＷ、７．７〜１３．６ｍｇ／１００ｇＤＷである（青柳康夫，正田悦子，菅原龍幸著「栄養と食糧」Ｖｏｌ．２９； Ｎｏ．８、４６０−４６１（１９７６））ので、日本人一人あたりのシイタケ平均摂取量（０．５ｇ乾物量／１日）を考慮すると、その薬効を期待するには含量が低いものである。
【０００７】一方、シイタケ新菌株の開発目標の多くは、多収性、耐病性、作型など種菌として販売することを目的とするもので、かかる観点からみれば、これまでに優れた品種が開発されてきたが、食用となる子実体に含まれる、このような生体調節機能に関する成分や栄養価に関して、品種を開発し、育種し、また栽培することはこれまでに殆どなされていないのが現状である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】このような現状に鑑み、発明者等は、生体調節機能に関する成分や栄養価の高い、特にエリタデニン含有量の多いシイタケの品種を開発し、育種し、またエリタデニン含有量の多いシイタケを栽培する方法を求めて検討を行った。
【０００９】その結果、発明者等は、エリタデニン含量に品種間差異があると推測し、まず、市販されているシイタケ菌株、保存されている野生シイタケ菌株を集め、それらを空調栽培し、エリタデニン産生能の高い菌株を選択した。
【００１０】一方、連続的変異を示す形質は、収量と同じくポリジーン支配のものと考え、エリタデニン含量関連遺伝子の集積を図るため、それら選択されたエリタデニン産生能の高い菌株の複数を集団交配、すなわち、選定した交配親から分離した胞子を交配し、その中から高含量菌株を選抜し、それらの間でさらに交配を繰り返したところ、二世代目の菌株に、空調栽培（温度１７℃、ＲＨ９０％）することによって、従来の２〜４倍量のエリタデニンを含むシイタケを収穫することが可能であることを見出すとともに、多収量性（４００ｇ／１．３ｋｇ菌床以上）であって、かつ、傘の色、形態等に優れた特徴を有するシイタケ子実体が得られることを見出し、さらに、原基形成後、高温下に培養して子実体を形成させると、エリタデニンの含有量の多いシイタケ子実体が得られることを見出し、この発明を完成したのである。
【００１１】この発明の目的は、より多くのエリタデニンを含むシイタケを育成栽培することによって、従来の摂取量、さらにはより少ない摂取量で健康維持に寄与することのできるシイタケを提供することである。
【００１２】この発明の他の目的は、このように栽培して得たシイタケを、健康食品素材として利用することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この発明の請求項１に記載の発明は、菌傘部に、エリタデニンを１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上含有することを特徴とするシイタケ子実体である。
【００１４】また、この発明の請求項２に記載の発明は、菌傘部のエリタデニン含量が１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上である子実体を、温度１５〜２０℃の条件下で培養により産生する能力を有することを特徴とするレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）である。
【００１５】さらに、請求項３に記載の発明は、寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８０７３を有するレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）に属する新規な菌株Ｈ４４である。
【００１６】また、請求項４に記載の発明は、公知のレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）の中から、エリタデニン産生能の高いものを複数選択し、集団交配育種して、菌傘部のエリタデニン含量が、１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上である子実体を、常温培養により産生する能力を有するレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を取得すること、を特徴とするレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）の育種方法である。
【００１７】さらに、請求項５に記載の発明は、レンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を原基形成後、温度２５〜３４℃の条件下に培養して、子実体を形成させること、を特徴とするレンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）の栽培方法である。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、この発明のシイタケ子実体、レンチヌラ・エドデス並びに育種及び栽培方法を、具体的な実施例に基づいて詳述する。
【００１９】＜育種方法＞市販されているシイタケ菌株、及び出願人が保存している野生シイタケ菌株合計６７菌株を集め、空調栽培によるスクリーニングを行った。まず、ブナとコーンプランを重量比４：１で混合し、水分を６５％に調製した培地をプラスチック製の培養袋に１．３ｋｇ詰め込み、温度１２１℃で９０分間殺菌したのち、スクリーニング用のシイタケ菌を接種し、温度を２２〜２３℃に維持しながら、湿度７０％の条件下で９０〜１２０日培養したのち、培養袋を取り除き、温度１７℃、湿度９０％、明条件下で子実体を発生させた。発生した子実体は、収穫後直ちに凍結乾燥し、粉末化してエリタデニン定量の試料とした。
【００２０】＜エリタデニンの定量＞エリタデニンの定量は、以下の手順で行った。２００ｍｇのシイタケ乾燥粉末に４ｍｌの５％過塩素酸を加え、遠心分離で抽出液を回収し、得た抽出液をＫＯＨで中和したのち、活性炭カラムに添加し、蒸留水で洗浄後、１．４％アンモニア含有５０％エタノールでエリタデニン画分を溶出し、遠心エバポレーターで濃縮乾固した。
【００２１】かくして得られたエリタデニン画分を、５ｍＭ臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、２０ｍＭリン酸水素二カリウム含有アセトニトリルに溶解し、液体クロマトグラフィー（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＲＰ Ａｑｕｅｏｕｓ ４．５×２５0ｍｍ装着、流速１．０ｍｌ／分）で、検出波長２６０ｎｍで定量する。
【００２２】このスクリーニングで、子実体の発生収量及びその形態、エリタデニン含量の３項目について調べ、出願人（財団法人日本きのこ研究所）が保管する「菌株番号８１２３、Ｃ−０４、Ａ−１２３株」を交配親として選定した。
【００２３】選定した「菌株番号８１２３、Ｃ−０４、Ａ−１２３株」のそれぞれの子実体から、担子胞子を採取して滅菌した蒸留水に懸濁した。胞子濃度をヘマトメーターで計測し、約１×１０6ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌになるよう希釈してから、同じ割合（１：１：１）で混合して寒天平板培地に播種（集団交配）し、温度２５℃で１〜２週間培養した後、寒天平板培地（直径９ｃｍのシャーレ）に生育した菌糸を切り取り、寒天斜面培地に接種した。
【００２４】このような操作を、１つの寒天平板培地について約１０本の寒天斜面培地（試験管）に接種して、約１０枚の寒天培地から１００本の試験管に接種して培養したのち、培養した菌糸の成長先端を、新しい寒天斜面培地（試験管）に移してさらに培養した。この操作を数回繰り返すことによって、均一な二核菌糸（ｄｉｋａｒｙｏｎ）を得た。
【００２５】得た二核菌糸は、菌床培地で栽培して子実体を収穫し、その担子細胞を採取すると同時に、エリタデニン含量を測定した。
【００２６】以上のように、「菌株番号８１２３、Ｃ−０４、Ａ−１２３株」の集団交配によって、約１００菌株の二核菌糸を栽培し、子実体を形成した８１株についてエリタデニン含量を測定した。
【００２７】子実体発生量が多く、なおかつエリタデニン含量の高かった１０株の胞子を、さらに前述の操作のように集団交配して、エリタデニン含量関連遺伝子の集積と形質の安定化を図った。
【００２８】このようにしてＦ２世代で、菌傘部のエリタデニン含量が１７０ｍｇ／１００ｇＤＷ以上である子実体産生能を有する菌株を３株得、それらを「Ｈ４４」「Ｈ７８」「Ｃ１８」と命名した。
【００２９】なお、それらの菌株を、後述する培養条件で発生させた子実体中のエリタデニン含量は、それぞれＨ４４；２１４ｍｇ／１００ｇＤＷＨ７８；１８６ｍｇ／１００ｇＤＷＣ１８；１８４ｍｇ／１００ｇＤＷである。
【００３０】これら３株のなかでも、Ｈ４４株は、子実体の発生量及び発生期間で優れたもので、「Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ Ｈ４４」と表示し、工業技術院生命工学技術研究所に、「寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８０７３」として寄託した。以下に、Ｈ４４株の特性を示す。
【００３１】Ｈ４４株の特性Ｈ４４株の菌学的諸性質並びに生化学的性質は、以下のとおりである。
傘色：茶褐色形 ：円形で肉厚鱗皮：繊維状ひだ：密柄色：肌色【００３２】１）ポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ，Ｄｉｆｃｏ）における生育状態温度２５℃での菌糸成長は４．５ｍｍ／１日、菌糸は白色で放射状に伸びる。裏面は一様で変色はない。
【００３３】２）グルコース・麦芽エキス・酵母エキス寒天培地（ＧＭＹ、１％グルコース、１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス）における生育状態。
温度２５℃での菌糸成長は３．５ｍｍ／１日、菌糸は白色で放射状に伸びる。裏面は一様で変色はない。
【００３４】３）フェノールオキシダーゼ検定用培地没食子酸０．１％添加により裏面が褐色になり、白色腐朽菌の特徴を示す。
【００３５】４）最適生育温度ならびに各温度における生育速度ＧＭＹ寒天培地で予め前培養した菌糸をコルクボーラーで打ち抜き、ＰＤＡ培地およびＧＭＹ培地に接種して３日間培養したのち、温度勾配培養装置を使用して各温度で５日間培養し、その間の菌糸伸長を測定した。その結果、温度１５〜３０℃の範囲で良く生育し、最適の温度は、温度２５〜２６℃であった。
【００３６】５）最適生育ｐＨ各ｐＨに調整したＧＭＹ液体培地に、コルクポーラーで打ち抜いた菌糸片を接種し、温度２５℃で３０日間培養した。集菌後、乾燥重量から最適ｐＨは４〜５付近で、生育範囲は４〜７であった。
【００３７】６）ＤＮＡによる菌株識別液体培地（グルコース１％、マルツエキス１％、酵母エキス０．４％）で培養し、凍結乾燥して粉末化した５０〜１００ｍｇの菌糸を、１．５ｍｌ遠心チューブに入れ、約０．１ｍｌの抽出用緩衝液（１％ＳＤＳを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液：pＨ＝８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、以下ＴＥという。）を加え、同量のフェノール／クロロフォルム混合液（１：１）を加えて混合し、１２，０００回転で遠心分離したのち、下層は捨て、上層の液を回収して２．５倍量のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールでよく洗浄した後、ＴＥに溶かし、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ ２０μｇ／ｍｌ）処理してフェノールで蛋白を除去した。
【００３８】このようにして調整したＤＮＡは、２５ｎｇ／μｌ濃度になるように希釈した（参照：Ａｎｎｅ R．Ｋｕｂｅｌｉｃ、Ｌｅｓ Ｊ．Ｓｚａｂｏ、ＣｕｒｒＧｅｎｅｔ（１９９５）２８、３８４−３８９）。
【００３９】ＰＣＲ法によるＤＮＡの増殖には、株式会社サワデーテクノロジーの「Ｓｕｐｅｒ Ｔａｑ Ｐｒｅｍｉｘ」に、鋳型となる菌糸のＤＮＡを２０ｎｇと、０．４μＭプライマーを加え（反応液量２５μｌ）、パーキンエルマー アプライド バイオシステムス（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の「ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００」でＤＮＡを増殖した。
【００４０】増幅条件（ＰＣＲ）は、以下のとおりである。また、ＰＡＰＤ法（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）には、オペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）社製のＯＰＡ−０４（５’−ＡＡＴＣＧＧＧＣＴＧ）をプライマーにして、また、リボゾームＲＮＡ遺伝子の非翻訳領域（Ｉｎｔｅｒ Ｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ；以下、「ＩＧＲ２」と略す。）の一部（上流側５’−ＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＣＣＴＴ、下流側（５’−ＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧ）を、プライマーにしてＤＮＡを増殖した。
【００４１】＜ＲＡＰＤ法＞（温度９４℃× ５min）１cycle（（温度９４℃× １min）＋（温度３６℃× １min）＋（温度７２℃× ４min））４５cycle（温度７２℃×１０min）１cycle【００４２】＜ＩＧＲ２法＞（温度９４℃× ５min）１cycle（（温度９４℃× １min）＋（温度５５℃× １min）＋（温度７２℃×２．５min））３０cycle（温度７２℃× ５min）１cycle【００４３】増幅産物は１．５％寒天ゲルで泳動し、エチヂウムブロミドで染色した。その結果、ＯＰＡ−０４をプライマーにして、ＲＡＰＤ法では、０．４，０．６５，１．０５ｋｂの３本の増幅ＤＮＡ断片（図１参照）が、ＩＧＲ法では、１．１，０．８８，０．６４ｋｂの３本の増幅ＤＮＡ断片（図２参照）が検出されたが、その電気泳動パターンで、いずれも既存のシイタケ栽培種とも、識別が可能であった。
【００４４】７）子実体形成における最適温度ブナとコーンブランを重量比４：１で混合し、水分を６５％に調整した１．３ｋｇの菌床を１２０日間培養（温度２２〜２３℃）したのち、温度１０〜２８℃の条件下で子実体を発生させたところ、その結果、いずれの範囲でも初回の発生で５７〜２０４ｇの子実体を発生し、適応温度は広い特性を有していた。
【００４５】＜培養例１＞ブナとコーンブランを重量比４：１で混合し、水分を６５％に調整した培地をプラスチック製の培養袋に１．３ｋｇ詰め込み、温度１２１℃で９０分間殺菌したのち、培地に菌株Ｈ４４を接種した。比較のため、従来菌を同時に接種し、接種後は温度２２〜２３℃、湿度７０％の条件下で９０〜１２０日間培養した。その後、培養袋を取り除き温度１７℃、湿度９０％、明条件下で子実体を発生させた。その結果を表１に示す。
【００４６】表１から明らかなように、初回の子実体体発生量は１３５ｇ／１．３ｋｇ菌床で、エリタデニン含量は２１４ｍｇ／１００ｇＤＷと、従来品に比べ約２．４倍であった。
【００４７】
【表１】
【００４８】＜培養例２＞また、空調発生室の温度を、温度１７℃、温度２５℃、温度２８℃及び温度３０℃として栽培試験を行い、子実体を発生させ、その子実体中のエリタデニン含量を測定したところ、表２に示されるように、子実体生育時の温度が高いほど、その値は高くなり、温度３０℃では３９３ｍｇ／１００ｇＤＷで、温度１７℃で栽培した子実体の約２倍の含量であった。
【００４９】
【表２】
【００５０】＜培養例３＞培養例２において、子実体生育時の温度が高いほど、子実体中のエリタデニン含量が多くなることが見出されたため、栽培品種として市販されている菌株（森産業株式会社「活活」）について、温度１７℃で子実体原基を形成させた後、空調発生室の温度を、温度１７℃、温度２５℃、温度２８℃、温度３０℃、温度３２℃及び温度３５℃として、子実体を生育させ、その子実体中のエリタデニン含量を測定したところ、表２に示されるように、温度が高くなるに伴い含量も高くなり、子実体生育の上限温度３２℃で最高に達し、その時の含量は１７℃で栽培した子実体の約６．２倍であった。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【発明の効果】この発明で得られるシイタケ子実体は、コレステロール低下作用をもつエリタデニンを多く含み、なおかつ収量性がきわめて良好で、滋養食品として、さらには健康食品素材として、新規需要が期待されるという優れた効果を奏するものである。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９５０９３９８０
【氏名又は名称】鈴木 重幸
【識別番号】３９００３９９６３
【氏名又は名称】森産業株式会社
【識別番号】５９６１１１６９０
【氏名又は名称】財団法人日本きのこ研究所
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| 【出願日】 |
平成１３年２月１４日（２００１．２．１４） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６９９０３
【弁理士】
【氏名又は名称】幸田 全弘
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| 【公開番号】 |
特開２００２−２３８３５０（Ｐ２００２−２３８３５０Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１４年８月２７日（２００２．８．２７） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−３７０２０（Ｐ２００１−３７０２０） |
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