海水中の同化可能有機炭素測定方法

トップ :: G 物理学 :: G01 測定;試験

【発明の名称】	海水中の同化可能有機炭素測定方法
【発明者】	【氏名】中沖優一郎【氏名】木村拓平
【要約】	【課題】海水中の同化可能有機炭素測定方法を提供する。【解決手段】海水中に存在する細菌を混在状態で培養し、その最大増殖数をコロニー数またはアデノシン三リン酸を指標として測定する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】海水中で微生物を増殖させた後、微生物の最大増殖数を測定することを特徴とする海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項２】海水中に存在する微生物を単離せずに使用することを特徴とする請求項１記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項３】海水中で微生物を増殖させる期間が一週間以内であることを特徴とする請求項１または２に記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項４】海水中で微生物を増殖させる時に温度を１５℃から３０℃の間に保つことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項５】海水にリンまたは窒素のいずれか、あるいは両方を添加することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項６】酸を添加した海水と、アルカリと、酸を添加していない海水を混合し、該海水中で微生物を増殖させることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項７】生菌数を測定しその最大値を指標として、微生物の最大増殖数を測定することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項８】アデノシン三リン酸を測定しその最大値を指標として、微生物の最大増殖数を測定することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項９】アデノシン三リン酸の測定にルシフェラーゼを使用することを特徴とする請求項８記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項１０】海水を濃縮した後、アデノシン三リン酸を測定することを特徴とする請求項８または９に記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項１１】微生物を塩濃度が３．５％から０％の間のいずれかの溶液で洗浄した後、アデノシン三リン酸を測定することを特徴とする請求項８から１０のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
【請求項１２】微生物の洗浄に使用する溶液の塩濃度を３．５％から０％の間で段階的に低下させ、各塩濃度で一回以上洗浄することを特徴とする請求項８から１１のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。

【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、海水の微生物増加ポテンシャルの指標となる海水中の同化可能有機炭素の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】浄水の分野において水道水の配水管内での細菌二次増殖を抑制することは、水系病原微生物の発現や配水管の腐食を防止するうえで重要であり、現在は主に残留塩素濃度によって管理されている。しかし過剰な塩素の添加はトリハロメタン等の生成を引き起こすこと、また配水管内に一度バイオフィルムが生成されてしまうと塩素では有効に処理できないことから、欧米では残留塩素濃度を削減し、同時に水道水中の微生物増殖を引き起こす栄養源を除去することが重要と考えられるようになってきた。
【０００３】このような水道水中の微生物増殖ポテンシャルを評価する方法として、水道水中に含有する微量の生物易分解性有機物を定量する手法が提案されている。同化可能有機炭素（ＡｓｓｉｍｉｌａｂｌｅＯｒｇａｎｉｃＣａｒｂｏｎ、以下ＡＯＣと略する）定量方法（ｖａｎｄｅｒＫｏｏｉｊＤ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｗａｔ．Ｗｋｓ．Ａｓｓｏｃ．７４，５４０～５４５（１９８２）、ｖａｎｄｅｒＫｏｏｉｊＤ．，ｅｔａｌ，Ｗａｔ．Ｒｅｓ．２９，１６５５～１６６２（１９９５））では、試料中で微生物を増殖させ、その最大増殖数から微生物が分解可能な有機炭素量を推定する。この方法では、試料中に二種類の純粋培養した微生物を接種し、培養中の最大増殖コロニー数と各微生物の増殖収率からＡＯＣに相当する酢酸濃度に換算してあらわす。実際に増殖した微生物数をパラメーターとするため、細菌の増殖ポテンシャルを適切に表現しうるきわめて有効な指標である。
【０００４】水道水中のＡＯＣ測定における問題点として、コロニー数の測定に通常数日かかり、結果がすぐに得られないことがあげられる。これに対しては、コロニー数を測定する代わりに細胞内のアデノシン三リン酸をルシフェラーゼを用いて定量して微生物数に換算することにより、迅速に最大増殖コロニー数を測定する方法も報告されている。
【０００５】水道水中に含有する微量の生物易分解性有機物の定量方法には、他に生物分解性溶存有機炭素（ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＤｉｓｓｏｌｖｅｄＯｒｇａｎｉｃＣａｒｂｏｎ、以下ＢＤＯＣと略する）定量方法がある。これらには二つの測定方法が提案されている（ＰｉｅｒｒｅＳｅｒｖａｉｓ，ｅｔａｌ，Ｗａｔ．Ｒｅｓ．，２１（４），４４５～４５０（１９８７））。一つは、フィルター除菌した試料に同起源の試料を細菌が混在したまま植菌して培養し、培養前後の溶存有機炭素（ＤＯＣ）の減少量を微生物が分解可能な有機炭素量とする方法である。この方法ではＤＯＣの経時変化を測定値が一定となるまで測定して培養開始時のＤＯＣ測定値から最後に定常となったＤＯＣ測定値を引いたものを、微生物が分解した溶存有機炭素量、すなわちＢＤＯＣとする。ＢＤＯＣを測定する別の方法は、水道水試料内で増殖した微生物の総重量からＢＤＯＣを推定する方法である。この方法では、フィルター除菌した試料に同起源の試料を微生物が混在したまま植菌、さらにトリチウムでラベルされたチミジンを添加して培養する。微生物は一度増加した後死滅していくので、その間の微生物のＤＮＡの放射線量合計から死滅した微生物の総重量が推定できる。この総重量からＢＤＯＣを換算する。しかし、この方法は微生物ＤＮＡの調製をしなければならないこと、放射性物質を使用することのために簡便さに欠ける。
【０００６】一方、膜による分離技術においては、微生物増殖による装置内部の汚染が問題となることがあり、処理海水中でどの程度の微生物が増殖するのか予測する必要性が認識されてきている。
【０００７】しかし全有機炭素量や生菌数、全菌数などの測定による従来の水質指標では微生物による分離装置の汚染の発生を予測することは出来ない。また、ＡＯＣ定量方法は、使用する微生物が水道水中から単離したものであり、塩濃度が約３．５％と高い海水にそのまま適用することは難しい。さらにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）測定による迅速化も、使用するルシフェラーゼ活性が海水に含まれるイオンに阻害され、そのままでは測定することが出来ない。ＢＤＯＣ定量方法は、全有機炭素（ＴＯＣ）計を用いる方法では、海水のようにＤＯＣがＴＯＣ計の感度限界と比べて低い試料には適用は難しい。さらに海水は塩濃度が高いためにＴＯＣ計内部の触媒や配管への負荷が大きく、装置メンテナンスのためのコストがかかってしまう問題がある。水道水試料内で増殖した微生物の総重量からＢＤＯＣを推定する方法では、本発明者らが放射性物質を添加せずに海水で同様の方法を用いて微生物を培養し生菌数の経時変化を測定したところ、長期間の培養では無機栄養細菌と考えられる微生物の増殖により生菌数が増加し続け、死滅していくことはなかったので、海水への適用は難しいと考えられた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、膜による分離装置など、微生物による汚染が問題となる装置において、装置に供給される海水中でどの程度の微生物が増殖するのか予測するために、微生物増殖ポテンシャルの指標として海水中の同化可能有機炭素量を測定する方法について鋭意検討した結果、海水試料中に含まれる細菌を混在状態で培養し、コロニー数またはアデノシン三リン酸でその最大増殖数を測定することで、海水中の同化可能有機炭素を簡便に測定することができることを見出し、本発明に到達したものである。
【０００９】したがって、本発明の目的は、海水中の微生物増殖ポテンシャルの評価が可能な海水中の同化可能有機炭素の測定方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記本発明の目的は下記の構成により達成される。すなわち、本発明は、（１）海水中で微生物を増殖させた後、微生物の最大増殖数を測定することを特徴とする海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（２）海水中に存在する微生物を単離せずに使用することを特徴とする前記（１）記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（３）海水中で微生物を増殖させる期間が一週間以内であることを特徴とする前記（１）または（２）に記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（４）海水中で微生物を増殖させる時に温度を１５℃から３０℃の間に保つことを特徴とする前記（１）から（３）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（５）海水にリンまたは窒素のいずれか、あるいは両方を添加することを特徴とする前記（１）から（４）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（６）酸を添加した海水と、アルカリと、酸を添加していない海水を混合し、該海水中で微生物を増殖させることを特徴とする前記（１）から（５）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（７）生菌数を測定しその最大値を指標として、微生物の最大増殖数を測定することを特徴とする前記（１）から（６）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（８）アデノシン三リン酸を測定しその最大値を指標として、微生物の最大増殖数を測定することを特徴とする前記（１）から（６）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（９）アデノシン三リン酸の測定にルシフェラーゼを使用することを特徴とする前記（８）記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（１０）海水を濃縮した後、アデノシン三リン酸を測定することを特徴とする前記（８）または（９）に記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（１１）微生物を塩濃度が３．５％から０％の間のいずれかの溶液で洗浄した後、アデノシン三リン酸を測定することを特徴とする前記（８）から（１０）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。
（１２）微生物の洗浄に使用する溶液の塩濃度を３．５％から０％の間で段階的に低下させ、各塩濃度で一回以上洗浄することを特徴とする前記（８）から（１１）のいずれかに記載の海水中の同化可能有機炭素測定方法。からなるものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】本発明では、海水中でどの程度の微生物が増殖するのか予測するために、海水中の微生物増殖ポテンシャルの指標として、従来の方法では測定困難な同化可能有機炭素（ＡｓｓｉｍｉｌａｂｌｅＯｒｇａｎｉｃＣａｒｂｏｎ、以下ＡＯＣと略する）の簡便な測定方法を確立することを目標とした。本発明を要約すれば、殺菌した海水試料に、殺菌を行っていない海水試料を少量添加することで、該海水試料で微生物を混在状態で増殖させ、それら微生物の生菌数またはアデノシン三リン酸を測定しその最大値を指標として、最大増殖数を測定することで達成される。
【００１３】本発明は、海水の他、塩濃度の高い廃水、人工海水などに適用することができる。ＡＯＣを測定する試料の採取や取り扱いには、有機炭素の混入を防ぐためにガラス製の容器を用いることが好ましい。また使用するガラス容器からの極微量の有機炭素の混入を避けるために、アルカリ洗剤等であらかじめよく洗浄しておくか、購入直後のガラス容器を使用することが好ましい。
【００１４】試料中で増殖させる微生物としては、海水などから単離した微生物や、微生物を混在状態で含んだ試料そのものを用いることができる。単離した微生物を用いる場合には、海水などに含まれる微生物の中から、多くの種類の有機炭素を資化でき、かつＡＯＣに比例した最大増殖数を与えるものを単離して用いるのが好ましいが、そのような微生物を単離するまでには通常時間がかかるうえ、試料によっては有機炭素の種類に違いがあるため正確にＡＯＣを測定できない恐れがある。一方、試料中には通常、該試料に含有される様々な有機炭素を資化可能な微生物群が存在するので、試料中でこれらの微生物群を増殖させることにより試料中のＡＯＣを測定することができる。ＡＯＣを測定する試料と、試料中で増殖させる微生物を含む試料は、同一箇所で同時に採取されたものであることが好ましいが、入手が難しい場合には、同一箇所で異なる時期に採取された試料同士など、条件がほぼ一致している試料同士の組み合わせでも測定を行うことは可能である。
【００１５】採取した試料はすぐ測定に使用するか、より好ましくは殺菌処理をした後、殺菌していない試料を０．０１％から２０％、より好ましくは１％から５％の範囲になるように植菌してから培養するのが好ましい。植菌量が少なければ微生物の増殖が遅くなるため正常な微生物増殖曲線が得られず、正確にＡＯＣが測定できない。植菌量が多ければ、殺菌していない試料では微生物によりＡＯＣが変化しているので、その影響を受けて正確にＡＯＣが測定できない。
【００１６】試料の殺菌方法としては、酸を添加するか、または加温する方法が好ましいが、殺菌方法はこれに限定されない。酸を添加して殺菌した場合には、試料中で微生物を培養する前にアルカリでｐＨをもとの試料のｐＨ付近に調整し、加温して殺菌した場合には室温付近まで放冷することが好ましい。酸を添加する場合にはｐＨ４以下、より好ましくはｐＨ２．６以下に調整する。これより高いｐＨであると耐酸性菌が増殖して試料中のＡＯＣが測定前に変化する恐れがあるためである。例えば、酸として硫酸を用いる場合にはｐＨを充分に下げるために、１２０ｐｐｍ以上、より好ましくは２５０ｐｐｍ以上になるように添加する。添加する酸はリン酸や硝酸、酢酸のような微生物の栄養源となるものは好ましくない。加温する場合には、６０℃付近で３０分程度加温するのが好ましい。６０℃より低い温度では殺菌率が充分ではなく、６０℃より高い温度では死滅した微生物の死骸によりＡＯＣが増加する恐れがある。
【００１７】試料を採取してすぐに測定を開始することが出来ない場合には、試料中での微生物の増殖を抑えるために酸を添加しておくのが好ましい。酸は殺菌で使用する条件が好適に用いられる。試料を保存する温度は、低すぎて凍結してしまうと微生物の細胞壁が破壊され易分解性物質を放出するためＡＯＣが増加してしまい、また温度が高ければ耐酸性の微生物が増殖してしまう恐れがある。このため、４℃付近で保存することが好ましい。また、これらの条件内であっても、試料中に微量に含まれる耐酸性の好冷菌が増殖する恐れがあるため、採取してからできるだけ早く測定に使用することが好ましい。
【００１８】試料中で増殖させる微生物として、微生物を混在状態で含んだ試料を用いる場合、培養期間が長くなると無機栄養細菌が増殖し続け最大増殖数が測定できなくなる恐れがあるので、培養期間は一週間以内とすることが好ましい。
【００１９】一般に微生物の増殖には炭素：窒素：リンの比が１００：１０：１の割合の栄養源が必要となる。このため、試料の培養時には、試料に窒素やリンあるいは両方を添加してもよい。これらは硝酸ナトリウムやリン酸ナトリウムの溶液として添加することができる。また微生物の増殖速度を促進するために、試料に微量金属の混合液を添加してもよい。
【００２０】試料の調整やサンプリングは、外来の微生物の混入を防ぐため、クリーンベンチや空気の動きの少ない清浄な部屋の中で行うことが好ましい。培養温度は、試料の取得時の温度にあわせ、１５℃から３０℃であることが好ましく、より好ましくは２０℃から２５℃で培養するのがよい。これより低い温度であると好冷菌が、これより高い温度であると一般細菌が増殖し、正確に試料中の微生物の最大増殖数が測定できなくなることがある。培養は藻類の増殖を防ぐため、暗所で行うことが好ましい。最大増殖数は、生菌数または菌体内アデノシン三リン酸濃度を定量することで測定することが好ましい。
【００２１】試料として海水を測定する場合、海水中の微生物は貧栄養環境で生育し、富栄養状態ではかえって生育が阻害されることがあるため、海水中の微生物用に調製された寒天培地、例えばＭａｒｉｎｅＢｒｏｗｔｈ２２１６、Ａｎｄｅｒｓｏｎ培地、Ｊｏｎｓｏｎ培地などに塗布して生菌数を計数することが好ましい。この他に菌数の測定方法としては、検鏡による全菌数測定やメンブレンフィルター上に微生物を捕捉して計数する方法などを用いることもできる。
【００２２】アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと略す）の測定方法としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ等の発光試薬を加えて発光反応を起こし、この際に発光計測を行ってＡＴＰ濃度を測定する方法が好ましい。発光試薬などは調製してもよいが、市販の測定器と試薬キットをそのまま流用することができる。しかし海水中の微生物数は、最大増殖時でもＡＴＰを定量するには少なく、また塩濃度が高いため、メンブレンフィルター等のろ過材で海水中の微生物を捕捉した後、塩濃度が低い溶液で洗浄することが好ましい。ろ過材の孔径は、微生物を捕捉できるほど孔径が小さければよいが、あまり孔径が小さいと吸引ろ過を行ってもろ過効率が悪く、またろ過材の価格が高価となるため、孔径０．１から０．５μｍ程度、より好ましくは０．２から０．４５μｍ程度のものがよい。
【００２３】また微生物に由来しない遊離ＡＴＰを除去するために、微生物を捕捉する前や洗浄中にＡＴＰ分解酵素を添加することが好ましい。ＡＴＰ分解酵素としては、ＡＴＰをＡＤＰまたはＡＭＰに分解する酵素として知られている多数のＡＴＰ分解酵素、例えばアピラーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ケトヘキソキナーゼ、フルクトキナーゼ、またはガラクトキナーゼ等を使用することが出来る。ＡＴＰ分解酵素は、溶菌時に残存しているとＡＴＰ測定を阻害するため、遊離ＡＴＰを除去した後は微生物表面やろ過材などに残らないよう洗い流す。
【００２４】洗浄に使用する溶液は、コストや入手性などから食塩水を好適に用いることができる。また洗浄液には、ショ糖、グルコース、ラクトースなどの細胞保護剤をＡＴＰ測定を阻害しない程度の濃度で添加してもよい。ルシフェラーゼ活性は高塩濃度で阻害されるため、洗浄溶液の塩濃度は、海水の塩濃度である３．５％付近から段階的に０％付近まで下げるのが好ましい。塩濃度を急激に下げると洗浄の段階で溶菌しＡＴＰの収率が低下する。また塩濃度を早く低下させていくと同様に溶菌する原因となるため、塩濃度を変えて後１分以上、好ましくは５から１０分程度経過してから吸引ろ過等で洗浄液をろ過する。
【００２５】洗浄液はＡＴＰの混入を防ぐためにフィルター除菌と加熱滅菌処理の組み合わせ、または加熱滅菌処理を行うのが好ましい。例えば、１２１℃で１５分処理することによりＡＴＰの９６％を分解することが出来る。微生物からＡＴＰを抽出する抽出試薬としては市販の試薬キットを使用する他、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベンゼトニウム、セチルトリメチルアンモニウムクロライドなどの陽イオン性界面活性剤、トリクロロ酢酸などを調製しても好適に使用できる。これらのＡＴＰ抽出試薬は濃度が高いとＡＴＰの測定を阻害する場合があるので、適切な濃度となるように調製することが重要である。例えばトリクロロ酢酸を用いる場合には最終濃度を０．１％以下となるように調製するのが好ましい。ろ過材からのＡＴＰの回収は、ＡＴＰ測定を阻害しない溶液なら何を使用してもよいが、フィルター除菌と加熱滅菌処理の組み合わせ、または加熱滅菌処理を行った水を好適に使用できる。また、界面活性剤によるＡＴＰ測定の阻害を防ぐためにサイクロデキストリンまたはその誘導体を含んでいてもよい。
【００２６】本発明の海水中の同化可能有機炭素測定方法は、単に膜分離装置のみならず、膜分離装置を一部に含む水の分離システムにも適用できる。また水の分離システムに限らず、他の海水を用いる装置にも用いることが可能である。
【００２７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２８】実施例１二つの地点で採取した海水それぞれに硫酸を３００ｐｐｍとなるように添加してから移送した。以後の操作は全てクリーンベンチ内で行い、外来菌の混入を防いだ。各海水試料別にあらかじめ滅菌した平底試験管（２５ｍｍ－φ×１２０ｍｍ）に硫酸を添加した海水２５ｍｌを入れ、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８付近に中和した。さらに、硝酸ナトリウムが２．８ｐｐｍ（窒素原子として０．５ｐｐｍ）、リン酸二カリウムが０．３ｐｐｍ（リン原子として０．０５ｐｐｍ）、ＴＥＳ（ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）が通常使用の１／１０００濃度、さらに同一地点で採取した硫酸無添加の海水が１％となるよう添加して、ポリプロピレン製キャップをした後、試料採取時の海水温度にあわせ、海水試料１では２５℃、海水試料２では２０℃に設定したインキュベーター内で暗所静置培養した。培養開始から２４時間ごとにサンプリングし、滅菌した２．５％食塩水で１０倍から１０４倍に希釈して海洋性細菌用寒天培地に各稀釈度ごとに３枚ずつ塗抹して海水試料と同じ温度で培養した。各サンプリング時間ごとに、培養後のコロニー数が一枚あたり３０から３００個の範囲に入っている稀釈度を選び、コロニー数平均から生菌数を計算した。結果を表１に示す。海水試料１では培養２日、３日に最大増殖数４．２×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌ、海水試料２では培養２日に最大増殖数８．４×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌが得られた。いずれの海水試料も培養開始から一週間以内に生菌数の極大値が得られた。
【００２９】比較例１海水試料３に硫酸を３００ｐｐｍとなるように添加してから移送し、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８付近に中和した。中和以後の操作は、全てクリーンベンチ内で行い外来菌の混入を防いだ。孔径０．２μｍの酢酸セルロースメンブレンフィルターを用い、あらかじめ蒸留水２００ｍｌをろ過してメンブレンフィルター上の有機物を除去してから、中和海水２００ｍｌをろ過した。ろ過海水は滅菌した２００ｍｌ容ふらん瓶ユニットに受け、硝酸ナトリウムが２．８ｐｐｍ（窒素原子として０．５ｐｐｍ）、リン酸二カリウムが０．３ｐｐｍ（リン原子として０．０５ｐｐｍ）となるよう添加、さらに同一地点で採取した硫酸無添加の海水を１％添加して、ＢＯＤテスターを使用して２０℃で培養した。培養液はサンプリングを行い、培養開始時の海水と同様にあらかじめフィルター上の有機物を除去したメンブレンフィルターを用いてろ過を行い、ＴＯＣ計で各ＤＯＣを測定した。培養開始時のＤＯＣは１．５３ｐｐｍ、培養開始１週間後に一定となったＤＯＣは１．３６ｐｐｍであり、生物分解性溶存有機炭素（ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＤｉｓｓｏｌｖｅｄＯｒｇａｎｉｃＣａｒｂｏｎ、ＢＤＯＣ）は０．１７ｐｐｍと計算されたが、ＴＯＣ計の精度±０．２ｐｐｍより小さな値であった。
【００３０】比較例２実施例１と同じ方法を用い、海水試料３を長期間培養して生菌数の変化を測定した。測定結果を表２に示す。培養１２日経過後から無機栄養細菌と考えられる微生物が増殖していき、最大増殖数を測定することはできなかった。
【００３１】比較例３実施例１と同じ方法を用い、海水試料４を培養した。ただし窒素、リン、ＴＥＳは添加しなかった。培養開始から２２日後に硝酸ナトリウムが６ｐｐｍ（窒素原子として１ｐｐｍ）、リン酸二カリウムが４ｐｐｍ（リン原子として１ｐｐｍ）となるように添加した。生菌数測定の結果、窒素、リン添加前の培養２２日では１０⁵ｃｆｕ／ｍｌでほぼ一定となっていた生菌数が、さらに増殖を続けて培養３０日では１０⁷ｃｆｕ／ｍｌまで増加し、微生物の最大増殖数は測定することが出来なかった。
【００３２】比較例４海水によるＡＴＰ測定の阻害を見るため、人工海水を１００％、５０％、２０％、１０％、５％、２％、１％の割合で含むＡＴＰ水溶液を用いて、ＡＴＰ測定を行った。結果を表３に示す。海水１０％添加で測定値が７％、１％添加で測定値が４２％と大幅に低下し、海水が混入した場合には、微生物数に比例したＡＴＰ量は測定できないことが判明した。
【００３３】実施例２実施例１と同様の方法で海水試料５を培養し、培養３日後のサンプルを用いてＡＴＰ測定を行った。減圧ろ過用フィルターホルダーに孔径０．２０μｍのポリカーボネートタイプメンブランフィルターと取り付け、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）によりＡＴＰを除去した。海水サンプル５ｍｌをフィルターホルダーに入れ、ＡＴＰ除去試薬５００μｌを添加し、室温で１５分間放置した。海水を減圧ろ過した後、孔径０．２μｍの酢酸セルロースメンブレンフィルターで除菌した後オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）してＡＴＰを除去した３．０％食塩水５ｍｌをフィルターホルダーに入れ、１０分間放置した後、減圧ろ過することによってメンブレンフィルター上に捕捉された微生物を洗浄した。さらに同様にＡＴＰを除去した食塩水の濃度を２．０％、１．０％、０．５％と段階的に低下させながら同様の手順で微生物を洗浄した。次にＡＴＰ抽出試薬５００μｌを添加して５分間放置した後、ＡＴＰを除去した水を５００μｌ加えてから減圧ろ過し、ろ液を回収した。最後にメンブレンフィルター上に残ったＡＴＰを回収するために食塩水と同様の手順でＡＴＰを除去した水１ｍｌをフィルターホルダーに入れ、減圧ろ過し、ろ液を回収することを３回繰り返した。ＡＴＰ抽出以後のろ液はまとめてＡＴＰを測定した。結果は比較例５とまとめて表４に示す。
【００３４】比較例５実施例２と同様の方法で海水試料６の培養３日後のサンプルを用いてＡＴＰ測定を行った。ただし、微生物の洗浄には、ＡＴＰを除去した水のみを用い、洗浄回数を２回とした。結果を表４に示す。実施例２と比較すると、洗浄に水を使用したため、塩濃度の急激な低下により溶菌し、洗浄液にＡＴＰが検出された一方、ＡＴＰ抽出以後のろ液のＡＴＰは１／５０以下に低下し、微生物数に比例したＡＴＰ量は測定することが出来なかった。
【００３５】実施例３実施例１と同様の方法で海水試料７を培養し、培養２日と３日のサンプルのＡＴＰを測定した。ＡＴＰ測定方法は実施例２と同様の方法で行った。ＡＴＰ測定値から海水培養液１ｍｌあたりの菌体内ＡＴＰ濃度を計算した。結果を表５に示す。ＡＴＰ濃度から推定した菌数と生菌数はよい一致を示し、ＡＴＰ測定により生菌数が測定できることが判明した。
【００３６】
【表１】

【００３７】
【表２】

【００３８】
【表３】

【００３９】
【表４】

【００４０】
【表５】

【００４１】
【発明の効果】海水中に存在する細菌を混在状態で培養し、その最大数をコロニー数またはアデノシン三リン酸を指標として測定することで、海水中の微生物増殖ポテンシャルの評価が可能となる。

【出願人】	【識別番号】０００００３１５９【氏名又は名称】東レ株式会社
【出願日】	平成１２年１月１４日（２０００．１．１４）
【代理人】
【公開番号】	特開２００１－１９４３６４（Ｐ２００１－１９４３６４Ａ）
【公開日】	平成１３年７月１９日（２００１．７．１９）
【出願番号】	特願２０００－６９２９（Ｐ２０００－６９２９）