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【発明の名称】 植物生育促進能及び植物病害防除能を有する微生物
【発明者】 【氏名】小幡 斉

【氏名】河原 秀久

【氏名】阪本 雅之

【氏名】高原 吉幸

【氏名】渡辺 正弘

【氏名】坪内 正之

【氏名】長井 克将
【要約】 【課題】ナス科植物に対し生育促進能を有し、かつシュードモナス・ソラナセアラムを病原菌とする青枯病に対して高い防除能を有する細菌を提供する。

【解決手段】ＡＣＣ（１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸）資化能またはインドール酢酸生産能を有するシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌、およびそれをナス科植物に接種すること。
【特許請求の範囲】
【請求項１】ＡＣＣ（１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸）資化能またはインドール酢酸生産能を有するシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌をナス科植物に接種することを含んでなるナス科植物の栽培方法。
【請求項２】ＡＣＣ（１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸）資化能またはインドール酢酸生産能を有するシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌がＫ５Ａ菌株である請求項１記載のナス科植物の栽培方法。
【請求項３】ＡＣＣ（１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸）資化能を有するシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌。
【請求項４】インドール酢酸生産能を有するシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌。
【請求項５】シュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｋ５Ａ菌株。
【請求項６】請求項１または２に記載のシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌を有効成分として含んでなる微生物農薬。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物生育能を有し、ナス科植物青枯病に対する拮抗能を有する学名シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌に関し、より詳しくは該細菌に属する新菌株、およびこの菌株を生きたままナス科植物に接種してシュードモナス・ソラナセアラムによるナス科植物の青枯病を防除する方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】従来よりシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に属する細菌は、トマトやナス、ピーマンなどのナス科作物に甚大な病害を生じることが知られている。
【０００３】シュードモナス・ソラナセアラムによるナス科植物青枯病は、細菌性土壌病害として知られており、ナス科作物に多大な損害を与えているにもかかわらず、有効かつ安全な防除方法があまりないのが現状である。従来の青枯病など土壌病害に対する防除方法としては、例えば、クロルピクリンや臭化メチルなどによる土壌消毒方法があるが、この方法には、土壌中の有用な微生物や昆虫をも殺してしまうなどの環境上の問題や、臭気があること、それゆえ、人家の近くでは使用が制限されるなどの問題がある。また、一旦滅菌した後に病原菌が侵入した場合、かえって病気が進行してしまうという懸念をも抱えている。臭化メチルは環境上の理由から、使用が禁止もしくは制限される方向にある。
【０００４】また、細菌病全般に対する防除方法としては、例えば、硫酸銅剤、塩基性塩化銅など銅剤やストレプトマイシン等の抗生物質があるが、効果が充分でない上に、使用条件によっては薬害や葉の汚れの恐れがある。また、有用な微生物をも殺してしまうなどの環境上の問題がある。さらに土壌への散布は効果的ではない。次いで、微生物を防除に用いる方法が近年、研究されている。シュードモナス属細菌を用いて植物病害を防除する方法は、いくつか見出され、特許出願されている。例えば、ナス科植物の青枯病（特開平６−９３２５号公報、特開平６−８６６６８号公報、特公平６−１７２９１号公報、特開平７−１６５５２３号公報、特公平８−１５４２８号公報）、イネ苗立枯病（特開平４−１０４７８３号公報）、ポトリチス属およびペニシリウム属の植物病原菌に起因する植物病害（特開平４−７７４０５号公報）、グラム陽性細菌起因の植物病害（特開平５−３１０５２１号公報）、フザリウム属菌に起因する植物病害（特公平６−６５２３号公報）などをシュードモナス属細菌により防除することができることが報告されている。しかし、その防除効果は、未だ満足すべきものではない。
【０００５】微生物によるナス科植物の青枯病（特開平６−９３２５号公報、特開平６−８６６６８号公報、特公平６−１７２９１号公報、特開平７−１６５５２３号公報、特公平８−１５４２８号公報）防除方法に関して、その有効成分菌としては、シュードモナス・フルオレスセンス、シュードモナス・グラディオリ、シュードモナス・フルオレスセンスとカニ殻の混合物、弱病原性のシュードモナス・ソラナセアラム、弱病原性シュードモナス・ソラナシアラムとファージの混合物等が提案されており、本発明のシュードモナス属アルカリゲネスの適用は従来知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ナス科植物に対し生育促進能を有し、かつシュードモナス・ソラナセアラムを病原菌とする青枯病に対して高い防除能を有する細菌およびその細菌を有効成分とする微生物農薬を提供し、さらに、その細菌により土壌および／または植物を処理してナス科植物の生長を促進し、かつ植物細菌病を防除する栽培方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、シュードモナス属細菌に属するシュードモナス・アルカリゲネシス Ｋ５Ａ菌株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）がナス科植物の生育促進能を有し、かつナス科植物の主要な細菌病である青枯病を効果的に防除することを見出し、本発明に至った。
【０００８】すなわち、本発明は、ＡＣＣ（１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸）資化能またはインドール酢酸生産能を有するシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌、特にシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌Ｋ５Ａをナス科植物に接種することを含んでなるナス科植物の栽培方法であり、さらに該細菌、該菌株並びにこれらを有効成分として含んでなる微生物農薬である。該栽培方法は、ナス科植物の生育を促進させる栽培方法であり、または青枯病を防除する栽培方法である。本発明で使用する細菌は、また、植物病害、特に青枯病の病原細菌シュードモナス・ソラナセアラムに対して抗菌性を有し防除能を有する微生物であり、植物、特にナス科植物の生育促進能を有する微生物である。
【０００９】本発明のシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌およびシュードモナス属アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌Ｋ５Ａ菌株はＡＣＣ（１アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸）資化能またはインドール酢酸（ＩＡＡ）生産能を有し、かつ植物病原細菌シュードモナス・ソラナセアラムに対して抗菌性を有する。そして、これらの細菌を植物に接種することでナス科植物の生育を促進させ、青枯病を防除することができる。
【００１０】ＡＣＣ分解酵素を有する微生物は、植物のエチレン生合成の中間体であるＡＣＣを分解し、植物によって生産されるエチレン濃度を下げることによって、植物の老化を遅らせることができる。また、インドール酢酸は植物ホルモンとして考えられ、この物質の生産能をもつ微生物は植物生長を促すことが知られている。これらの性質を有する菌株を接種することにより植物を健全に育苗することができる。さらに、ＡＣＣ分解酵素生産能を有する微生物は、植物に対する優位性のために、植物根への長期の定着が期待できる。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】まず、以下に本発明の菌株の採取方法について述べる。
【００１３】種々の植物体の中からＡＣＣ（１アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸）資化能を有する微生物を採取するために、ＡＣＣを唯一の窒素源とする栄養寒天培地（ＡＣＣ培地と略す。組成：ＡＣＣ；２５０ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４；４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４；６ｇ，ＭｇＳＯ4・Ｈ２Ｏ；０．２ｇ、グルコース；２ｇ、グルコン酸２ｇ、クエン酸２ｇ、ＦｅＳＯ４；１ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３；１０μｇ，ＺｎＳＯ４；７０μｇ、ＣｕＳＯ４；２０μｇ、ＭｏＯ３；１０μｇ、ｐＨ７．０、水１Ｌ）に植物根の破砕液を塗布し、本培地に生育する菌を選抜し、ＡＣＣ分解酵素活性及びインドール酢酸生産能を測定した。ＡＣＣ分解酵素活性とインドール酢酸生産能を併せ持つ細菌並びにどちらかの能力を有する菌株をナス及びトマトに処理したところ、生育促進能を有する複数の菌株が得られた。次にこれらの菌株をナス及びトマトの青枯病のポット試験に供し、青枯病防除能を調べた。また、これらの菌株のうちナス科植物への生育促進能を有する菌株の中で、著しく青枯病を防除する菌株が得られた。本菌株は、青枯病の病原細菌であるシュードモナス・ソラナセアラムに対し、寒天培地上で抗菌活性を有していた。
【００１４】得られた細菌の菌学的性質は、以下の通りである。
（１）形態学的性質形状 ：桿状グラム染色 ：陰性運動性 ：＋胞子形成 ：−（２）コロニー形状肉汁寒天平板培養において平滑円形コロニー（３）生理学的性質細胞内黄色色素産生 ：＋カタラーゼ分解 ：＋オキシダーゼ ：＋ＯＦテスト ：Ｏ酸素に対する態度 ：通性嫌気的糖、有機酸の資化性Ｄ−グルコース ：＋Ｄ−マルトース ：−Ｄ−アラビノース：＋Ｌ−ラムノース ：−Ｄ−マンノース ：＋Ｄ−マンニト−ル：−セロビオース ：−アドニトール ：−Ｄ−ガラクトース：−Ｄ−ラフィノース：−Ｄ−メリビオース：−シュークロース ：−ソルビトール ：−トレハロース ：−Ｌ−ヒスチジン ：＋Ｄ−アラニン ：−Ｌ−セリン ：＋γ−アミノ酪酸 ：＋メチルピルビン酸：＋Ｄ−グルコン酸 ：＋β-ヒドロキシブチル酸 ：＋クエン酸の利用 ：＋【００１５】なお、得られた菌株について１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列分析を行ったところ、最も近縁とされる種は、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）であった。
【００１６】なお、上記の菌学的性質を有する菌株を、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティツク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），第１巻、１９８４年」に基づき検索すると、グラム陰性桿菌であること、好気的に生育すること、オキシダーゼ活性が陽性であることなどの性質より、本菌株は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するものであり、さらに１６ｓ−ｒＲＮＡで同定されたシュードモナス・アルカリゲネスと矛盾がない。
【００１７】したがって、得られた菌株はシュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ菌株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）と命名し、平成１３年１月２４日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１８１８０（生技研菌寄Ｐ−１８１８０）として受託されている。
【００１８】次に、本発明の内容について述べる。
【００１９】まず、上記の本発明のシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細菌を適当な培地で培養する。ここで使用する培地は、菌株が増殖するものであれば特に限定されるものではなく、通常使用されている培地を使用すればよい。培養して菌株を増殖させた後、遠心分離もしくは膜濃縮により集菌を行い、保護剤と混合し、凍結乾燥した後、本菌株を含む粉状もしくは粒状の微生物農薬として作成することができる。保護剤としては、グルコース、フルクトース、シュークロースおよびトレハロースなどの糖類の１つもしくは複数の混合物を用いることができる。
【００２０】一方、本発明のシュードモナス・アルカリゲネシス細菌を同様に培養後、しかるべき担体と混合し、粉剤もしくは粒剤とすることもできる。この場合の担体には、タルク、クレー、炭酸カルシウム、ケイソウ土などの鉱物性粉末や、ピートモス、さらには、ポリビニルアルコールなどの高分子化合物、ザンサンゴムやアルギン酸などの天然高分子化合物などがある。菌体の濃度は、液剤の場合は、１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上とする。固体（水和剤、粉剤）の場合は、１０５ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１０７ｃｆｕ／ｇ以上とする。
【００２１】次に本発明のシュードモナス・アルカリゲネス細菌を有効成分とする微生物農薬の使用方法を述べる。
【００２２】本発明のシュードモナス・アルカリゲネシス細菌は、トマトやナスなどのナス科作物の根に存在することにより、植物生育促進効果を示す。したがって、水に懸濁させ、種子または苗の根部を本菌液に浸漬することにより植物体に定着させることが可能となり、生育促進効果を発揮するとともに、シュードモナス・ソラナセアラムによるナス科植物青枯病を防除することができる。また、育苗期間中に根部へ灌注することによっても目的を達成する事ができる。本発明の細菌を上記方法で使用する場合、浸漬処理または土壌かん注処理の場合は、浸漬液中の菌濃度が１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上になるように調整する。用土あるいは覆土に土壌混和する場合は、培養土１Ｌに対して本防除剤を１ｇ以上混合し、均一になるように撹拌する。また、浸種時に本防除剤希釈液に種を浸漬処理する場合の希釈液の温度は、１５℃〜３５℃、好ましくは２０℃〜３０℃であり、瞬時〜４８時間、より好ましくは１時間〜２４時間処理をする。苗の根を浸漬処理する場合の希釈液の温度は、１５℃〜３５℃、好ましくは２０℃〜３０℃であり、処理時間は瞬時〜２４時間、より好ましくは１時間〜２４時間処理をする。
【００２３】このように本菌株を有効成分とする微生物農薬による簡単な処理方法により、シュードモナス・ソラナセアラムによる青枯病を防除することが可能となった。
【００２４】以下、本発明の実施の形態を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】［実施例１］シュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｒｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）のシュードモナス・ソラナセアラムに対する抗菌性を測定した。ＤＦ寒天培地上での対峙培養法で抗菌性を調べた。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】

【００２７】［実施例２］ＡＣＣ分解酵素活性は以下のように測定した。まず、シュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ菌株を３ｍＭのＡＣＣを含むＭ９寒天培地（ｐＨ７．２）２ｍｌに植菌し３０℃で培養した。菌体培養液を超音波破砕を行った後、遠心分離した上澄みのタンパク質量を測定した。０．０２ｍｌのサンプルに０．１Ｍトリスアミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）を０．１８ｍｌ加え、さらに最終ＡＣＣ濃度を５０ｍＭにして３０℃、２．５時間振とうした。その後、０．５６Ｎ塩酸を１．８ｍｌ加えて反応を止めた後、０．１％２，４−Ｄを０．３ｍｌ加えて３０℃で１５分間振とうした。さらに２Ｎ水酸化ナトリウムを２ｍｌ加えた後に５４０ｎｍの吸光度を測定した。これらの条件下で１分間に１μｍｏｌのα−ケト酪酸を形成する活性を１Ｕとした。インドール酢酸生産活性測定は、通常行われる比色定量法を用いた。シュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ菌株のＡＣＣ分解酵素活性は、１．６７Ｕ／ｍｇであり、インドール酢酸生産能は４０μｇ／ｍｌであった。
【００２８】［実施例３］ナス（品種黒陽）種子を、シュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）の１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ希釈液に２５℃にて２４時間浸漬して、育苗箱に播種した。３週間後に生育調査を行った。無処理区と比較した。表２に結果を示す。平均葉径が生育促進能の目安である１０％を超える増大を示しており、生育促進効果の大きいことがわかった。
【００２９】
【表２】

【００３０】［実施例４］トマト（品種桃太郎）種子を、シュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｉｓ Ｋ５Ａ）の１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ希釈液に２５℃にて２４時間浸漬して、育苗箱に播種した。３週間後に生育調査を行った。無処理区と比較した。表３に結果を示す。平均茎高が生育促進能の目安である１０％を超える増大を示しており、生育促進効果の大きいことがわかった。
【００３１】
【表３】

【００３２】［実施例５］育苗箱で栽培したナス（品種黒陽）の根を、シュードモナス・アルカリゲネスＫ５Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）の１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ希釈液に２０分間浸漬して、１５ｃｍのビニールポットに移植した。３日後に病原菌シュードモナス・ソラナセアラム Ｎｏ．１株を、菌密度１×１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度でポット当たり２０ｍｌを灌注した。その後、４週間後に発病調査した。病原菌のみの無処理区と比較した。表４に結果を示す。防除価は、９２．９％であった。
【００３３】
【表４】

【００３４】［実施例６］育苗箱で栽培したナス（品種黒陽）に、シュードモナス・アルカリゲネスＫ５Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）の１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ希釈液を苗当たり１０ｍｌずつ灌注し、２４時間後に１５ｃｍのビニールポットに移植した。３日後に病原菌シュードモナス・ソラナセアラムＮｏ．１株を、菌密度１×１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度でポット当たり２０ｍｌを灌注した。その後、４週間後に発病調査した。病原菌のみの無処理区と比較した。表５に結果を示す。防除価は、７３．７％であった。
【００３５】
【表５】

【００３６】［実施例７］育苗箱で栽培したトマト（品種桃太郎）の根を、シュードモナス・アルカリゲネス Ｋ５Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｋ５Ａ）の１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ希釈液に２０分間浸漬して、１５ｃｍのビニールポットに移植した。３日後に病原菌シュードモナス・ソラナセアラム Ｎｏ．１株を、菌密度１×１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度でポット当たり２０ｍｌを灌注した。その後、４週間後に発病調査した。病原菌のみの無処理区と比較した。表６に結果を示す。防除価は、９０．０％であった。
【００３７】
【表６】

【００３８】
【発明の効果】本発明は、薬害がない安全な所謂生物防除策であって、植物細菌病であるシュードモナス・ソラナセアラムによる病害を効果的に防除することが可能であるという効果を奏する。
【出願人】 【識別番号】３９９０３００６０
【氏名又は名称】学校法人 関西大学
【識別番号】０００００２２００
【氏名又は名称】セントラル硝子株式会社
【出願日】 平成１３年２月８日（２００１．２．８）
【代理人】 【識別番号】１００１０８６７１
【弁理士】
【氏名又は名称】西 義之
【公開番号】 特開２００２−２３３２４６（Ｐ２００２−２３３２４６Ａ）
【公開日】 平成１４年８月２０日（２００２．８．２０）
【出願番号】 特願２００１−３２８１２（Ｐ２００１−３２８１２）